[0001]技术领域
[0002]本申请属于化妆品技术领域，尤其涉及一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶及其制备方法和应用。
[0003]背景技术
[0004]外界刺激(如药物、紫外线和电离辐射)、内源性自由基和活性氧(ROS)会直接或者间接地损伤蛋白质、脂质和DNA等细胞成分，使人体皮肤受损，加速皮肤老化、皱纹产生、暗沉增加。炎症常伴随着氧化应激，人体内的自由基过量导致炎症稳态失衡，而炎症会加速衰老进程，衰老又引起自由基代谢平衡破坏。为了抵御这些不利影响，机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统来缓解细胞所受的损害，如核因子E2相关因子(Nrf2)信号通路和核因子κB(NF-κB)信号通路的调节。Nrf2是抗氧化应激反应的关键性细胞因子，可在同抗氧化反应元件(ARE)发生有效结合后使下游抗氧化基因得以启动：包括超氧化物歧化酶(SOD2、SOD1)、血红素加氧酶(HO-1)、醌氧化还原酶(NQO1)，以及过氧化氢酶(catalase)与氧化应激进行对抗。NF-κB是调节炎症反应重要的转录因子之一，NF-κB信号通路能够抑制SASP即衰老细胞活性分子的分泌，缓解SASP持续分泌所导致的炎症状态，抵御衰老的标志性病理改变的发生。
[0005]申请号为CN2021107649291的现有技术公开了一种皮肤抗衰老组合物的制备方法，所述皮肤抗衰老组合物由半胱氨酸衍生物、核糖、维生素E、肌肽、磷脂酰甘油、泊洛沙姆407、多元醇、余量为去离子水组成。申请号为CN2022112099366的现有技术公开了一种多层保湿修护、除皱抗衰老的牡丹面霜及其制备方法，牡丹面霜由牡丹籽油、乳木果油、霍霍巴籽油、橄榄油、凡士林、维生素E、丁二醇、聚丙烯酸酯交联聚合物-6、中、小分子透明质酸钠、波色因、德肤修、虾青素、香精、环聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷交联聚合物、自乳化单甘脂、16-18醇、硅弹性体凝胶、乙基己基甘油、辛酰羟肟酸、甘油辛酸酯、纳米包裹视黄醇视黄酸酯、类蛇毒肽、三肽-1-四肽-7、Cu肽和水组成。
[0006]综上所述，现有技术中抗衰老原料及护肤品普遍使用单一抗氧化或抗炎作用物质，或使用低含量的植物提取物，或无法清除自由基以从根源处解决皮肤衰老问题。因此，研发从根源上实现抗炎修复、提高靶向性、稳定性等功能的化妆品是很有必要的。
[0007]发明内容
[0008]本申请通过公开一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶及其制备方法与应用，解决技术中抗衰老原料及护肤品大多使用了单一具有抗氧化或抗炎作用的物质，或使用低含量的植物提取物，或无法清除自由基，从根源处解决皮肤衰老的技术问题。
[0009]为了实现上述目的，本申请的第一方面提供了一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶。本申请的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0010]5～20wt％脂质体双层膜流动镶嵌调节剂、1～10wt％双分子层成膜剂、5～20wt％活性成分溶剂、0.1～5wt％紫檀芪、0.1～5wt％环黄芪醇、0.1～5wt％黄芩素、0.1～5wt％槲皮素、1～10wt％可溶性磷酸肽、1～5wt％丹酚酸B、10～30wt％甘油、余量为超纯水。
[0011]在一些实施方案中，所述脂质体双层膜流动镶嵌调节剂为胆甾醇、1,3-丙二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、脱乙酰壳多糖或酵母β-葡聚糖中的至少一种。
[0012]在一些实施方案中，所述双分子层成膜剂为卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化卵磷脂或蛋黄卵磷脂中的至少一种。
[0013]在一些实施方案中，所述活性成分溶剂为PEG-8辛酸甘油三酯、PEG-8癸酸甘油三酯、PEG-40氢化蓖麻油、癸二酸二异丙酯、聚山梨醇酯-20或聚甘油-10硬脂酸酯中的至少一种。
[0014]在一些实施方案中，所述紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素、可溶性磷酸肽、丹酚酸B为天然来源、生物合成来源或化学合成来源。
[0015]本申请的第二方面提供了纳米乳液凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0016]S1：使活性成分溶剂和甘油混合形成混合液后，将紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素和槲皮素超声分散在混合液中，得到A相；
[0017]S2：将脂质体双层膜流动镶嵌调节剂、双分子层成膜剂、可溶性磷酸肽和超纯水混合后，在水浴加热条件下，进行搅拌，得到B相；
[0018]S3：在剪切条件下，将A相加入B相中进行混合均质剪切，得到脂质体初乳；
[0019]S4：将脂质体初乳进行超高压均质处理，冷却至室温得到脂质体乳液；
[0020]S5：常温条件下，将丹酚酸B加入脂质体乳液中，超声助溶后孵育过夜，得到纳米乳液凝胶。
[0021]在一些实施方案中，在步骤S2中，水浴加热温度为40～50℃，搅拌速率为200～500rpm。
[0022]在一些实施方案中，在步骤S3中，剪切转速为5000～8000rpm，剪切温度为40～50℃，剪切时间5～10min。
[0023]在一些实施方案中，在步骤S4中，压力为500～1000bar，温度为40～80℃，循环6～9次；在步骤S5中，超声的功率为80～100w，助溶时间为30～40min，孵育温度为4℃。
[0024]本申请的第三方面提供了本申请所述具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶在化妆品中的应用。
[0025]与现有技术相比，本申请实施例的优点或有益效果至少包括：
[0026]本申请第一方面提供的纳米乳液凝胶，一方面通过特定比例的紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素的复配，可在两条重要的抗衰信号通路Nrf2和NF-κB信号通路中相互协同，共同调控，更全面的增强细胞的抗氧化能力，减轻氧化应激损伤，以达到协同增效的目的。紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素在抗衰机制和功效上有部分重叠，又各有不同；另一方面，本申请的紫檀芪与其他组分的调控效果能够互相补充，抗氧化和抗炎效果比单一提取物或其他复配组合物效果更好，从根源抗炎修复，减少细纹，提升肌肤弹性；第三方面，本申请方法中脂质体双层膜流动镶嵌调节剂能够提供良好的流变特性和耐离子性，改善的脂质体乳液的稳定性，能够有效增加紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素纳米包裹体系在仓储期的稳定性和应用时的功效活性；第四方面，本申请采用水凝胶支架，可以延长给药时间，在真皮层形成药物贮库，提高生物利用度。水凝胶在治疗应用中具有高度生物相容性，可以对活性物直接作用于皮肤的有害影响提供屏蔽效应。水凝胶具有强大的抗氧化活性，可以消除伤口周围过量的ROS，有助于伤口愈合。将包含紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素的脂质体负载于水凝胶网络中，所得到的纳米乳液凝胶具有优异的流变性能、强粘附性，提高了载体稳定性和皮肤的滞留时间，并具有高效的自愈合性能和抗氧化能力。另外，本申请中丹酚酸B(SAB)与可溶性磷酸肽(NapFFKYp，分子1)水溶液结合时会自发形成水凝胶，凝胶的pH约为6.0，与正常人类皮肤的pH非常相似。
[0027]本申请第二方面提供的纳米乳液凝胶的制备方法，一方面，本申请方法制成的纳米包裹体系，可以保护活性成分免受外界环境的影响，同时控制释放速率，增强药物疗效，使药物展现令人满意的治疗效果。自然提取物本身具有药物毒副作用低，耐受性好等诸多优点，将这四种具有协同增效作用的天然化合物组合并制备成纳米包裹体系，可以提高其生物利用度、稳定性以及靶向性。另一方面，本申请方法中利用超声分散技术分散活性物紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素，提高活性物质在介质中的分散性。超声分散利用超声波产生的空化效应来实现固体颗粒在液体中分散，空化效应可以产生高温高压环境，有助于纳米颗粒的形成。超声分散还可以减少颗粒间的结合力，有效防止团聚现象。第三方面，本申请方法中混合均质剪切能够减小物料中分散相的粒径，获得更细小的分散颗粒，提高物料的均匀性和稳定性。超高压均质处理能够制备非常细小和均匀的颗粒，相比传统的高压均质机有更高的压力，可以提供更好的稳定性、改善保存质量、改善均质性、提高吸收质量、节省昂贵的添加剂、改变粘度以及减少反应时间。
[0028]本申请第三方面提供的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶在化妆品中的应用，在美白、抗氧化、抗炎及抗衰类化妆品生产方面具有应用前景。
[0029]附图说明
[0030]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]图1为本申请实施例1-4、对比例1-3制备的纳米乳液凝胶对RAW264.7细胞炎症因子TNF-α和IL-6表达影响的结果图；其中，LPS组与空白组比较####P<0.0001；与LPS组比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.0001；
[0032]图2为本申请实施例1-4、对比例1-3制备的纳米乳液凝胶对改善HaCaT细胞H 2 O 2 氧化损伤作用的结果图；其中，H 2 O 2 组与空白组比较####P<0.0001；与H2O2组比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.0001；
[0033]图3为本申请实施例1-4、对比例1-3制备的纳米乳液凝胶对改善HDF细胞UV损伤作用的结果图；其中，UV组与空白组比较####P<0.0001；与UV组比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，****P<0.0001；
[0034]图4为本申请实施例1-4制备的纳米乳液凝胶鸡胚试验结果图。
[0035]具体实施方式
[0036]下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0037]在本实施例以下描述中，术语“和/或”用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B和同时存在A和B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
[0038]在本实施例以下描述中，术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项(个)”，或，“a，b和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
[0039]在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
[0040]本领域技术人员应当理解，在本申请实施例以下描述中，序号的先后并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
[0041]本领域技术人员应当理解，本申请实施例中的数值范围应理解为还具体公开该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本申请内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0042]除非另有说明，否则本文使用的技术/科学术语具有本申请所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本申请仅描述优选的方法和材料，但在本申请的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0043]本申请的第一方面提供了一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶。本申请的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0044]5～20wt％脂质体双层膜流动镶嵌调节剂、1～10wt％双分子层成膜剂、5～20wt％活性成分溶剂、0.1～5wt％紫檀芪、0.1～5wt％环黄芪醇、0.1～5wt％黄芩素、0.1～5wt％槲皮素、1～10wt％可溶性磷酸肽、1～5wt％丹酚酸B、10～30wt％甘油、余量为超纯水。
[0045]本申请实施例中，所述脂质体双层膜流动镶嵌调节剂为胆甾醇、1,3-丙二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇、脱乙酰壳多糖或酵母β-葡聚糖中的至少一种。
[0046]本申请实施例中，所述双分子层成膜剂为卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化卵磷脂或蛋黄卵磷脂中的至少一种。
[0047]本申请实施例中，所述活性成分溶剂为PEG-8辛酸甘油三酯、PEG-8癸酸甘油三酯、PEG-40氢化蓖麻油、癸二酸二异丙酯、聚山梨醇酯-20或聚甘油-10硬脂酸酯中的至少一种。
[0048]本申请实施例中，所述紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素、可溶性磷酸肽、丹酚酸B为天然来源、生物合成来源或化学合成来源。
[0049]本申请实施例中，所脂质体双层膜流动镶嵌调节剂优选为胆甾醇、脱乙酰壳多糖。所述双分子层成膜剂优选为蛋黄卵磷脂。所述紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素、可溶性磷酸肽、丹酚酸B优选为化学合成来源。
[0050]本申请的第二方面提供了具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0051]S1：使活性成分溶剂和甘油混合形成混合液后，将紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素和槲皮素超声分散在混合液中，得到A相；
[0052]S2：将脂质体双层膜流动镶嵌调节剂、双分子层成膜剂、可溶性磷酸肽和超纯水混合后，在40～50℃水浴加热条件下搅拌，搅拌速率为200～500rpm，得到B相；
[0053]S3：在剪切条件下，将A相加入B相中进行混合均质剪切，剪切转速为5000～8000rpm，剪切温度为40～50℃，剪切时间5～10min，得到脂质体初乳；
[0054]S4：将脂质体初乳进行超高压均质处理，压力为500～1000bar，温度为60～80℃，循环6～9次，冷却至室温得到脂质体乳液；
[0055]S5：常温条件下，将丹酚酸B加入脂质体乳液中，80～100w超声助溶30～40min后置于4℃下孵育过夜，得到纳米乳液凝胶。
[0056]本申请的第三方面提供了本申请所述具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶在化妆品中的应用。
[0057]本申请的第一方面提供了一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶，一方面，将一种包含紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素的组合物进行纳米包裹处理，同时利用丹酚酸B(SAB)与可溶性磷酸肽(NapFFKYp，分子1)水溶液结合时会自发形成水凝胶的特性，制备得一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶。为紫檀芪与三种中药活性物环黄芪醇、黄芩素、槲皮素在功效成分上的合理搭配提供理论与试验基础，在美白、抗氧化、抗炎及抗衰类化妆品生产方面具有应用前景。另一方面，紫檀芪、黄芩素、槲皮素诱导激活Nrf2蛋白，细胞内Nrf2表达量的增加，能够降低NF-κB信号传导通路中NF-κB蛋白的表达。同时，由于环黄芪醇抑制了NF-κB信号传导通路，紫檀芪、黄芩素、槲皮素能够增强这种抑制效果，从而抑制NF-κB转录活性以及细胞凋亡趋势。环黄芪醇激活端粒酶作用靶点，抑制炎性因子白细胞介素-1β的生成，增强了炎症抑制反应的效果。黄芩素、槲皮素能够协同诱导Nrf2激活，与抗氧化剂反应元件(ARE)结合，增强Nrf2下游基因GCLC、GCLM、NQO1的表达，增强细胞的抗氧化能力，减轻过氧化氢诱导的氧化应激损伤。黄芩素可以抑制炎症细胞因子的释放，槲皮素可以诱导HO-l的表达或激活，抑制氧化应激反应。二者通过调节机制的互补，对氧化应激通路进行更加全面的调节。第三方面，脂质体双层膜流动镶嵌调节剂能够提供良好的流变特性和耐离子性，改善的脂质体乳液的稳定性，能够有效增加紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素纳米包裹体系在仓储期的稳定性和应用时的功效活性。
[0058]本申请的第二方面提供了纳米乳液凝胶的制备方法，一方面，利用超声分散技术分散活性物紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素，提高活性物质在介质中的分散性。超声分散利用超声波产生的空化效应来实现固体颗粒在液体中分散，空化效应可以产生高温高压环境，有助于纳米颗粒的形成。超声分散还可以减少颗粒间的结合力，有效防止团聚现象。另一方面，本申请方法中混合均质剪切能够减小物料中分散相的粒径，获得更细小的分散颗粒，提高物料的均匀性和稳定性。超高压均质处理能够制备非常细小和均匀的颗粒，相比传统的高压均质机有更高的压力，可以提供更好的稳定性、改善保存质量、改善均质性、提高吸收质量、节省昂贵的添加剂、改变粘度以及减少反应时间。
[0059]下面将结合具体实施例对本申请的技术方案作进一步地阐述。
[0060]实施例1
[0061]一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0062]3％紫檀芪、2％环黄芪醇、2％黄芩素、2％槲皮素、5％PEG-8辛酸甘油三酯、5％PEG-40氢化蓖麻油、20％甘油、5％氢化卵磷脂、2％蛋黄卵磷脂、1％胆甾醇、4％1,3-丙二醇、3％脱乙酰壳多糖、10％可溶性磷酸肽、4％丹酚酸B、32％超纯水。
[0063]所述紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素、可溶性磷酸肽、丹酚酸B为化学合成来源。
[0064]上述具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0065]S1：按照质量百分比称量各组分，将PEG-8辛酸甘油三酯、PEG-40氢化蓖麻油和甘油混合形成混合液，将紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素和槲皮素在室温下超声30min分散在混合液中，得到A相；
[0066]S2：将氢化卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆甾醇、1,3-丙二醇、脱乙酰壳多糖、可溶性磷酸肽和超纯水混合，在45℃水浴加热条件下，通过400rpm磁力搅拌40min，水浴保温，得到B相；
[0067]S3：在剪切条件下，将A相加入B相中进行混合均质剪切，剪切转速为8000rpm，剪切温度为50℃，剪切时间7min，得到脂质体初乳；
[0068]S4：将脂质体初乳进行超高压均质处理，处理的压力为800bar，温度为70℃，循环8次，冷却至室温得到脂质体乳液；
[0069]S5：常温条件下，将丹酚酸B加入脂质体乳液中，100w超声助溶30min后置于4℃下孵育过夜，得到纳米乳液凝胶。
[0070]实施例2
[0071]一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0072]3％紫檀芪、2％环黄芪醇、2％黄芩素、2％槲皮素、5％聚甘油-10硬脂酸酯、5％聚山梨醇酯-20、20％甘油、5％大豆卵磷脂、2％氢化卵磷脂、1％脱乙酰壳多糖、4％1,2-戊二醇、3％1,2-己二醇、10％可溶性磷酸肽、4％丹酚酸B、32％超纯水。
[0073]所述紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素、可溶性磷酸肽、丹酚酸B为化学合成来源。
[0074]上述具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0075]S1：按照质量百分比称量各组分，将聚甘油-10硬脂酸酯、聚山梨醇酯-20和甘油混合形成混合液，将紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素和槲皮素在室温下超声25min分散在混合液中，得到A相；
[0076]S2：将大豆卵磷脂、氢化卵磷脂、脱乙酰壳多糖、1,2戊二醇、1,2-己二醇、可溶性磷酸肽和超纯水混合，在50℃水浴加热条件下，通过200rpm磁力搅拌30min，水浴保温，得到B相；
[0077]S3：在剪切条件下，将A相加入B相中进行混合均质剪切，剪切转速为6000rpm，剪切温度为40℃，剪切时间10min，得到脂质体初乳；
[0078]S4：将脂质体初乳进行超高压均质处理，处理的压力为600bar，温度为60℃，循环9次，冷却至室温得到脂质体乳液；
[0079]S5：常温条件下，将丹酚酸B加入脂质体乳液中，90w超声助溶40min后置于4℃下孵育过夜，得到纳米乳液凝胶。
[0080]实施例3
[0081]一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0082]5％紫檀芪、0.1％环黄芪醇、5％黄芩素、0.1％槲皮素、5％PEG-8癸酸甘油三酯、30％甘油、10％蛋黄卵磷脂、20％酵母β-葡聚糖、1％可溶性磷酸肽、1％丹酚酸B、22.8％超纯水。
[0083]所述紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素、可溶性磷酸肽、丹酚酸B为天然来源。
[0084]上述具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0085]S1：按照质量百分比称量各组分，将PEG-8癸酸甘油三酯和甘油混合形成混合液，将紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素和槲皮素在室温下超声25min分散在混合液中，得到A相；
[0086]S2：将蛋黄卵磷脂、酵母β-葡聚糖、可溶性磷酸肽和超纯水混合，在40℃水浴加热条件下，通过500rpm磁力搅拌60min，水浴保温，得到B相；
[0087]S3：在剪切条件下，将A相加入B相中进行混合均质剪切，剪切转速为5000rpm，剪切温度为40℃，剪切时间5min，得到脂质体初乳；
[0088]S4：将脂质体初乳进行超高压均质处理，处理的压力为500bar，温度为80℃，循环7次，冷却至室温得到脂质体乳液；
[0089]S5：常温条件下，将丹酚酸B加入脂质体乳液中，80w超声助溶40min后置于4℃下孵育过夜，得到纳米乳液凝胶。
[0090]实施例4
[0091]一种具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0092]0.1％紫檀芪、5％环黄芪醇、0.1％黄芩素、5％槲皮素、20％癸二酸二异丙酯、10％甘油、1％卵磷脂、5％脱乙酰壳多糖、5％可溶性磷酸肽、5％丹酚酸B、43.8％超纯水。
[0093]所述紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素、槲皮素、可溶性磷酸肽、丹酚酸B为生物合成来源。
[0094]上述具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0095]S1：按照质量百分比称量各组分，将癸二酸二异丙酯和甘油混合形成混合液，将紫檀芪、环黄芪醇、黄芩素和槲皮素在室温下超声25min分散在混合液中，得到A相；
[0096]S2：将卵磷脂、脱乙酰壳多糖、可溶性磷酸肽和超纯水混合，在40℃水浴加热条件下，通过500rpm磁力搅拌60min，水浴保温，得到B相；
[0097]S3：在剪切条件下，将A相加入B相中进行混合均质剪切，剪切转速为5000rpm，剪切温度为40℃，剪切时间5min，得到脂质体初乳；
[0098]S4：将脂质体初乳进行超高压均质处理，处理的压力为1000bar，温度为40℃，循环6次，冷却至室温得到脂质体乳液；
[0099]S5：常温条件下，将丹酚酸B加入脂质体乳液中，80w超声助溶40min后置于4℃下孵育过夜，得到纳米乳液凝胶。
[0100]对比例1不含有槲皮素的纳米乳液凝胶
[0101]一种不含有槲皮素的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0102]3％紫檀芪、3％环黄芪醇、3％黄芩素、5％PEG-8辛酸甘油三酯、5％PEG-40氢化蓖麻油、20％甘油、5％氢化卵磷脂、2％蛋黄卵磷脂、1％胆甾醇、4％1,3-丙二醇、3％脱乙酰壳多糖、10％可溶性磷酸肽、4％丹酚酸B、32％超纯水。
[0103]上述不含有槲皮素的纳米乳液凝胶的制备方法及参数与实施例1相同。
[0104]对比例2不含有黄芩素和槲皮素的纳米乳液凝胶
[0105]一种不含有黄芩素和槲皮素的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0106]5％紫檀芪、4％环黄芪醇、5％PEG-8辛酸甘油三酯、5％PEG-40氢化蓖麻油、20％甘油、5％氢化卵磷脂、2％蛋黄卵磷脂、1％胆甾醇、4％1,3-丙二醇、3％脱乙酰壳多糖、10％可溶性磷酸肽、4％丹酚酸B、32％超纯水。
[0107]上述不含有黄芩素和槲皮素的纳米乳液凝胶的制备方法及参数与实施例1相同。
[0108]对比例3不含有环黄芪醇、黄芩素和槲皮素的纳米乳液凝胶
[0109]一种不含有环黄芪醇、黄芩素和槲皮素的纳米乳液凝胶，由如下质量百分比的组分组成：
[0110]9％紫檀芪、5％PEG-8辛酸甘油三酯、5％PEG-40氢化蓖麻油、20％甘油、5％氢化卵磷脂、2％蛋黄卵磷脂、1％胆甾醇、4％1,3-丙二醇、3％脱乙酰壳多糖、10％可溶性磷酸肽、4％丹酚酸B、32％超纯水。
[0111]上述不含有环黄芪醇、黄芩素和槲皮素的纳米乳液凝胶的制备方法及参数与实施例1相同。
[0112]本申请所述具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶在化妆品中的应用性能测试如下：
[0113]试验例1：稳定性考察
[0114]将上述实施例1-4制备得到的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶与对比例1-3制备得到的纳米乳液凝胶分别置于密闭容器中，在-18℃、4℃、室温以及45℃放置180天，于初始状态、90天、180天后，在常温下检查样品外观有无析出或变色发生，并测试样品活性物保留率和粒径。结果见表1。
[0115]表1纳米乳液凝胶的稳定性测试结果
[0116]化妆品在规定或合理可预见的储存和使用条件下，保持其初始性质或性质不随时间改变的能力。表1中的试验结果表明，实施例1-4制备的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶和对比例1-3制备的纳米乳液凝胶在水中分散后都具有稳定性，无团聚或分层现象发生，且实施例1-4所制备的纳米乳液凝胶比对比例1-3制备的纳米乳液凝胶的变化幅度更小，体系更稳定，为最佳实验效果。
[0117]试验例2：对炎症因子表达的影响试验
[0118]取对数生长期RAW264.7细胞接种于24孔板，细胞密度为(2～5)×105个/mL，每孔0.5mL，孵育24h。24h后吸去上清，分别添加以下样品0.5mL：①溶剂对照组：DMEM培养基(2％FBS；1％双抗)作用细胞24h；②LPS炎症模型组:1μg/mL的LPS持续刺激RAW 264.7细胞24h；③测试组：实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3(1％)+LPS(1μg/ml)共同作用细胞24h。样品处理细胞24h后，用移液枪将上清吸到离心管中，1000r/min离心5min，舍去沉淀吸取上清液，用TNF-α和IL-6炎症因子检测试剂盒检测上清液中的炎症因子的变化量，检测方法严格按照检测试剂盒上的说明书。结果见图1。
[0119]由图1可知，LPS组TNF-α和IL-6水平均显著高于正常组，说明炎症诱导模型造模成功。实施例1-4、对比例1-2都能引起RAW 264.7细胞中炎症因子TNF-α水平的显著降低，并且差异具有明显统计学意义(P＜0.01)，且实施例1、实施例2、实施例3、实施例4抑制炎症因子TNF-α的作用效果均优于对比例。实施例1-4、对比例1都能引起RAW 264.7细胞中炎症因子IL-6水平的显著降低，并且差异具有明显统计学意义(P＜0.01)，且实施例1、实施例2、实施例3、实施例4抑制炎症因子IL-6的作用效果均优于对比例。结果表明，实施例1-4所制备的纳米乳液凝胶样品可显著降低细胞炎症因子的表达，并且作用效果均强于对比例1-3。其中实施例1所制备的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶降低炎症因子的表达效果最强。
[0120]试验例3：对人表皮细胞抗氧化的作用试验
[0121]将实施例1-4和对比例1-3分别按照活性物终浓度10μg/ml用DMEM培养基进行稀释，双氧水以DMEM培养基稀释至800μM。将对数生长期的HaCaT细胞按照8×103每孔接种于96孔板，每孔的体系为100μL，96孔板最外圈利用100μL的PBS液封，待细胞贴壁完全后，换成含待测样品的完全培养基，继续培养细胞24h后，CCK-8法检测细胞活性。之后给予双氧水稀释液，于培养箱培养4h造模，4h后立即利用CCK8法检测细胞活性。结果见图2。
[0122]由图2结果可知，双氧水损伤后，未给药的组细胞活力剩41.3％，说明双氧水损伤HaCaT模型建立成功。与空白对照相比，实施例1-4和对比例1所制备的纳米乳液凝胶均可以显著改善氧化损伤的人表皮细胞的活力，差异具有明显统计学意义(P＜0.01)，其中实施例1的抗氧化损伤性能最强，并且实施例1-4的作用效果均优于对比例。该结果显示，实施例1的抗氧化性最好，说明本申请所提供的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶能更好的发挥作用。
[0123]试验例4：抗UV氧化功效实验
[0124]将实施例1-4和对比例1-3分别按照活性物终浓度10μg/mL用DMEM培养基进行稀释。将对数生长期的HDF细胞按照8×103每孔接种于96孔板，每孔的体系为100μL，96孔板最外圈利用100μL的PBS液封，待细胞贴壁完全后，换成含待测样品的完全培养基，继续培养细胞24h后，CCK-8法检测细胞活性。对上述经待测样品稀释液培养24h的细胞给予UV照射5min，于培养箱培养24h后用CCK8法检测细胞活性。结果见图3。
[0125]由图3结果可知，用紫外UVB损伤后，未给药的组细胞活力剩58.7％，UV组细胞活力水平均显著低于正常组，说明UV损伤HaCaT模型建立成功。与空白对照相比，实施例1-4和对比例1所制备的纳米乳液凝胶均可以显著改善UV损伤的人表皮细胞的活力，差异具有明显统计学意义(P＜0.01)。其中实施例1的抗UV损伤性能最强，并且实施例1-4的作用效果均优于对比例。该结果显示，实施例1的抗UV损伤性能最强，说明本申请所提供的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶能更好的发挥作用。
[0126]试验例5：皮肤斑贴试验
[0127]参加试验的人员50人。将实施例1-4、对比例1-3稀释至1％，各取0.02mL放于斑试器小室内，将加有受试物的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的背部或前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。分别于去除受试物斑试器后30min(待压痕消失后)、24h和48h按表1标准观察皮肤反应。并记录观察结果。结果见表3。
[0128]表2反应程度、评分标准及皮肤反应标准
[0129]表3人体斑贴试验结果
[0130]通过斑贴试验观察待测样品(实施例1-4、对比例1-3)是否在局部诱发轻度皮炎，从而判断皮肤是否对所测试的变应原接触过敏。表3中的试验结果表明，实施例1-4、对比例1-3制备的纳米乳液凝胶后涂抹于皮肤后均无红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹现象，说明本申请所提供的具有抗衰及线粒体端粒酶激活作用的纳米乳液凝胶具有极佳的使用安全性。
[0131]试验例6：鸡胚试验
[0132]将孵育9～12天的SPF鸡蛋去除气室位置的蛋壳和内膜后，用移液枪吸取0.3mL待测样品(实施例1、实施例2、实施例3、实施例4)缓慢滴入绒毛尿囊膜(CAM)，观察5min内CAM的反应变化并拍照记录。空白对照为0.9％生理盐水，阳性对照为0.1mol/L氢氧化钠。结果见图4。
[0133]由图4可知，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4于绒毛尿囊膜(CAM)作用5min后，均无出血，无凝血，无血管溶解，终点评价法评分为0分，判断为实施例1、实施例2、实施例3、实施例4均无刺激。
[0134]本说明书中的各个实施方式采用递进的方式描述，各个实施方式之间相同或相似的部分可互相参见，每个实施方式重点说明的都是与其他实施方式的不同之处。
[0135]以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对本申请限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请技术方案的范围。
