专

一种手指矫形器使用状况监测系统

PH1020190053347T

发明人

陈海波, 吴小鹰, 侯文生, 陈琳, 杨丽清

受让人

UNIV CHONGQING

申请人

LANDMARK GRAPHICS CORPORATION

申请号

063149

申请日

2014-03-27

公开(公告)号

PH1020190053347T

公开(公告)日

2018-05-15

IPC分类号

A01B/

CPC分类号

优先权号

10-2010-0129283

优先权日

2010-12-15

摘要

NOVELTY - The method involves arranging a route by utilizing a controller, and setting up a route list based on maximum latency and available bandwidth. A sum of delay time of a full path is requested, and a requirement specification for the available bandwidth and maximum latency is satisfied. Exceeded route is deleted according to the priority of the maximum latency. A signaling protocol part is stored in a database, and a service level agreement (SLA) parameter is processed for producing a label switched path (LSP).

USE - Method for setting up service level agreement (SLA) guaranteed label switched path (LSP) in real time multimedia service of a multi-protocol label switching (MPLS) network of a core network.

ADVANTAGE - The method enables implementation of the multimedia service, guarantees service level agreement (SLA), produces the label switched path (LSP) based on the SLA, improves the quality of service (QoS), and reduces the limitation of the delay time in a multi-protocol label switching (MPLS) network.

DETAILED DESCRIPTION - An INDEPENDENT CLAIM is also included for an apparatus for setting up service level agreement (SLA) guaranteed label switched path (LSP) in real time multimedia service of a multi-protocol label switching (MPLS) network.

DESCRIPTION OF DRAWING(S) - The drawing shows a flowchart of a service level agreement guaranteed label switched path setting up method.'(Drawing includes non-English language text)'

权利要求

1 . A packaged semiconductor device, comprising: at least one semiconductor die having circuitry with circuit nodes coupled to bond pads with bonding features thereon, and a plurality of leads or lead terminals comprising at least metal bars, wherein the plurality of leads or lead terminals are exclusive of any saw marks; wherein the semiconductor die is flipchip attached with a bonded connection between respective ones of the bonding features and respective ones of the plurality of leads or lead terminals.

2 . The packaged semiconductor device of claim 1 , wherein the plurality of leads or lead terminals further comprise at least one passive device having a top side bondable terminal.

3 . The packaged semiconductor device of claim 1 , wherein the bonding features comprise solder comprising features.

4 . The packaged semiconductor device of claim 3 , wherein the solder comprising features comprise solder capped copper pillars.

5 . The packaged semiconductor device of claim 2 , wherein the passive device comprises a surface mount capacitor.

6 . The packaged semiconductor device of claim 5 , wherein the passive device comprises a plurality of the surface mount capacitors.

7 . The packaged semiconductor device of claim 1 , wherein the plurality of leads or lead terminals provide a planarity of ≤0.05 mm.

8 . The packaged semiconductor device of claim 1 , further comprising a mold material for providing encapsulation.

9 . A packaged semiconductor device, comprising: at least one semiconductor die having circuitry with circuit nodes coupled to bond pads with solder features thereon; a plurality of leads or lead terminals comprising metal bars and at least one passive device having a top side bondable terminal, wherein the plurality of leads or lead terminals are exclusive of any saw marks; wherein the semiconductor die is flipchip attached with a bond between respective ones of the solder features and respective ones of the plurality of leads or lead terminals.

10 - 19 . (canceled)

20 . A packaged semiconductor device, comprising: a plurality of pre-singulated leads or lead terminals comprising at least metal bars on a substrate that holds the metal bars in position on the substrate; at least one semiconductor die having circuitry with circuit nodes coupled to bond pads with bonding features thereon; and the semiconductor die bonding features are bonded to the plurality of pre-singulated leads or lead terminals.

21 . The packaged semiconductor device of claim 20 , wherein the substrate comprises a tape.

22 . The packaged semiconductor device of claim 21 , wherein the tape comprises a material that is tolerant of a solder reflow at a temperature of at least 220° C.

23 . The packaged semiconductor device of claim 20 , wherein the bonding features comprise solder capped copper pillars.

24 . The packaged semiconductor device of claim 20 , wherein the plurality of pre-singulated leads or lead terminals further comprise at least one passive device having a top side bondable terminal.

25 . The packaged semiconductor device of claim 24 , wherein the passive device comprises a surface mount capacitor.

26 . The packaged semiconductor device of claim 24 , wherein the passive device comprises a plurality of the surface mount capacitors.

27 . The packaged semiconductor device of claim 20 , wherein the plurality of pre-singulated leads or lead terminals provide a planarity of ≤0.05 mm.

28 . The packaged semiconductor device of claim 21 , wherein the tape is part of a tape and reel apparatus that has an associated computing device having an accessible memory that includes stored information regarding the semiconductor die including a number and a placement of the bond pads.

29 . A packaged semiconductor device, comprising: a plurality of pre-singulated leads or lead terminals comprising at least one metal bar; at least one semiconductor die having circuitry with circuit nodes coupled to bond pads with bonding features thereon; the semiconductor die bonding features are bonded to the plurality of pre-singulated leads or lead terminals; and mold material covering the at least one semiconductor die, bonding features and at least a portion of the plurality of pre-singulated leads or lead terminals.

30 . The packaged semiconductor device of claim 29 , wherein the bonding features comprise solder capped copper pillars.

31 . The packaged semiconductor device of claim 29 , wherein the plurality of pre-singulated leads or lead terminals further comprise at least one passive device having a top side bondable terminal.

32 . The packaged semiconductor device of claim 31 , wherein the passive device comprises a surface mount capacitor.

33 . The packaged semiconductor device of claim 31 , wherein the passive device comprises a plurality of the surface mount capacitors.

34 . The packaged semiconductor device of claim 29 , wherein the plurality of pre-singulated leads or lead terminals provide a planarity of ≤0.05 mm.

说明书

[0001][0001] 본 발명은 딸기 순도검정 및 품종 판별용 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

[0002][0003] 딸기(Fragaria × ananassa Duch.)는 세계적으로 가장 널리 재배되는 베리류 작물이다. 품종 딸기는 8배체 조상인 F. virginiana (Mill.) 및 F. chiloensis (Mill.) 사이에서의 교배로부터 기원하는 이질8배체(2n = 8x = 56) 종들이다. 한국에서의 딸기 생산량은 농림축산식품부의 통계에 따르면 2010년에 십억 달러 이상이다. 과일의 품질, 강도, 향, 기온적응성 및 병충해 저항성(탄저병, 백분병, 시들음병)은 딸기 육종 프로그램에서 중요한 특징들이다. 새로운 딸기 품종을 육종하는 것은 계통의 선택, 우수한 유전형질의 선택 등 다양한 것들이 요구되며, 이러한 형질을 선택하였다 하더라도 유전자형이 8배체의 이형접합형이라 육종이 까다롭다. 딸기는 주로 러너를 통해 클론적으로 증식하고 있으므로 특허된 품종의 잘못된 또는 불법적인 증식이 문제가 되고 있다. 따라서, 품종의 동정 및 구별은 육종가의 권리를 보호할 뿐 아니라 육종 프로그램에서 품종을 선택하는데 있어 매우 중요하다.

[0003][0004] 딸기 품종의 동정은 최초로 아이소자임과 같은 생화학적 마커들을 사용하여 이루어졌다. 최근에는 무작위 증폭 다형 DNA(RAPD), 증폭된 단편길이 다형성(AFLP) 및 내부 단순 반복 염기 서열(inter-simple sequence repeat, ISSR) 마커들과 같은 DNA 마커들이 유전자형을 구별하기 위해 개발되었다. Fragaria sequence 정보의 축적은 단순 서열 반복(SSR) 및 cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)과 같은 더욱 정확한 공동우성(codominant) 마커들을 개발하는데 크게 기여하였다. 이러한 분자적 마커들은 유전적 유사성을 축적하고, 유전적 다양성을 모니터링하고, 연결매핑(linkage mapping), 품종을 식별하는데 사용된다. 최근 몇몇 그룹에서 SSR 마커를 딸기 품종 식별에 많이 사용하고 있다. SSR 마커들은 품종내에 다형성이 다수 존재하고, 전체 게놈에 걸쳐서 분포되어있다. 그러나 이러한 유형의 마커를 사용하는 데에는 딸기의 8배체 특성, allele binning 및 automation과 관련된 단점들이 있다. 또한 SSR 마커들은 DNA 단편의 다양한 다형성으로 인해 구분이 쉽지 않은 경우가 다수 존재한다.

[0004][0005] 최근 몇 년간 선호되는 DNA 마커 유형은 단일 염기 다형성(SNP)에 기초한 것이다. 최근 F. vesca 'Hawaii 4'의 2배체 게놈 서열이 완성되었으며, 이러한 게놈 정보는 SNP를 포함한 마커 개발에 유용한 정보로 이용할 수 있다. SNP는 bi-allelic이고, 게놈에서 매우 자주 나타나고, 가장 중요하게는 멀티플렉스하고 자동화할 수 있다는 점에서 다른 분자 마커에 비해 유리하다.

[0005][0006] SNP를 사용한 품종의 동정은 딸기, 멜론, 와인포도에서 최근 보고되고 있다. 딸기와 같은 8배체 종에서의 고밀도 SNP 마커 플랫폼의 개발은 부분상동염색체 서열 변이(HSVs)의 존재 때문에 매우 복잡하고 어렵다.

[0006][0007] 이러한 배경에서, 본 발명자들은 더욱 정확하고 효율적인 딸기 품종 식별을 위하여 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

[0007][0009] KR 10-2108751B1

[0008][0010] 본 발명의 일 목적은 서열번호 1 내지 96의 염기서열에서 각 염기서열의 일 말단의 200번째 염기에 위치한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 마커로 포함하는 딸기 순도검정 및 품종 판별용 마커 세트를 제공하는 것이다.

[0009][0011] 본 발명의 다른 일 목적은 상기 마커 세트를 포함하는, 딸기 순도검정 및 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

[0010][0012] 본 발명의 다른 일 목적은 딸기로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 딸기 순도검정 및 품종 판별용 마커 세트를 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 얻어진 증폭 산물로부터 상기 딸기의 순도 및 품종을 결정하는 단계를 포함하는 딸기 순도검정 및 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.

[0011][0014] 본 발명의 일 양상은 서열번호 1 내지 96의 염기서열에서 각 염기서열의 일 말단의 200번째 염기에 위치한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 전부를 마커로 포함하는 딸기 순도검정 및 품종 판별용 마커 세트를 제공한다.

[0012][0015] 상기 서열번호 1 내지 96의 염기서열은 다음과 같다:

[0013][0016] SNP Marker Name Flanking sequence 서열번호 FAN-SCF1481 ATTTTATCATTTGATAATATTTGAGGTGACTATTTTAACCCGTGAAACAATTAATGATATTTTTATTATATGTACATTCAAATTTTAGTGTTATTTGTCCTACTATTTTCATCAGGTCAAAATTAAGAATATGATATGCTTCTTTTTCATTTCCTTCAACTGGTGCTGTGTAATTTTGTTACAAAGAAAAGGATCTAGC[T/C]ATCTAGGCATGGTATCAAATTGGGTCGGGTCGACCCTCCTAAAACACATTGGGCACCCTGATGGTCAGCCAACCCACTAAGTCTATTAACACATAGGCCATTGCTGGGTTGGGCCGTTCTATATTTCTTTAGGAGTTTTATTTACGCAAACTAGCTAGTATTCAAGAATCTTGCATTCCAAGCGACTTTTTTTTTTTTTT 1 FAN-SCF1338 CAATAGATTCCACATAATATTCTCTTATCACTTGTTGACTTCTCCATCACTTCTGAACACCGTCCGTCCGATCCTCTCACAAAGCTCACATCGCGTCACACCCAATCCCTTCTCTCACCGACCCAATCTAAAGCAAGGGTAACATAGTCATTGCACCCAGCCCATCAGAATCGACAGAACCAGACCAAAGCTAAAAACA[C/T]CAACCAGCCGCTGACAGCAACTAACCAACCTCTCGAAACGACGTCGTAGTTCCCACCGAGCACGTAAACGACGCCGCTTCTTTTGTCCTCATTC 2 FAN-SCF1608 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[0014][0018] 상기 SNP (단일염기다형성, single nucleotide polymorphism)은 DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또상기 서열번호 1 내지 96의 염기서열은 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)일 수 있고, 상기 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)은 DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 말한다. ‘다형성'이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. "대립유전자"는 한 쌍의 상동염색 체에서 서로 대응하는 부위, 즉 상동하는 유전자자리에 위치하는 대립형질에 대응하는 유전자를 말하며, 같은 염색체 위치 (same chromosomallocus)를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태 (alternative forms) 중 하나를 뜻한다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, CC (A로 표시), CT (H로 표시) 또는 TT (B로 표시)). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있다.

[0015][0019] 구체적으로 상기 단일염기다형성은 각 서열번호 1 내지 96 염기서열의 일 말단으로부터 200번째 염기에 위치하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 각 염기서열의 5’(전단) 또는 3‘(말단) 위치에서부터 200번째 염기에 위치하는 것일 수 있고, 가장 구체적으로는 서열번호 38 및 39는 단일염기다형성이 각 염기서열의 전단으로부터 200번째 위치할 수 있고, 서열번호 10, 26, 47, 57, 60, 61, 62, 74, 83, 84 및 92는 단일염기다형성이 각 염기서열의 말단으로부터 200번째 위치할 수 있으며, 나머지 서열번호들의 염기서열의 경우 400개의 염기서열을 가지고 있어 단일염기다형성이 전단 또는 말단의 위치에서부터 200 번째 염기에 위치하는 것일 수 있다.

[0016][0020] 상기 마커 세트는 딸기 순도 검정 및 품종을 식별하기 위해 이용될 수 있고, 구체적으로, 구별가능한 딸기 품종은 설향, 챈들러, 사치노카, 도요노카 및 베니훗베일 수 있다.

[0017][0021] 상기 마커 세트의 프라이머는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체(analogue), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid) 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

[0018][0022] 본 발명의 일 구체예로서 상기 마커는 검출 가능한 물질로 표지 되어 있을 수 있고, 검출 가능한 물질의 예시로서 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 표지물질일 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 마커의 5' 말단에 표지될 수 있다.

[0019][0023] 상기 마커는 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티 오에이트 등)로의 변형이 있다.

[0020][0025] 본 발명의 다른 일 양상은 상기 조성물을 포함하는, 딸기 순도검정 및 품종 판별용 키트를 제공한다.

[0021][0026] 상기 키트는 딸기 순도검정 및 품종 판별을 위한 공지의 물질을 더 포함할 수 있고, 구체적으로, DNA 중합 효소, dNTP 및 PCR 완충용액을 더 포함할 수 있다. 또한, PCR 반응 또는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분이 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

[0022][0027] 상기 마이크로어레이(microarray)는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 프로브가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것일 수 있다.

[0023][0028] 상기 플루이다임 SNP 분석용 키트는 플루이다임 시스템용 프라이머를 포함할 수 있고, 구체적으로 STA, LSP, 및 ASP 1&2 프라이머를 포함할 수 있다. 플루이다임 SNP 분석용 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 및 PCR 완충 용 액을 더 포함하는 것일 수 있다. DNA 중합효소 및 PCR 완충 용액은 상기 PCR 키트에서 설명한 내용을 참조하여 이해될 수 있다.

[0024][0030] 본 발명의 다른 일 양상은 딸기로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 딸기 순도검정 및 품종 판별용 마커 세트를 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물로부터 상기 딸기의 순도 및 품종을 결정하는 단계를 포함하는 딸기 순도검정 및 품종 판별 방법을 제공한다.

[0025][0031] 상기 게놈 DNA는 상기 딸기의 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 방법을 위해 본 발명자들은 여러 딸기 품종의 잎 조직에서부터 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 게놈 DNA는 식물체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 이용하여 수득 될 수 있다. 상기 게놈 DNA는 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용하여 수득 될 수 있다.

[0026][0032] 상기 핵산을 증폭하는 단계는 딸기로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 딸기 순도검정 및 품종 판별용 마커 세트를 사용하여 증폭하는 단계로서, 상기 핵산의 증폭은 PCR을 이용하여 수행될 수 있다. PCR 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수 있다. PCR 반응은 당업계에 PCR 반응에 필요한 것으로 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응액은 예를 들면, 분석하고자 하는 딸기로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 SNP 프라이머 세트, DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 것일 수 있다.

[0027][0033] 본 발명의 일 구체예로서, 상기 핵산을 증폭하는 단계에서 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 겔 전기영동을 통해 검출할 경우, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 형광 측정을 통해 검출할 경우, 형광 물질로 표지된 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 형광 측정기를 이용하여 형광을 측정할 수 있다.

[0028][0035] 상기 품종을 결정하는 단계는 증폭 산물로부터 상기 딸기의 순도 및 품종을 결정하는 단계이다.

[0029][0036] 본 발명의 일 구체예에서, 상기 증폭 산물로부터 상기 딸기의 순도 및 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, 제1항에 따른 딸기 순도검정 및 품종 판별용 마커 세트에 의해 공지된 딸기 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것일 수 있다.

[0030][0037] 구체적으로, 상기 증폭된 산물로부터 딸기 품종을 결정하는 단계는 자동 염기서열 분석기를 이용하여 증폭 산물 (밴드)의 양을 컴퓨터 프로그램에 의해 확인함으로써 수행되는 것일 수 있다.

[0031][0039] 본 발명의 딸기 순도검정 및 품종 판별용 마커 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 딸기 순도검정 및 품종 판별 방법은 딸기의 순도검정 및 품종 판별을 신속하고 정확하게 판단할 수 있다.

[0032][0041] 도 1은 SNP 마커 (FAN-SCF1625) 활용한 유전자형 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2는 딸기의 5 품종의 8 고정계통에 대한 유전자형 분석 결과를 나타내는 그림이다. 도 3은 본 발명의 마커 세트를 이용하여 설향, 챈들러, 사키노카, 도요노카 및 베이훗베 5 품종의 판별한 결과를 나타내는 도이다.

[0033][0043] 이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[0034][0045] 실시예 1: 재료 및 방법

[0035][0046] 1-1. 시험 재료

[0036][0047] 딸기 품종 설향(대조구), 챈들러, 사치노카, 도요노카 및 베니훗베 5품종과, 챈들러의 S 9 세대 S27-3, S27-10, 사치노카의 S 10 세대 105(P209), P190, 도요노카 S 9 세대 9-1, 50(9-2), 50-2(9-3), 베니훗베의 S 9 세대 8-9 총 8개의 고정계통을 활용하였다.

[0037][0049] 1-2. 딸기 ‘설향’ 및 ‘생가생가나’ 염기서열 분석 및 품종 간 SNP 탐색 및 선발

[0038][0050] CTAB 방법을 이용하여 고순도의 DNA를 분리하였고, DNA 라이브러리를 구축하여 해당 라이브러리를 Illumina Hiseq 2000 장비를 이용하여 2 품종 (설향 및 생가생가나)의 염기서열 분석을 실시하였다.

[0039][0051] SAMtools (0.1.16) 프로그램을 사용하여 raw SNP을 detection하고 consensus sequence를 추출하였다.

[0040][0052] 분석대상 간의 SNP 비교분석을 수행하기 위해 샘플간 통한 SNP matrix를 작성하였으며, 각 샘플을 표준유전체와 비교하여 얻은 raw SNP position을 후보로 하여 리스트를 구축하였다.

[0041][0053] 최종적으로 SNP filtering을 통해 선발조건을 만족하는 SNP를 선발하였다.

[0042][0055] 1-3. HRM (high resolution melting) 분석에 적합한 SNP primer 디자인

[0043][0056] 선발된 SNP는 비교 샘플 간의 다형성 SNP좌를 target으로 하여 HRM용 SNP primer를 개발하였다. primer는 Primer3(v.2.3.5) 프로그램을 사용하여 디자인하였으며, in silico PCR을 수행하여 게놈상에 한 번 관찰되는 primer를 선발하였다.

[0044][0059] 실시예 2: 연구 결과

[0045][0060] 2-1. 딸기 ‘설향’ 및‘생가생가나’의 유전체 염기서열 분석 및 SNP 탐색 및 선발

[0046][0061] 신초에서 DNA를 추출하여 DNA 라이브러리를 구축하여 해당 염기서열을 Illumina Hiseq 2000을 활용하여 분석하였고, 두 품종에 대한 총 553,848,668 reads를 얻었다. 또한 read mapping을 수행하였으며, ‘설향’ 및 ‘생가생가나’ 각각 76.0(약 530 Mbp), 76.5(약 534 Mbp) %의 overall read mapping rate을 보였다.

[0047][0062] 각 샘플의 raw SNP를 이용하여 딸기 품종 간의 통합 SNP matrix를 작성하였다. 필터 기준을 통과한 SNP들은 표준유전체에 mapping된 샘플의 read가 90% 이상으로 동일한 SNP type을 나타내는 경우 homozygous, 40~60%만 동일한 SNP type을 나타내는 경우 heterozygous, homozygous/heterozygousfh type으로 구분할 수 없는 경우 etc.로 구분하였다. SNP는 유전체상의 위치를 확인하기 위해 intergenic- 과 genic (exon, CDS, intron)- region으로 구분하여 분류하였다.

[0048][0063] 딸기 2품종 union SNP matrix에서 동일 SNP좌를 비교하여 두 품종 간 서로 다른 SNP인 경우(polymorphic SNP)와 두 품종 간 서로 동일한 SNP인 경우(non-polymorphic SNP)을 선발하였다. 총 334,319개의 polymorphic SNP와 87,161개의 non-polymorphic SNP가 선발되었으며, 이 중 polymorphic SNP을 target으로 하여 HRM용 SNP primer 총 3,144개을 선발하였다.

[0049][0064] 선발한 3,144개 중 1,857개의 SNP primer를 HRM 분석하였으며, 실제로 다형성을 나타내지 않거나 분석하기 모호한 1,057개의 SNP를 제외하여 최종적으로 800개의 SNP 마커세트를 선발하였다.

[0050][0066] 2-2. 딸기 품종 및 S 9 ~S 10 세대에 SNP 마커세트를 적용하여 효용성 검정

[0051][0067] 개발한 800개의 SNP 프라이머를 딸기 5품종 및 8개의 고정계통에서 다형성이 뚜렷한 SNP priemer를 선발하였다 (도 1). 유전자형 분석 결과 총 96개의 HRM용 SNP primer를 최종 선발하였다(도 2, 표 1).

[0052][0068] 개발된 96개의 딸기 마커세트로 품종 및 고정계통간의 다형성을 보이는 SNP를 선발하고, 이를 통해 고정도 및 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다(도 2, 표 1).

[0053][0069] 분석에 사용된 품종 및 고정계통들의 유전적 다양성을 분석하기 위해 유전적 계통수(Phylogenetic tree, Dendrogram) 분석을 실시하였다. 계통 발생 분석은 인접 결합 방법(neighbor-joining method)을 사용하여 Darwin6 소프트웨어(http://darwin.cirad.fr/)에서 수행하였다. 계통도의 구조는 비가중 인접 결합 방법(unweighted neighbor-joining)에 기반하였고, 부트스트랩(bootstraps)은 1,000 반복(replicates)으로 결정하였다.

[0054][0070] 설향, 챈들러, 사치노카, 도요노카 및 베니훗베 5품종의 경우 품종 판별이 가능했으며, 챈들러 유래의 고정계통인 S27-3과 S27-10는 유전적으로 동일한 양상을 보였다. 또한 도요노카 유리의 고정계통인 9-1와 50-2(9-2)의 경우도 유전적으로 동일한 양상을 보였다(도 3). 같은 원품종 유래에도 불구하고 유전적으로 동일한 양상을 보이지 않는 고정계통의 경우는 초기에 세대 분리가 발생하였거나 계속된 세대진전으로 인해 고정되면서 원품종과 유래계통간에 유전적으로 멀어진 것으로 보여 진다.

[0055][0071] 딸기 5품종 및 8개의 고정계통의 유전적 고정도를 분석하였으며, 대조군인 설향의 경우 83.3 %의 이형접합성(heterozygosity)을 보였으며, 다른 품종의 경우 38.5 ~ 59.4 %의 이형접합성을 보였다. 고정 계통의 경우 품종보다 낮은 이형접합성을 보였으며, 반대로 높은 동형접항성을 보였다 (표 2).

[0056][0073] JPEG 112020136621500-pat00001.jpg 26 136

[0057][0075] 분석 결과 96개의 SNP 마커로 딸기 품종을 모두 판별할 수 있을 것으로 나타났으며 (도 3), 또한 품종 유래의 고정계통의 유전자형을 분석하여 고정도를 확인할 수 있다 (표 2).

[0058][0077] 상기한 결과들은 다음과 같이 요약할 수 있다:

[0059][0078] 국내 주요 품종‘설향’과 이와 유연관계가 먼‘생가생가나’의 어린잎에서 DNA를 추출하여 whole genome resequencing을 진행하였다. 해당 염기서열 분석은 Illumina Hiseq 2000을 활용하였고, 분석된 염기서열 정보를 활용하여 대량의 유용 SNP 3,144개를 확보하였으며, 이 중 High resolution melting (HRM) 분석용 1,857개의 SNP 프라이머 세트를 개발하였다.

[0060][0079] 딸기는 이질배수성 8배체 작물로 유전체 내 상동성 부위가 많아 품종판별 마커 분석에 어려움이 있다. 개발된 마커세트는 이러한 문제점을 해결하고자 sub-genome 상에 1 copy로 존재하는 SNP 프라이머를 선발하였다. 개발된 마커세트는 딸기 순도검정 및 품종 판별이 가능하며, 또한 유전적 거리에 기반한 근연관계 분석 등이 가능하다.

[0061][0080] 최종적으로 800개의 SNP primer가 개발되었으며, 이 중 96개의 마커세트를 활용하여 5개의 품종(설향, 챈들러, 사치노카, 도요노카 및 베니훗베)판별과 각각 품종의 S 9 ~S 10 세대의 8개의 고정계통의 고정도 확인을 통해 마커세트의 효용성을 확인하였다.

[0062][0081] 개발된 SNP 마커세트를 활용하여 딸기 품종을 판별할 수 있고, 고정계통의 순도를 검정하여 고정도를 신속히 판단할 수 있다. 따라서 본 발명은 딸기 품종의 진위성 검정과 품종보호 출원 시 대조 품종의 선정 등 다양한 방면에서 활용될 수 있다.

[0063][0083] 이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

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