[0001][0001] 관련 출원
[0002][0002] 본 출원은 2014년 11월 28일에 접수된 뉴질랜드 특허 출원 번호 702454 및 2015년 3월 27일에 접수된 뉴질랜드 특허 출원 번호 706405의 유익성을 주장하는 바이며, 이들 신청서의 전체적인 내용은 본 문서에 참고문헌으로 포함되었다.
[0003][0003] 발명의 분야
[0004][0004] 본 공개물은 골드 키위( Actinidia chinensis )로 준비된 조성물과 관련이 있다. 또한, 그러한 조성물을 준비하는 방법 및 그러한 조성물을 사용하는 방법(위장계 장애의 치료 또는 예방 방법 포함)과도 관련이 있다.°
[0005][0005] 위장관에는 1000여 가지가 넘는 종 또는 계통형들을 포함하는 약 10 14 개의 미생물 세포가 존재하며, 그 중 대다수는 대장에서 서식한다(Rajilic-Stojanovic 및 de Vosm 2014; Qin 등, 2010; Egert 등, 2006). 대장은 대사상 발효 활성 부위이며, 인간 건강에 필수적인 다양하고 복잡한 미생물 관계가 존재하는 것이 특징이다(Backhed, 등 2005). 실험 데이터에서는 대장 내 미생물총과 그 사람 숙주가 정교한 균형 상태를 이루는 범위가 확인되었다. 미생물총은 면역 기능 및 성숙의 개선, 행동 교정, 포만감 조절, 병원체 억제, 미네랄 흡수 증대 및 에너지 균형 유지를 비롯하여 다양한 건강상 유익성과 관련이 있는 것으로 드러났다(Geurts 등, 2014; Parnell 및 Reimer 2012; Bravo 등, 2011; Buffie 및 Pamer 2013).
[0006][0006] 이러한 숙주-미생물총 상호 의존은 마우스와 제브라피시를 이용한 시험에서 설명된 바 있다. 이 시험에서는 각 고유 미생물총이 다른 종의 무균 표본에 이식되었다. 이 경우, 조성은 고유한 숙주 미생물총 조성과 유사한 조성으로 되돌아가는 것이 확인되었다(Rawls 등, 2006). 식습관, 유전, 연령, 스트레스 또는 생체 이물질로 인한 미생물 군집 조성 내 불균형은 장내세균총불균형을 유도할 수 있으며, 이러한 상태는 질병에 더 민감한 미생물총을 활성화시킬 수 있다. 특정 유형의 식이 성분 섭취가 대장 미생물 군집에 중대한 영향을 미치며, 그 변화는 대개 그러한 성분 섭취 후 24시간 이내에 관찰된다(Wu 등, 2011; Parkar 등, 2012).
[0007][0007] 사람 위장관에서는 Faecalibacterium prausnitzii 가 수적으로 가장 우세한 종 중 하나이며, 대개 건강한 성인의 전체 대장 미생물총 가운데 5% 이상의 비중을 차지하는 것으로 관찰된다(Miquel 등, 2013). 피르미쿠테스 필룸의 구성 요소인 F . prausnitzii 는 체내 항염 속성이 입증된 사람 대장 공생 서식균이다(Sokol 등, 2009; Furet 등, 2010). 낮은 F . prausnitzii 수치는 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome: IBS), 아토피, 당뇨병 및 크론병(Crohn's disease: CD)과 궤양성 대장염(ulcerative colitis: UC) 같은 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases: IBD)을 비롯한 다양한 위장 장애와 반복적으로 관련이 있었다(Sokol 등, 2009; Furet 등, 2010; Rajilic-Stojanovic 등, 2011; Candela 등, 2012; Willing 등, 2010). 이처럼 일관적인 관찰 결과에 따르면 F. prausnitzii 의 농도 결핍은 바람직하지 않은 평가변수이므로 이 박테리아의 증식을 선택적으로 촉진할 수 있는 모든 치료는 중요할 수 있다.
[0008][0008] F. prausnitzii 의 건강 개선 효과가 발휘되는 기전은 낙산염 생산 및 항염 효과에 기인했다. Sokol과 그의 동료들이 수행한 마우스 시험 결과에 의하면 F. prausnitzii 또는 F. prausnitzii 상청액은 화학적으로 유도된 대장염의 중증도를 낮추고 항염 시토카인 합성을 촉진하였으며 전염증성 시토카인 생성을 완화하였다.이는 분비된 대사물에 의해 항염 효과가 매개됨을 시사한다(Sokol 등, 2008). 또한 F. prausnitzii 는 탄수화물 발효를 통해 다량의 낙산염과 더불어 젖산염 및 포름산을 생성한다(Duncan 등, 2002; Duncan 등, 2004).
[0009][0009] 변비는 당뇨병이나 골관절염과 같은 심각한 만성 질환에 뒤지지 않는 질환으로, 개인 삶의 질에 상당한 영향을 미칠 수 있는 흔한 질환이다. 세계 인구의 최대 20%가 이 질환으로 고통받고 있는 것으로 추정되며, 여성 및 65세 이상의 노인 인구가 주로 빈번하게 영향을 받는다(Attaluri et al. 2011; Udani & Bloom 2013). 변비로부터 야기될 수 있는 합병증에는 항문열창, 직장탈출증 및 숙변이 포함된다. 대변을 내보내기 위한 과도한 힘주기는 치질로 이어질 수 있다. 변비 말기에는 복부가 팽창하고 딱딱해지며 산발적인 통증을 동반할 수 있다. 심각한 경우 장폐색 증상(예: 구토 및 복통)이 나타날 수 있으며, 소장에서 나오는 무른 대변이 대장 내 영향을 받은 대변 덩어리를 우회하여 배출되는 변실금 또한 나타날 수 있다.
[0010][0010] 소화관 내 미생물총의 불균형이 장운동을 변화시킬 수 있으며, 결과적으로 변비를 야기할 수 있다는 사실은 잘 알려져 있다(Husebye 등, 2001; Rhee 등, 2001). 이와 더불어, 만성 변비가 있는 환자들은 유익한 박테리아가 상대적으로 감소하고 잠재적인 병원성 박테리아 및 진균이 증가하는 특징을 나타내는 미생물총 불균형을 보인다(Khalif 등, 2005). 이러한 환자들은 E. coli , S. aureus 및 장내세균 수가 상당량 증가한다(Khalif 등, 2005).
[0011][0011] 또한, 만성 변비가 장기간 지속되면 바람직하지 않은 미생물의 수가 더 늘어나고 바람직한 미생물의 수는 더 적어지게 된다(Khalif 등, 2005). 만성 변비 진단을 받은 소아를 대상으로 한 시험에서는 대변에서 장내세균총불균형이 확인되는 것과 더불어 Clostridium , Bacteroides 및 E. coli 수가 유의하게 증가하였다(Zoppi 등, 1998). 어느 시험에서는 변비가 있는 사람의 대변에서 Bifidobacterium 및 Lactobacillus 균주 수가 유의하게 감소한 것이 확인되었다. Bifidobacterium 속의 경우 최대 10배 더 적은 수준까지 감소하였다(Chassard 등, 2012).
[0012][0012] 현재 변비에 대한 중재 방안은 여전히 까다롭고 어려운 것들이며, 많은 환자들이 현재의 요법이나 의약품에 만족하지 못하고 있다. 이러한 방안으로는 과일 및 야채, 섬유소 보충(메틸셀룰로오스, 곤약 글루코만난, 실리움), 수분 섭취 및 운동량 증가와 같은 생활 습관 및 식습관의 교정뿐만 아니라 대변유연제, 자극성 설사제 및 삼투성 설사제를 이용한 약물 중재도 포함된다(Attaluri et al. 2011; Leung et al. 2011; Liu 2011).
[0013][0013] 일상적인 설사제 사용은 환자가 이러한 약물에 의존하게 될 수 있으므로 금기된다. 일종의 기계적 자극을 제공하기 위해 관장제를 사용할 수 있다. 그러나 관장제는 대개 장관이 아닌 직장 내 대변에만 유용하다. 시중에서는 불순물제거에 도움을 주는 것으로 광고되는 다양한 허브 및 기타 천연 제품(알로에 및 루바브 포함(Udani & Bloom 2013))들을 구할 수 있다. 그러나, 변비 완화에 대한 그 효능 및 성공 여부와 관련해서는 일화적 증거만 있는 실정이다.
[0014][0014] 이와 대조적으로, 섬유소는 소화에 중요한 것으로 이미 잘 알려져 있다. 가용성 섬유소는 물을 흡수하여 느린 소화에 도움을 주며, 불용성 섬유소는 대변의 부피를 늘려 불순물제거에 도움을 준다. 또한 효소는 덩어리가 큰 음식 화합물을 처리되기 쉽게 더 작은 조각으로 분해함으로써 소화를 돕는다. 예를 들어, 아밀라제는 탄수화물을 단당으로 분해하고, 프로테아제는 단백질을 아미노산으로 분해한다. 그러나 섬유소 및 효소 보충만으로는 대개 서행성 변비(대장을 통한 대변 이행의 연장된 지연) 및 배변 장애에서 거의 효과를 볼 수 없다. 또한 이러한 보충제들은 과도한 가스 생성 및 복부 팽만감 등의 원치 않는 부작용을 야기할 수 있다.
[0015][0015] 녹색 키위(즉, Actinidia deliciosa 품종 헤이워드)는 현재 그 유효성을 입증하는 몇 건의 연구를 통해 소화 영역에 있어 효과적인 제품으로 주목받아 왔다(Stonehouse et al. 2012). 녹색 키위의 불순물제거 효과는 주로 녹색 키위에 함유된 식이 섬유와 악티니딘(효소)에 기인하는 것으로 보인다는 것이 현재 여론이다(Chang 등, 2010; Rush 등, 2002, Stonehouse 등, 2012, Drummond & Gearry 2013).
[0016][0016] 반면 골드 키위(즉, Actinidia chinensis 품종 Hort16A)는 지금까지 배변과 관련되는 경우가 없었다(Ferguson 2003; Rush 2002). 골드 키위는 녹색 키위와 비교했을 때 악티니딘을 아예/거의 함유하고 있지 않으며 식이 섬유를 덜 함유하고 있는 것으로 알려져 왔다. Hort16A 품종의 키위는 면역 효과에 대해 연구된 바 있으며(Hunter 등,2012; Skinner 2012), 특히 불순물제거의 증가가 바람직하지 않을 수 있는 소아에서는 불순물제거 효과가 낮은 또는 덜한 골드 키위가 면역력을 증가시킬 수 있다는 주장(Adaim 2010)도 있었다.
[0017][0017] 이러한 모집단에서의 위장 장애 발생률을 고려해 보면, 소화 건강의 회복 및 유지를 위해 특히 자연물에서 유래한 새로운 조성물이 제시될 필요가 있다.
[0018][0018] 일 양태에서 본 발명은 골드 키위 조성물을 준비하는 방법으로 구성되며, 그 방법은
[0019][0019] a) Gold3 품종이거나 그 유전적 파생물에 해당하는 골드 키위를 확보하는 단계,
[0020][0020] b) 키위의 껍질을 제거한 뒤 1 mm 미만의 체에 걸러 으깨는 단계, 그리고
[0021][0021] c) 으깬 과일을 건조시켜 분말을 생성하는 과정으로 준비하는 단계를 포함한다.
[0022][0022] 다양한 양태에서는
[0023][0023] 키위를 으깨기 전에 미리 키위 씨를 제거하는 단계가 이 방법에 추가된다.
[0024][0024] 키위를 으깰 때 으깬 과일의 브릭스 값이 16-21°가 되도록 하는 단계가 이 방법에 추가된다.
[0025][0025] 키위를 으깰 때 브릭스 값 12.5° 및 온도 20℃ 조건 하에 측정한 으깬 과일의 점도가 11.0-13.0 또는 10.0-14.0이 되도록 하는 단계가 이 방법에 추가된다.
[0026][0026] 으깬 과일을 동결 건조시키고 제분하여 분말을 생성하는 단계가 이 방법에 추가된다.
[0027][0027] 조성물의 폴리페놀을 강화하는 단계가 이 방법에 추가된다.
[0028][0028] 조성물에 폴리페놀을 추가하는 단계가 이 방법에 추가된다.
[0029][0029] 으깬 과일을 24-56시간 동안 건조하는 단계가 이 방법에 추가된다.
[0030][0030] 으깬 과일을 40-56시간 동안 동결 건조시키는 단계가 이 방법에 추가된다.
[0031][0031] 또 다른 양태에서 본 발명은 건조된 골드 키위로 준비한 조성물로 구성되며, 이 때 건조된 골드 키위는 Gold3 키위 또는 그 유전적 파생물이다. 분말은 상기 양태들 중 어느 한 가지 방법으로든 제조될 수 있다.
[0032][0032] 다양한 양태에서는
[0033][0033] 조성물이 장관 투여용으로 조제된다.
[0034][0034] 조성물이 경구 투여용으로 조제된다.
[0035][0035] 조성물이 정제 또는 캡슐로서 조제된다.
[0036][0036] 캡슐이 겔 캡슐이다.
[0037][0037] 조성물이 정제 또는 캡슐이 400-800 mg의 분말을 포함하도록 조제된다.
[0038][0038] 그렇지 않다면, 캡슐이 100-1000 mg의 분말을 포함하도록 조제된다.
[0039][0039] 조성물이 액상으로서 조제된다.
[0040][0040] 액상이 용량 단위당 400-800 mg의 분말을 포함하도록 조제된다.
[0041][0041] 조성물이 젤리 또는 포(sachet)로서 조제된다.
[0042][0042] 조성물이 추가적인 소화 보조제와 조합하여 조제된다.
[0043][0043] 조성물이 프리바이오틱, 프로바이오틱 또는 신바이오틱 조성물 중 한 가지 이상의 조성물과 조합하여 조제된다.
[0044][0044] 조성물이 섬유소 및/또는 소화 효소와 조합하여 조제된다.
[0045][0045] 조성물에 폴리페놀이 보충된다.
[0046][0046] 또 다른 일 양태에서는 본 발명이 변비를 치료 또는 예방하거나 배변 활동의 규칙성을 유지 또는 개선하는 방법으로 구성되며, 이 방법은
[0047][0047] 시험대상자에게 상기 양태 중 어느 한 가지의 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 변비를 치료 또는 예방하거나 배변 규칙성을 유지 또는 개선하는 단계를 포함한다.
[0048][0048] 다양한 양태에서는
[0049][0049] 조성물이 장으로 투여된다.
[0050][0050] 조성물이 경구 또는 직장으로 투여된다.
[0051][0051] 조성물이 정제, 캡슐 또는 액상으로서 투여된다.
[0052][0052] 조성물이 젤리 또는 포(sachet)로서 투여된다.
[0053][0053] 캡슐이 겔 캡슐이다.
[0054][0054] 조성물이 1일 2000-4000 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0055][0055] 아니면 250-2500 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0056][0056] 조성물이 추가적인 소화 보조제와 병용투여된다.
[0057][0057] 조성물이 프리바이오틱, 프로바이오틱 또는 신바이오틱 조성물 중 한 가지 이상의 조성물과 병용투여된다.
[0058][0058] 조성물이 섬유소 및/또는 소화 효소와 병용투여된다.
[0059][0059] 조성물에 폴리페놀이 보충된다.
[0060][0060] 또 다른 일 양태에서 본 발명은 소화관 내 미생물 불균형을 치료 또는 예방하는 방법으로 구성되며, 이 방법은
[0061][0061] 시험대상자에게 상기 양태 중 어느 한 가지의 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 미생물총 불균형을 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.
[0062][0062] 다양한 양태에서는
[0063][0063] 조성물이 장으로 투여된다.
[0064][0064] 조성물이 경구 또는 직장으로 투여된다.
[0065][0065] 조성물이 정제, 캡슐 또는 액상으로서 투여된다.
[0066][0066] 조성물이 젤리 또는 포(sachet)로서 투여된다.
[0067][0067] 캡슐이 겔 캡슐이다.
[0068][0068] 조성물이 1일 2000-4000 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0069][0069] 아니면 250-2500 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0070][0070] 조성물이 추가적인 소화 보조제와 병용투여된다.
[0071][0071] 조성물이 프리바이오틱, 프로바이오틱 또는 신바이오틱 조성물 중 한 가지 이상의 조성물과 병용투여된다.
[0072][0072] 조성물이 섬유소 및/또는 소화 효소와 병용투여된다.
[0073][0073] 조성물에 폴리페놀이 보충된다.
[0074][0074] 또 다른 일 양태에서 본 발명은 소화관 내 유익한 박테리아를 유지 또는 증가시키는 방법으로 구성되며, 이 방법은
[0075][0075] 시험대상자에게 상기 양태 중 어느 한 가지의 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 소화관 내 유익한 박테리아를 유지 또는 증가시키는 단계를 포함된다.
[0076][0076] 다양한 양태에서는
[0077][0077] 조성물이 장으로 투여된다.
[0078][0078] 조성물이 경구 또는 직장으로 투여된다.
[0079][0079] 조성물이 정제, 캡슐 또는 액상으로서 투여된다.
[0080][0080] 조성물이 젤리 또는 포(sachet)로서 투여된다.
[0081][0081] 캡슐이 겔 캡슐이다.
[0082][0082] 조성물이 1일 2000-4000 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0083][0083] 아니면 250-2500 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0084][0084] 조성물이 추가적인 소화 보조제와 병용투여된다.
[0085][0085] 조성물이 프리바이오틱, 프로바이오틱 또는 신바이오틱 조성물 중 한 가지 이상의 조성물과 병용투여된다.
[0086][0086] 조성물이 섬유소 및/또는 소화 효소와 병용투여된다.
[0087][0087] 조성물에 폴리페놀이 보충된다.
[0088][0088] 유익한 박테리아가 Bacteroides - Prevotella - Porphyromonas , Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. 군 및 Lachnospiraceae 군에서 선택된다.
[0089][0089] 유익한 박테리아가 Faecalibacterium prausnitzii , Clostridium coccoides , Bacteriodes fragilis , Bacteroides thetaiotaomicron , Bacteroides ovatus , Bacteroides cellulosilyticus , Roseburia intestinalis , Roseburia inulinovorans , Ruminococcus bromii 및 Ruminococcus flavefaciens 에서 선택된다
[0090][0090] 또 다른 일 양태에서 본 발명은 소화관 내 Faecalibacterium prausnitzii 를 유지 또는 증가시키는 방법으로 구성되며, 이 방법은
[0091][0091] 험대상자에게 상기 양태 중 어느 한 가지의 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 소화관 내 Faecalibacterium prausnitzii 를 유지 또는 증가시키는 단계를 포함한다.
[0092][0092] 다양한 양태에서는
[0093][0093] 조성물이 장관, 경구 또는 직장 투여 방법을 통해 투여된다.
[0094][0094] 조성물이 정제, 캡슐, 액상, 젤리 또는 포(sachet) 중 한 가지 이상으로서 투여된다.
[0095][0095] 캡슐이 겔 캡슐이다.
[0096][0096] 조성물이 1일 2000-4000 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0097][0097] 조성물이 1일 250-2500 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0098][0098] 조성물이 추가적인 소화 보조제와 병용투여된다.
[0099][0099] 조성물이 프리바이오틱, 프로바이오틱 또는 신바이오틱 조성물 중 한 가지 이상의 조성물과 병용투여된다.
[0100][0100] 조성물이 섬유소 및/또는 소화 효소와 병용투여된다.
[0101][0101] 조성물에 폴리페놀이 보충된다.
[0102][0102] 시험대상자에게 한 가지 이상의 염증 증상이 있다.
[0103][0103] 시험대상자에게 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환, 위장암, 알레르기, 아토피 또는 당뇨병 증상 중 한 가지 이상의 증상이 있다.
[0104][0104] 또 다른 일 양태에서 본 발명은 과민성 대장 증후군 또는 염증성 장질환을 치료 또는 예방하는 방법으로 구성되며, 이 방법은
[0105][0105] 시험대상자에게 상기 양태 중 어느 한 가지의 조성물을 투여함으로써 시험대상자의 과민성 대장 증후군 또는 염증성 장질환을 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.
[0106][0106] 다양한 양태에서는
[0107][0107] 조성물이 장관, 경구 또는 직장 투여 방법을 통해 투여된다.
[0108][0108] 조성물이 정제, 캡슐, 액상, 젤리 또는 포(sachet) 중 한 가지 이상으로서 투여된다.
[0109][0109] 캡슐이 겔 캡슐이다.
[0110][0110] 조성물이 1일 2000-4000 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0111][0111] 조성물이 1일 250-2500 mg 용량의 분말로 투여되거나 그 동량의 액상으로 투여된다.
[0112][0112] 조성물이 추가적인 소화 보조제와 병용투여된다.
[0113][0113] 조성물이 프리바이오틱, 프로바이오틱 또는 신바이오틱 조성물 중 한 가지 이상의 조성물과 병용투여된다.
[0114][0114] 조성물이 섬유소 및/또는 소화 효소와 병용투여된다.
[0115][0115] 조성물에 폴리페놀이 보충된다.
[0116][0116] 그 외의 추가적인 양태들에서 본 발명은 약제를 조제하기 위해 상기 양태 중 어느 한 가지의 조성물을 사용하는 단계가 포함되며, 그 용도는
[0117][0117] (i) 시험대상자의 변비를 치료 또는 예방하거나 배변 활동의 규칙성을 유지 또는 개선하는 용도,
[0118][0118] (ii) 시험대상자의 미생물총 불균형을 치료 또는 예방하는 용도,
[0119][0119] (iii) 시험대상자의 소화관 내 유익한 박테리아를 유지하거나 증가시키는 용도,
[0120][0120] (iv) 시험대상자의 소화관 내 Faecalibacterium prausnitzii 를 유지하거나 증가시키는 용도, 또는
[0121][0121] (v) 시험대상자의 과민성 대장 증후군 또는 염증성 장질환을 치료 또는 예방하는 용도이다.
[0122][0122] 상기의 간단한 요약은 본 발명의 특정 실시예의 특징과 기술적 이점을 포괄적으로 설명한 것이다. 추가적인 기술적 장점은 발명의 상세한 설명 및 예를 통해 아래에서 자세히 기술된다.
[0123][0123] 본 발명의 특성으로 여겨지는 새로운 기능들은 발명의 상세한 설명에서 함께 제시되는 모든 도면 및 예와 연관지어 고려할 때 더욱 잘 이해될 것이다. 그러나 이 문서에 제시된 도면과 사례들은 발명의 설명을 돕거나 발명에 대한 이해를 증진시키기 위해 제공된 것이며, 발명의 범위를 제한하지 않는다.
[0124][0124] 도 1: 녹색(헤이워드) 및 골드(Gold3) 키위 분말 소화 전후 폴리페놀 함량. 도 2: 소화된 골드(Gold3) 키위 분말의 수분 및 DMSO 추출물에 노출 시, 박테리아 균주의 증식 변화. 도 3: 혼합 발효 모델 사용 시 골드(Gold3) 키위 분말이 시험관 내 짧은 사슬 지방산에 미치는 영향. 도 4: 시험 치료, 약물제거 및 샘플링 지점 도식. 도 5a: 기능성 변비가 있는 참여자의 골드(Gold3) 치료 후 소화 건강 지수의 개선. 도 5b: 기능성 변비가 있는 참여자의 골드(Gold3) 치료 후 Faecalibacterium prausnitzii 풍도의 순차. 5c: 기능성 변비가 있는 참여자의 골드(Gold3) 치료 후 Faecalibacterium prausnitzii 수치 순차를 나타내는 정량적 PCR 데이터(로그 변환). 도 6: 건강한 시험군의 치료 기간 전후 박테리아군별로 계산된 평균 16S rRNA 유전자 복제 수/대변 샘플 그램(상단 행 로그 변환, 하단 행 자연 데이터)과 평균의 표준 오차(SEM)(오차 바(error bar)로 표시)를 나타낸 LightCycler® 480 qPCR 데이터. 도 7: 기능성 변비군의 치료 기간 전후 박테리아군별로 계산된 평균 16S rRNA 유전자 복제 수/대변 샘플 그램(상단 행 로그 변환, 하단 행 자연 데이터)과 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸 LightCycler® 480 qPCR 데이터.
[0125][0125] 발명의 상세한 설명
[0126][0126] 다음 설명에는 수많은 예시적 구성이나 파라미터 등이 제시되어 있다. 그러나 이러한 설명은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아닌, 예시적인 실시예로서 제공된 것임을 유념해야 한다.
[0127][0127] 특허 및 특허 출원을 비롯하여 본 설명에서 언급된 모든 참고문헌은 본 문서에 참고문헌으로 통합되어 있다. 참고문헌 중 어떠한 것이든 선행 기술로 간주되지 않는다. 또한 참고문헌에 대한 어떠한 논의도 그러한 참고문헌이 뉴질랜드 또는 기타 국가 내 당업계에서 공통적이고 일반적인 지식의 일부를 구성하는 것으로 간주되지 않는다.
[0128][0128] 정의
[0129][0129] 여기에 제시되는 설명, 실시예 및 본 발명의 예의 각 경우에서 사용되는 "구성", "포함" 등의 용어는 제한 없이 포괄적으로 해석되어야 한다. 따라서 설명 및 청구항 전반에 걸쳐서, "구성한다", "구성하는" 및 이와 유사한 단어들은 해당 문맥에서 달리 명시적으로 요구하지 않는 한, 배타적 의미로 해석되지 않고 포괄적인 의미, 즉, "다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다"는 개념으로 해석되어야 한다.
[0130][0130] "배변 활동의 규칙성"이란 일간 또는 주간 기준으로 규칙적인 배변 활동이 있음을 의미한다. 규칙성의 기준은 사람마다 다르지만, 배변 활동의 예상 횟수 범위는 최소 주 4회 이상에서 최소 하루 한 번 이상이 될 수 있다. 규칙성의 "개선"이란 일주일간 최소 한 번 이상 배변 활동이 늘어난 것을 의미한다.
[0131][0131] "배변 활동의 불규칙성"이란 배변 활동의 규칙성이 저하되었음을 의미한다. 이는 예를 들어 배변 활동 간격이 길어지거나 일일 또는 주당 배변 활동 예상 횟수가 감소한 경우를 의미할 수 있다. 예를 들어, 일주일당 배변 활동이 최소 일회 이상 줄었다면 배변 활동의 불규칙성에 해당할 수 있다.
[0132][0132] 여기에서 사용된 "변비"는 변비 상태의 증상 중 한 가지 이상(예: 배변 활동 중 과도한 힘주기, 딱딱하거나 덩어리진 대변, 항문에 장애물이 있거나 막힌 느낌, 불완전한 배변감, 원활한 배변 활동을 위해 손을 사용한 작업, 또는 일주일당 3회 이하의 배변 활동 중 한 가지 이상)이 있음을 의미한다.
[0133][0133] "식이 보조제"란 소화 또는 소화계통의 기타 측면에 도움이 되는 조성물(예: 가용성 및 불용성 섬유소, 소화 효소, 프로바이오틱스, 프리바이오틱스 및 신바이오틱스)이다. 소화 보조제에는 실리움, 메틸셀룰로오스, 글루코만난, 마그네슘, 아마인, 밀싹, 생강, 알로에(예: 알로에베라 주스) 및 루바브 중 한 가지 이상으로 구성된 조성물이 포함된다.
[0134][0134] "소화 효소"는 위장계통의 기능에 도움이 되는 효소이다. 여기에는 악티니딘, 아밀라제, 프로테아제, 리파제, 락타제, 말타제, 수크라제 및 셀룰라제가 포함된다.
[0135][0135] "소화관" 및 "장"은 사람 또는 기타 동물의 소화계통(즉, 위장계통)를 일컫는다. 여기에는 식도, 위, 소장(십이지장, 공장, 회장), 대장(맹장, 상행결장, 횡행결장, 하행결장, S상결장, 직장)이 포함된다. "장"은 장관의 동의어이다.
[0136][0136] 소화관 "장애"에는 소화계통(즉, 위장계통)에 영향을 미치는 질환 또는 기타 상태가 포함되며, 이는 염증, 변비, 배변 활동의 불규칙성, 미생물총 불균형(예: 유익한 유기체 수치 감소, 유익한 유기체 비율 변화 및/또는 유해한 유기체 수치 증가) 등의 급성 또는 만성 상태일 수 있다. 특정 장애로는 염증성 장 질환 및 과민성 대장 증후군이 포함된다. 기타 장애는 여기에서 상세히 설명된다.
[0137][0137] "Gold3"은 골드 키위의 특정한 품종을 일컫는 말로, ZESPRI® SUNGOLD 키위로 출시되고 있으며 'Zesy002'로도 알려져 있다. Gold3에 대해서는 2009년 6월 25일에 뉴질랜드 식물 품종 권리 신청이 신청서 번호 KIW042로 접수되었다. Gold3 골드 키위의 학명은 Actinidia chinensis Planch 이다.
[0138][0138] 골드 키위 품종(예: Gold3 품종)의 "유전적 파생물"은 골드 키위 부모계에서 얻은 자손, 변이종 또는 기타 재배품종을 일컫는다. 여기에는 골드 키위 부모와의 유전 교차로 얻은 자손(예: F1 자손 또는 F2 자손)이 포함된다. "유전적 파생물"이라는 용어는 유래 식물 그 자체, 또는 그 식물의 과실을 지칭할 수 있다.
[0139][0139] "염증"은 혈관확장, 열, 발적, 통증, 부기, 부종, 병변, 열창, 궤양, 백혈구 혈관외유출 및 기능 상실 중 한 가지 이상을 특징으로 하는 상태를 일컫는다. 여기에는 급성 및 만성 형태의 염증이 모두 포함되며, 만성 염증의 경우 염증성 장애(예: 자가면역질환)가 포함된다. 특히 염증성 장 질환이 포함된다. 기타 염증성 장애는 본 문서의 다른 곳에 설명되어 있다.
[0140][0140] 여기에서 언급되는 바와 같이, "lyophilising"과 "freeze drying"은 동결 건조라는 동일한 의미로 사용된다. "동결 건조"(freeze drying/lyophilising)라는 용어는 더 높은 온도의 사용(즉, 동결 온도보다 높은 온도)의 사용을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 동결 건조(lyophilisation/freeze drying) 절차의 이차 건조 단계 중 잔여 수분을 제거하기 위해 더 높은 온도가 사용될 수 있다.
[0141][0141] 여기에서 사용되는 "미생물총"은 사람 및 기타 동물의 소화관에 기생하는 미생물 무리를 일컫는다. 동의어로는 "미생물무리"와 "미생물군유전체"가 있다.
[0142][0142] "미생물총 불균형"("장내세균총불균형"으로도 칭함)은 소화계통 내 유익한 유기체 수의 감소, 유익한 유기체 중 한 가지 이상의 비율 변화 및/또는 소화계통 내 유해한 유기체 수의 증가가 발생하는 상태이다. 유익한 유기체의 예로는 젖산 생산 박테리아와 낙산염 생산 박테리아가 포함될 수 있다 . 특히 유익한 세균에는 Bifidobacterium 균주, Bacteriodes fragilis 와 같은 Bacteroidaceae 균주, 그리고 Faecalibacterium prausnitzii 를 비롯한 Clostridium leptum 계통군의 유익한 박테리아와 같은 대변 내 박테리아가 포함되며 이에 국한되지 않는다. Clostridium coccoides , Bacteroides thetaiotaomicron , Bacteroides ovatus , Bacteroides cellulosilyticus , Roseburia intestinalis , Roseburia inulinovorans , Ruminococcus bromii 및 Ruminococcus flavefaciens 또한 포함된다. Bacteroides -Prevotella-Porphyromonas , Lachnospiraceae 및 Lactobacilli 군에 속하는 유익한 유기체들도 포함된다. 유해한 유기체의 예로는 Staphylococcus 및 Salmonella 균주와 더불어 Enterobacteriaceae , Pasteurellacaea , Veillonellaceae 및 Fusobacteriaceae 에 속하는 균주가 포함될 수 있으며 이에 국한되지 않는다.
[0143][0143] "프리바이오틱"은 소화계통 내 유익한 유기체의 수 및/또는 활동도를 증가시키는 조성물이다. 프리바이오틱은 대개 발효성 성분으로 구성되며, 위장 미생물총 중 유익한 박테리아 집단의 긍정적 변화(예: 수, 활동도 및 비율 향상)를 야기한다. 그 예로는 젖산 생산 박테리아 및/또는 낙산염 생산 박테리아가 포함된다. 유익한 세균의 구체적인 예로는 Bifidobacterium 균주, 그리고 Faecalibacterium prausnitzii 를 비롯한 Faecalibacterium 균주와 더불어 Bacteriodes fragilis 와 같은 Bacteroidaceae 균주 또한 포함된다. Clostridium coccoides , Bacteroides thetaiotaomicron , Bacteroides ovatus , Bacteroides cellulosilyticus , Roseburia intestinalis , Roseburia inulinovorans , Ruminococcus bromii 및 Ruminococcus flavefaciens 또한 포함된다. 그 외에도 Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas , Lachnospiraceae 및 Lactobacilli 와 더불어 여기에서 설명되는 기타 유기체들이 포함된다.
[0144][0144] "프로바이오틱"은 대장을 포함하는 소화계통에서 대량 서식하는 젖산 생산 박테리아 및/또는 낙산염 생산 박테리아와 같은 유익한 유기체 중 한 가지 이상으로 구성된 조성물이다. 특히 유익한 세균에는 Bifidobacterium 균주, Faecalibacterium prausnitzii 를 포함하는 Faecalibacterium 균주, 그리고 Bacteriodes fragilis 와 같은 Bacteroidaceae 균주와 더불어 이 문서에 설명된 기타 유기체들이 포함된다.
[0145][0145] "신바이오틱"이란 한 가지 이상의 프리바이오틱 제제와 한 가지 이상의 프로바이오틱 유기체가 결합된 조성물이다.
[0146][0146] 여기에서 사용되는 "시험대상자"는 사람이나 특히 소, 양, 염소, 돼지, 말 등의 가축과 개, 고양이 및 기타 애완용 동물을 포함하는 비인간 포유류일 수 있다.
[0147][0147] 여기에서 사용되는 "치료"는 예를 들어 위장 장애(위장계통의 질환 또는 기타 상태 등)를 축소, 개선 또는 해소하는 것을 의미한다. 치료는 장애 증상 중 한 가지 이상을 축소, 개선 또는 제거한다.
[0148][0148] 여기에서 사용되는 "예방"은 예를 들어 위장 장애(위장계통의 질환 또는 기타 상태 등)와 같은 장애의 발생을 방지 또는 지연시키는 것을 의미한다. 예방 조치는 장애의 증상 중 한 가지 이상을 방지 또는 지연시키거나, 그러한 증상이 발생한 경우 이를 완화한다.
[0149][0149] 골드 키위 및 관련 대생물 작용
[0150][0150] Gold3는 Zespri®에서 개발한 새로운 골드 키위 품종으로서, Pseudomonas syringae pv actinidiae (Psa, 세균성 키위 덩굴 질환)에 내성이 있는 것으로 확인되었으며, 뉴질랜드에서 Hort16A 품종을 대체하는 새로운 상업용 골드 키위 품종으로 자리잡고 있다. Gold3 품종 키위는 영양 조성 측면에서 이전 품종과 유사하며, 녹색 키위보다 악티니딘 및 식이 섬유 함량이 적다(표 1).
[0151][0151] TIFF 112017061777213-pct00001.tif 196 131
[0152][0152] 녹색 키위의 불순물제거 효과를 일차적으로 담당하는 것으로 간주되는 성분인 섬유소와 악티니딘이 골드 키위 품종에 소량으로 함유되어 있다는 점을 고려할 때, 골드 키위 유래 제품은 녹색 헤이워드 키위 유래 제품보다 불순물제거 효과가 낮을 것으로 예상될 수 있다.
[0153][0153] 놀라운 것은, 발명가들이 발견한 바에 따르면 Gold3 키위 유래 분말(GOLD)은 건강한 사람들에서 녹색 헤이워드 키위 유래 분말(ACTAZIN™)과 동일한 수준의 불순물제거 효과를 나타낸다는 점이다(아래의 예 5 및 6 참조). 이러한 결과는 Gold3 분말에 존재하는 다른 키위 생리활성 성분들이 불순물제거 효과 관찰값에 미치는 영향이 현재 알려져 있는 것보다 더 클 수 있음을 시사한다. 따라서 이러한 조성물은 배변 활동의 규칙성을 유지하거나 개선하고, 또는 변비를 치료하거나 예방하는 데 도움을 준다.
[0154][0154] 이론에 얽매이지 않는 범위에서, 폴리페놀은 특히 Gold3 키위 품종을 포함한 골드 키위 품종들에서 주요 활성 성분일 수 있다고 가정된다. 가정에 따르며, 불순물제거 효과 관찰값은 과일에 함유된 섬유소, 효소, 프리바이오틱 탄수화물 및 폴리페놀 조합에 기인할 수 있다.
[0155][0155] 폴리페놀은 식물에서 자연적으로 발생하는 화합물로, 한 개 이상의 페놀 단위가 존재하는 것이 특징이다. 유익한 박테리아의 증식을 촉진하고, 박테리아가 폴리페놀을 다른 생리활성 화합물로 변환시켜 이 화합물이 혈류로 흡수되면서 장과 그 외 신체 부위에서 효과를 발휘하도록 한다면, 적어도 어느 정도는 폴리페놀의 건강상 유익성이 발생된다고 여겨진다(Seeram 2014; Cardona 등, 2013).
[0156][0156] 페놀류가 장 미생물에 의해 저분자량 대사물로 대사되는 장에서는 총 폴리페놀 섭취량 누적값은 90%에서 95%로 추정된다. 이러한 대사물들은 흡수 가능하며 폴리페놀의 건강상 효과에 대한 관찰값에 기여할 수 있다(Cardona 등, 2013).
[0157][0157] 여기에 제시된 결과에 기반할 때, 발명가들은 Gold3 또는 그 파생상품과 같은 골드 키위 품종의 폴리페놀이 프리바이오틱으로서의 역할을 수행할 능력을 지녔을 수도 있다고 여긴다. 해당 분야의 연구자들은 프리바이오틱스를 "선택적으로 발효된 성분으로서, 위장 미생물총의 조성 및/또는 활성에 특이적인 변화를 유발하고 그에 따라 숙주 건강에 유익성을 제공한다"고 설명한 바 있다(Gibson 등, 2010).
[0158][0158] 주목할 점은 골드 키위가 녹색 키위보다 폴리페놀 함유량이 높다는 것이다(예를 들어 Drummond 2013 참조; 또한 여기에 제시된 표 5 참조). 게다가 발명가들의 시험관 내 시험에 따르면 소화된(자극된 상부 위장관 소화) Gold3 골드 키위 분말은 폴리페놀 프로파일이 소화 전과 달랐다(예 2 참조). 그러나 전반적인 페놀류 함량은 동일했다. 녹색 키위 분말도 소화 후 폴리페놀 프로파일이 달라지긴 했지만, 전반적인 함량은 소화 후 감소하였다(예 2 참조).
[0159][0159] 이를 통해 발명가들이 도출한 결론은 Gold3 골드 키위 분말에 존재하는 폴리페놀이 녹색 키위 분말에 존재하는 폴리페놀보다 위에서 소화가 덜 된다는 점이다. 즉, Gold3 키위 품종과 같은 골드 키위의 폴리페놀을 다른 페놀류로 생체변환하는 데 이용 가능하다는 것이다.
[0160][0160] 이론에 얽매이지 않는 범위에서, Gold3 골드 키위는 클로로제닉산, E-카페오일-3-글루코시드, 플로리진, 프로시아디닌 B2 및 케르세틴을 풍부하게 포함하는 고유한 프로파일을 가지고 있는 것으로 여겨진다. 이러한 페놀류는 '소화되지 않은' 상태로 남아 있기 때문에 장으로 이동되어 장 미생물총에 의해 대사물로 대사된다고 여겨진다(페놀류 유도체). 이후 이러한 유도체들은 다른 대사 경로에서 흡수되어 상호작용할 수 있으며 불순물제거 촉진 등의 건강상 유익성을 보완할 수 있다.
[0161][0161] 페닐프로파노이드 경로는 식물에서 발견되는 페놀류 화합물 중 대부분을 생성한다고 알려져 있다. 페닐프로파노이드는 식물의 재생, 성장 및 방어 체계(면역 체계), 그리고 식물들과 유익한 미생물 및 유익한 포식자 간 상호작용(영양 체계)을 제어한다. 따라서 여기에 공개된 바와 같이, Gold3 품종 페놀류 화합물이 식물의 해충 저항성과 Gold3 유래 분말의 소화적 유익성을 모두 담당할 수도 있다는 가정을 실현하는 것이 가능하다.
[0162][0162] 아울러 발명가들은 프리바이오틱 속성을 보유한 것으로 알려져 있는 소화 저항성 성분들이 Gold3 골드 키위 분말에 포함되어 있다는 사실을 발견하였다(예 4 참조). 이러한 성분들은 위장 미생물총을 조절하고, 짧은 사슬 지방산(short chain fatty acids: SCFA; 예 4 참조)과 같은 대사체의 생성을 촉진하는 데 도움을 줌으로써 다양한 건강상 유익성에 기여한다.
[0163][0163] 이외에도 발명가들은 Gold3 골드 키위 분말이 위장 미생물총의 증식 패턴에 영향을 미침으로써 유해한 박테리아보다 유익한 박테리아의 증가를 촉진한다는 사실을 발견했다(예 3 참조). 주목할 것은, 발명가들이 관찰한 바에 따르면 Gold3 골드 키위 분말로 치료받은 변비 환자들의 대변 샘플에서 Faecalibacterium prausnitzii 의 상대 풍도가 유의하게 증가했다는 점 또한 관찰했다는 것이다(7 및 8 참조). 이처럼 F. prausnitzii 를 비롯한 유익한 박테리아가 증가하는 현상은 정량적 PCR 분석을 통해서도 확인되었다(예 9 및 10) 참조.
[0164][0164] F. prausnitzii 의 농도 감소는 위장 장애와 특히 위장관의 염증성 상태와 연관되기 때문에, 이러한 발견은 유의하다. F. prausnitzii 의 농도 감소는 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome: IBS)과 염증성 장질환(inflammatory bowel disease: IBD)을 비롯한 기타 건강 상태에 특이적으로 연관된다고 알려져 있다. 그 예는 Sokol 등(2008) 및 Sartor(2011)의 연구 자료와 더불어 아래의 자료도 함께 참조하도록 한다.
[0165][0165] 따라서 Gold3 골드 키위와 그 유전적 파생상품들이 변비의 치료 또는 예방, 배변 활동의 규칙성 유지 또는 개선, 미생물총 불균형 치료 또는 예방, 소화관 내 유익한 박테리아의 유지 또는 증가, 소화관 내 F. prausnitzii 의 유지 또는 증가, 및/또는 과민성 대장 증후군 또는 염증성 장질환의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 조성물에 사용될 수 있다는 것이 입증된 셈이다. 이러한 조성물의 추가 용도는 여기에서 자세히 설명될 것이다.
[0166][0166] 키위 조성물 조제 방법
[0167][0167] 본 발명은 일반적으로 골드 키위를 이용하여 준비한 조성물과 관련된다. 본 발명의 특정한 일 양태에서는 이 조성물이 Actinidia chinensis 를 기반으로 조제된다. 가급적이면 Gold3(G3으로도 알려져 있음) 골드 키위 품종이 사용된다. 또 다른 양태에서는 골드 키위 품종의 유전적 파생상품이 한 가지 이상 사용될 수도 있다. 예를 들어 골드 키위 품종의 부모계를 포함하는 유전 교차에 기반한 F1 또는 F2 자손을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 또는 부모로부터 확보한 변이종 또는 기타 재배품종 중 어느 것이든 이용할 수 있다.
[0168][0168] 본 조성물은 동결 건조 분말과 같은 분말 형태로 조제되거나 그 외 어느 적합한 투여 형태로든 조제가 가능하다. 특정 양태들에서는 분말을 정제(신속 용해 정제 포함) 또는 캡슐(서방성 캡슐 포함)로 조제하는 것이 바람직할 수도 있다. 정제로는 할선 정제, 츄어블(chewable) 정제, 발포성 정제, 경구 붕해 정제 또는 현탁액 조제용 정제를 사용할 수 있다. 캡슐은 겔 캡슐을 사용할 수 있으며 여기에는 싱글 피스(single piece) 겔 캡슐화 및 투 피스(two piece) 겔 캡슐화를 통해 제조된 겔 캡슐들도 포함된다. 비젤라틴 캡슐과 당의정도 포함 가능하다. 분말은 자유 유동 형태 또는 고체 덩어리 형태로 제공될 수 있다. 본 조성물은 현탁액 조제용 분말, 용액 조제용 분말, 벌크 경구 과립제 또는 벌크 경구 분말로서 제공될 수 있다. 또는 강장제, 엘릭시르, 지제, 농축물, 시럽, 용액, 현탁액, 유탁액, 물약, 퓌레, 페이스트 또는 점적약 형태로 조제될 수 있다. 다른 양태들에서는 이 조성물이 겔 또는 젤리 형태로 조제될 수 있다. 본 조성물은 분말 포(sachet)나 겔 또는 젤리 포(sachet)와 같은 포(sachet) 형태로 제공될 수 있다. 여기에는 얇은 스트립을 포함하는 제형이나 음식물 또는 음료와 섞을 수 있는 고체물을 캡슐에 담는 제형도 포함된다. 아래에 설명되는 바와 같이, 그 외 조제법도 가능하다.
[0169][0169] 본 발명의 조성물은 한 가지 이상의 상용 출처를 통해 확보되는 골드 키위 퓌레를 기반으로 조제 가능하다. 가급적이면 골드 키위 퓌레는 씨와 과피가 모두 제거된 것이 좋다. 또한 퓌레를 약 1 mm 이하의 체로 걸러 준비하는 것이 바람직하다. 그리고 퓌레의 점도(12.5° 브릭스, 20℃에서 측정)가 약 12.0이거나, 10.0-14.0, 11.0-13.0, 11.75-12.25, 11.8-12.2 또는 11.9-12.1의 범위에 속하거나, 약 11.0, 약 11.25, 약 11.7, 약 11.8, 약 11.9, 약 12.1, 약 12.2, 약 12.3 또는 약 12.5인 것이 좋다.
[0170][0170] 퓌레의 pH는 3.2-3.8, 3.0-4.0 또는 3.1-3.9의 범위에 속하거나, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9 또는 약 4.0일 수 있다. 일부의 경우 퓌레 또는 최종 조성물의 pH를 근사 생리학적 수준으로 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 6.0-8.0, 6.5-7.5 또는 6.8-7.2의 범위에 속하거나, 약 6.5, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4 또는 약 7.5인 pH를 확보하는 것이 유용할 수 있다.
[0171][0171] 특정 양태들에서는 본 발명의 조성물이 뉴질랜드 특허 번호 235972(여기에 참조자료로 포함됨)에서 언급된 "저강도 과육 제거(soft pulping)" 기법을 이용하여 조제될 수 있다. 이는 걸쭉한 골드 키위 과즙을 제조하고자 할 때 적절히 수정하여 활용할 수 있다.
[0172][0172] 초기 조제 단계에서는 골드 키위의 전처리 작업이 필요할 수 있으며, 여기에는 일반적으로 알려져 있는 키위 숙성, 검사, 평가 및/또는 분류 단계가 포함될 수 있다. 숙성 시에는 가급적 잘 익은 또는 성숙된 골드 키위를 이용하는 것이 본 발명의 조성물을 조제하기에 적합하다. 단, 썩거나 부패한 재료는 피하는 것이 좋다.
[0173][0173] 성숙도는 당업계에서 널리 알려져 있고 흔히 사용되고 있는 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 성숙도는 골드 키위를 고르거나 가공하기 전에 측정할 수 있다. 특히 성숙도는 브릭스 시스템을 이용하여 측정할 수도 있다. 당도가 16-21° 브릭스, 14°-23° 브릭스 또는 15°-22° 브릭스 범위 속하거나 약 14°, 약 15°, 약 16°, 약 17°, 약 18°, 약 19°, 약 20°, 약 21°, 약 22° 또는 약 23° 브릭스인 골드 키위는 충분한 성숙도를 나타내는 것일 수 있다.
[0174][0174] 이 브릭스 수치를 초과하는 골드 키위는 지나치게 숙성 또는 발효되었을 수 있으며 적합한 조성물을 제공하지 못할 수 있다. 적합한 브릭스 수치에 미달되는 키위는 사용 전에 인공적으로 숙성시킬 수 있다. 충분한 보관 기간 동안 보관하면 성숙 상태를 달성할 수 있다. 예를 들어 약 5° 브릭스인 키위를 선택한 경우 0℃에서 4-6주간 차게 보관하여 10° 브릭스로 만들 수 있다. 이 과일은 냉장 보관 장소에서 꺼낼 때 12° 브릭스 이상의 수준으로 성숙되어 있을 것이다. 숙성 과정 중에는 기타 화학적 변화가 발생하여 키위가 최적의 결과물을 제공할 수 있을 정도의 이상적인 성숙 범위가 달성되기도 한다.
[0175][0175] 이러한 가공 과정에서 골드 키위를 멸균할 수도 있다. 이 경우 한 개 이상의 롤러 브러쉬가 장착된 어셈블리에 과일을 통과시켜 과일에 붙어 있는 모든 이물질들을 제거할 수 있다. 그 후에는 기존의 세척 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 개의 분사 노즐을 이용해 키위를 세척하는 것이 가능하다. 현지 규정 및 요건에 따라, 키위에 기생하는 박테리아를 청소하거나 감소시키는 데 유용한 세척용 첨가제를 사용할 수도 있다. 예를 들어 염소 세제 및/또는 오존 함침수 세제로 과일을 씻은 뒤 새 물로 헹굴 수 있다.
[0176][0176] 그 후 멸균된 골드 키위를 호퍼로 전달할 수 있다. 호퍼는 키위를 한 개씩 절단 어셈블리로 곧장 전달할 수 있는 통로를 포함하도록 첨형으로 설계할 수 있다. 절단 어셈블리는 과일의 씨앗이 과육을 오염시키지 않도록 씨앗 손상을 방지해주는 워터 레이저와 같은 절단 장치 또는 유사 장치를 포함할 수 있다. 그 외 적합한 절단 장치로는 회전식 원형 블레이드, 왕복 블레이드, 유체 분출 절단 장치, 스윙 블레이드 등이 포함된다.
[0177][0177] 절단 장치는 골드 키위의 길이 전체를 절반으로 크게 절단할 수도 있다. 또는 키위 과피를 파쇄할 수 있는 소프트 크러싱(soft crushing) 장치로 절단 장치를 교체할 수도 있다. 이는 가급적이면 키위의 중요 세포 손상을 유발하지 않는 범위여야 한다. 예를 들어 골드 키위를 롤러 사이에 배치하여 키위 과피가 파쇄되도록 할 수 있다. 특히 일정 간격을 두고 서로를 마주보는 방향으로 사선 배치된 롤러들 사이로 키위를 통과시켜 파쇄를 진행할 수 있다. 이 방법은 과일을 압착하여 과피가 분리되도록 하는 목적으로 사용할 수 있다. 파쇄 작업이 진행된 키위는 손상을 받지 않은 상태로 유지되며 큰 조각들로 즉시 분리가 가능하다. 그 외 파쇄 방법을 사용할 수도 있다.
[0178][0178] 절단된 골드 키위 조각은 과피와 과즙을 분리하도록 설계된 가압 어셈블리에 통과시킬 수 있다. 가압 어셈블리는 과육 제거 또는 분쇄 공정을 수행할 수 있도록 조정할 수 있다. 이러한 공정은 기존의 과일 과육 제거 기법에 비해 비교적 순하고 약한 강도로 수행할 수 있다("저강도 과육 제거(soft pulping)"). 저강도 과육 제거 방법을 이용하면 과일 세포 또는 성분이 크게 분해 또는 용해되지 않는다. 가급적이면 이 공정에서 씨앗의 극히 일부(대체로 5-10% 미만)만 분리되도록 해야 한다. 저강도 과육 제거 공정에서는 화학적 및/또는 효소 용해 방법, 열 기법, 세포의 분해를 목적으로 하는 기법, 그리고 과일 재료의 과도한 분쇄 과정이 포함되는 기계적 기법이 제외된다.
[0179][0179] 한 실시예에서는 가압 어셈블리가 트윈 수렴형 벨트 프레스 사이에서 골드 키위에 압력을 가하는 방식으로 키위의 저강도 과육 제거를 수행한다. 프레스 벨트로는 여러 개의 도르래를 공전하는 다수의 루프를 사용할 수 있다. 프레스 벨트 간 간격은 키위가 이동되는 방향에 가까워질수록 좁아지도록 설정할 수 있다. 이 경우 키위가 가압 어셈블리에서 이동되는 동안 키위에 더 높은 힘이 가해질 수 있다. 따라서 씨앗에 큰 손상을 주지 않고도 키위의 과육을 제거할 수 있다. 즉, 씨앗에 의한 과육 오염이 방지될 수 있는 것이다.
[0180][0180] 가압 어셈블리에서 생성된 과육은 스크리닝 공정으로 전달되며, 여기에서 씨앗과 과육이 분리된다. 특히 과육과 씨앗의 분리는 저강도 기계적 스크리닝 기법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어 과육 피니셔를 사용할 수 있다. 여기에는 회전식 플렉시블 임펠러가 포함되며, 이 임펠러는 사전 지정 크기의 개구부를 갖춘 원뿔 모양의 스크린에서 회전된다. 특정 양태들에서는 키위의 과육과 과즙이 스크린을 통과할 수 있으면서도, 스크린에 의해 정의된 내부 구멍에서 씨앗의 상당부분(전부는 아니더라도)을 유지하기에 적합한 크기의 개구부가 선택된다.
[0181][0181] 특정 양태들에서는 골드 키위 기반의 퓌레보다 페이스트를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키위 페이스트는 농축물로 제조될 수 있다. 예를 들어 과일을 수시간 동안 가열하고 압착하여 두터운 농축 형태로 축소시킬 수 있다. 과일은 과피를 제거한 후에 가열하거나 과육 제거 또는 으깨기 공정 후에 가열할 수 있다. 과일은 점진적으로 가열할 수 있으며, 그 후 적정한 온도에서 가열 상태를 유지하며 혼합할 수 있다. 과일이 걸쭉해지면 평평한 시트 위에 펼치거나 가방, 튜브, 통, 병 또는 그 외 용기로 옮겨 포장할 수 있다. 페이스트는 사람이 소비하기 적합할 수 있도록 무균 방식으로 이동될 수 있다. 가급적이면 키위 페이스트는 성숙된 골드 키위로 제조하는 것이 좋다. 페이스트는 가급적 과육 제거를 거친 과일로 조제하는 것이 바람직하다. 페이스트는 매끈한 제형일 수 있으며, 약 40° 브릭스 수준이나, 30°-50° 브릭스 또는 35°-45° 브릭스 수준이나, 약 35°, 약 36°, 약 37°, 약 38°, 약 39°, 약 41°, 약 42°, 약 43°, 약 44° 또는 약 45° 브릭스 수준의 농축물을 포함할 수 있다.
[0182][0182] 그 후에는 냉동 단계를 통해 과육(예를 들어 페이스트 또는 퓌레 형태) 가공을 실시할 수 있다. 이 단계는 건조 단계 전에 배치되거나 건조 단계와 통합될 수 있다. 다른 실시예에서는 중간 냉동 단계 없이 과육을 건조하고 분말로 가공한다. 예를 들어 드럼 건조 작업이 포함되는 방법을 사용할 수 있다. 드럼 건조 공정에서는 여러 시트의 드럼 건조 결과물을 생성하는 회전식 고용량 드럼 위에서 퓌레 또는 페이스트를 비교적 저온으로 건조할 수 있다. 특정 양태들에서는 건조 공정을 가속화하거나 그 외 방법으로 보조하는 첨가제를 사용할 수 있다. 예를 들어 완두 전분 또는 기타 건조 조제를 활용할 수 있다. 그 후에 건조물을 마감 처리된 플레이크 또는 분말 형태로 제분할 수 있다. 드럼 건조 기법은 건조된 조성물이 페놀류 화합물과 같은 주요 성분들을 보존하고 액체를 이용하여 손쉽게 조제할 수 있도록 제조할 때 유리하게 이용할 수 있다. 예를 들어 드럼 건조물은 찬 물에 녹도록 조제할 수 있다. 또 다른 대안으로는 벨트 건조 또는 대류 건조를 사용할 수 있다. 이러한 건조 방법은 당업계에서 널리 알려져 있으며 흔히 사용되고 있다.
[0183][0183] 동결 작업을 수행하는 경우에는 과육을 제조한 후 최대한 빨리 동결시키는 것이 신선도 유지에 바람직하다. 단, 필요에 따라 24시간 또는 48시간 이내로 동결해야 한다. 동결 방법은 익히 알려져 있기 때문에 아래에서 아주 자세히 설명할 필요는 없다. 본 발명의 활용 시에는 특히 송풍 동결이 유리하다. 과육은 표준 크기의 페일(pale)에서 동결시킬 수 있으며, 이는 가공 후 신선한 과육을 수집하는 데 사용된다. 과육은 조성물을 조제하는 데 필요한 시점까지 동결 상태로 보관(예를 들어 -18℃)할 수 있다.
[0184][0184] 동결된 과육은 동결 건조될 수 있다. 동결 건조 기법은 널리 알려져 있고 흔히 사용되고 있다. 동결 건조 주기는 약 48시간이거나, 40-56시간, 12-36시간 또는 36-60시간이거나, 약 40시간, 약 42시간, 약 44시간, 약 46시간, 약 48시간, 약 50시간, 약 52시간 또는 약 54시간일 수 있다. 최대한의 활성을 유지하려면 예를 들어 최소 48이상의 동결 건조 주기("저강도 동결 건조")를 사용할 수도 있다. 특정 양태들에서는 가공 중 수분 형성을 방지하여 수분 함량을 최소화하는 방법으로 이 공정을 수행할 수 있다.
[0185][0185] 특별한 동결 건조 공정을 사용하여 건조물을 확보하는 것이 바람직할 수도 있다. 예를 들어 자동화 시스템의 일부로서 동결 건조 프로그램을 사용할 수 있다. 이 동결 건조 공정에는 여러 건조 단계(예를 들어 단계별 온도 증감)가 포함될 수 있다. 가급적이면 승화의 목적으로 일차 건조 설정을 사용하고, 그 뒤에 한 가지 이상의 이차 건조 설정을 사용하여 잔여 수분을 제거하는 것이 좋다. 특정 양태들에서는 동결 건조 공정의 최고 온도가 70℃를 초과하지 않는다. 다른 양태들에서는 동결 건조 공정의 온도가 -10℃에서 70℃ 사이이다. 다른 일 양태에서는 최대 48시간의 동결 건조 방식이 사용된다.
[0186][0186] 그 후 건조된 결과물을 분말로 제분하고, 이 분말을 적절한 경우에 따라 활용할 수 있다. 제분 방법은 당업계에서 익히 알려져 있고 널리 사용되고 있다. 분말 제조 시에는 표준 메쉬 크기를 사용할 수 있다. 예를 들어 US 20, US 23, US 30, US 35, US 40, US 45 또는 US 50의 메쉬 크기가 사용될 수 있다. 분말용 체 크기는 1.0-0.3 mm, 0.84-0.4 mm 또는 0.71-0.5 mm의 범위에 속하거나, 약 1.0 mm, 약 0.84 mm, 약 0.71 mm, 약 0.59 mm, 약 0.5 mm, 약 0.47 mm, 약 0.465 mm, 약 0.437 mm, 약 0.4 mm, 약 0.355 mm 또는 약 0.3 mm일 수 있다.
[0187][0187] 키위 성분의 분해가 최소화되도록 보장하려면 40℃ 미만의 온도에서 조제 공정을 수행할 수 있다. 다양한 실시예들에서는 공정이 -4℃-40℃, -1℃-10℃ 또는 1℃-6℃의 범위에서 수행되거나, 약 0℃, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃ 또는 약 6℃에서 수행된다. 이러한 온도는 과일을 통째로 보관하는 과정, 과일이 파쇄되기 전 과정, 그리고 과육 제거/으깨기 공정 중의 과정들을 포함하는 전체 조제 공정 동안 유지될 수 있다. 최적의 결과를 위해서는 과일이 파쇄된 시점부터 최소한 이 온도를 유지한다. 이러한 온도는 과일의 산화와 환원제 사용을 방지해준다. 특정 상황에서는 유기농 인증(organic certification)을 획득해야 할 수도 있다.
[0188][0188] 가공 방법은 가급적이면 골드 키위의 활성 물질에 대한 손상 또는 영향을 방지하거나 최소화할 수 있도록 수행한다. 최적의 생산 방법을 보장하기 위해 결과 조성물을 폴리페놀 함량 등에 대해 모니터링할 수 있다. 본 조성물은 최소한 클로로제닉산, E-카페오일-3-글루코시드, 네클로로제닉산, 플로리진, 프로시아디닌 B2 및 케르세틴 람노시드와 같은 폴리페놀 화합물을 함유할 것으로 예상될 수 있다. 또한 카테킨, 에피카테킨, E-카페오일-4-글루코시드 및 케르세틴 루티노시드가 존재할 수 있다. 이러한 폴리페놀의 수치는 아래에 제시되어 있다. 폴리페놀 함량 시험은 당업계에서 익히 알려져 있으며 아래에도 설명되었다. 특히 총 폴리페놀 함량을 결정하기 위해 갈륨산 등가물(gallic acid equivalents: GAE)을 측정할 수 있다. 예를 들어 페놀류 화합물의 시험관 내 비색분석 함량 시험에 Folin-Ciocalteu 방법(Folin 페놀 시약 또는 Folin-Denis 시약으로도 알려진 Folin-Ciocalteu 시약을 사용)을 사용할 수 있다(Singleton 등, 1999).
[0189][0189] 대안적으로 또는 추가적으로, 조성물을 Lactobacillus 및/또는 Bifidobacterium 과 같은 유익한 유기체의 증식 촉진 여부에 대해 검사하거나, 아세테이트, 낙산염 및/또는 프로피온산과 같은 짧은 사슬 지방산의 수치 증가 여부에 대해 검사할 수 있다. 이러한 증식 수준과 유기산 수치는 아래에 제시되어 있다. 해당 함량 분석은 널리 알려져 있으며 아래에도 자세히 설명되었다. 가급적이면 박테리아 증식 및 유기산 수치를 촉진함에 있어 상기의 활성들과 상기의 폴리페놀 함량들은 시험관 내 소화를 이용하여 함량 분석을 실시하는 등의 방법을 통해 확인할 때 조성물 소화 시점에도 여전히 존재해야 한다. 특정 양태에서는 여기에서 발명가가 설명하는 바에 따라 시험관 내 소화 함량 분석이 사용될 수 있다. 다른 시험관 내 함량 분석은 당업계에서 알려져 있으며 이용되고 있다(예를 들어 Kaur 등, 2010 참조).
[0190][0190] 일부 상황에서는 본 발명의 조성물을 얻기 위해 골드 키위계(예를 들어 Gold3계)의 유전적 파생상품을 사용하는 것이 가능할 수도 있다. 이러한 파생상품으로부터 얻은 조성물은 골드 키위계에서 확보된 조성물의 특성 중 한 가지 이상을 동일하게 보유할 것으로 예상된다. 예시적 특징으로는 상기에서 언급되고 여기에서 자세히 공개한 바와 같이, 폴리페놀 수치 및 폴리페놀 프로파일, 악티니딘 수치, 섬유소 수치, 비타민 수치, 유익한 유기체 증식 촉진, 그리고 유기산 수치 강화가 포함된다.
[0191][0191] 과일 자체에 관해서는 유전적 파생상품에서 얻은 키위가 골드 키위 부모와 유사한 조성적 구성을 동일하게 보유할 것으로 예상된다. 예를 들어 과일의 비타민 C 함량은 과일 100 g당 100-150 mg, 90-200 mg 또는 80-220 mg의 범위에 속하거나, 약 80 mg, 약 90 mg, 약 100 mg, 약 115 mg, 약 130 mg, 약 140 mg, 약 150 mg, 약 160 mg, 약 170 mg 또는 약 180 mg일 수 있다. 과일의 악티니딘 함량은 과일 100 g당 60-110 FU, 70-100 FU 또는 80-90 FU의 범위에 속하거나, 약 60 FU, 약 70 FU, 약 80 FU, 약 90 FU, 약 100 FU, 약 110 FU 또는 약 120 FU일 수 있다. 과일의 총 폴리페놀 함량은 과일 100 g당 250-450 mg GAE, 200-800 mg GAE, 300-600 mg GAE, 270-430 mg GAE, 280-420 mg GAE, 290-410 mg GAE, 300-400 mg GAE, 310-390 mg GAE 또는 320-380 mg GAE의 범위에 속할 수 있다.
[0192][0192] 골드 키위를 포함한 조성물
[0193][0193] 발명가들이 발견한 바에 따르면 Gold3 골드 키위 분말은 소화계 건강 유지뿐 아니라 소화 문제 및/또는 위장 장애의 치료와 예방에 도움이 되는 유익한 성분들을 포함하고 있다. 특히 발명가들은 Gold3 골드 키위 분말이 배변 활동의 규칙성을 개선하는 데 특별히 효과가 있다는 것을 확인하였다. Gold3 분말은 유해한 박테리아에 비해 유익한 박테리아의 증식을 촉진하고 특이적으로 F. prausnitzii 의 증가를 유도하는 데도 효과적이었다.
[0194][0194] 따라서 본 발명의 골드 키위 조성물들은 전반적인 장 건강을 개선하거나 보완하고, 또는 다양한 질병과 염증, 변비, 미생물총 불균형, 과민성 대장 증후군 및 염증성 장질환을 포함한 기타 소화관 상태를 치료 또는 예방하는 데 사용할 수 있다. 또한 이러한 조성물들은 배변 활동의 규칙성을 유지 또는 개선하고 소화관 내 F. prausnitzii 를 포함하는 유익한 박테리아를 유지 또는 증가시키는 데 사용할 수 있다.
[0195][0195] 골드 키위 분말은 캡슐화 또는 정제화하거나 다른 제품에 첨가 또는 포함할 수 있다. 특히 지연성 방출 조제법, 서방성 조제법을 비롯해 신속 분해용 조제법이 포함된다. 특이적으로는 겔 캡슐과 더불어 포(sachet) 및 츄어블(chewable) 정제가 포함된다. 또한 한 가지 이상의 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 신바이오틱스 또는 기타 소화 보조제와 같은 다른 유익한 제제들과 본 발명의 분말을 혼합하여 포함시키는 복합제 조제법도 포함된다. 대안 실시예에서는 분말을 농축물, 시럽, 현탁액 또는 경구 투여용 강장제와 같은 액상으로 조제하거나 직장 투여용 관장제 또는 관장약으로서 조제 가능하다. 여기에는 직장 좌약도 포함된다.
[0196][0196] 선호되는 양태들에서는 골드 키위 분말 건조 결과물이 캡슐화되고, 각 캡슐마다 약 500 mg 또는 약 600 mg이나 50-650 mg, 150-850 mg, 200-800 mg, 300-700 mg 또는 550-750 mg 범위의 건조 분말이 함유되거나, 약 50 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 550 mg, 약 575 mg, 약 590 mg, 약 610 mg, 약 625 mg, 약 650 mg, 약 675 mg, 약 700 mg, 약 750 mg, 약 800 mg 또는 약 850 mg의 건조 분말이 함유된다.
[0197][0197] 특정 상황에서는 골드 키위 유래 폴리페놀을 분리하거나 강화하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 폴리페놀 강화 조성물, 페놀류 농축물 또는 분리한 페놀류를 포함하는 조성물을 얻고자 할 때 골드 키위를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 화합물은 폴리페놀을 강화시켜 그 농도를 섬유소, 당 및/또는 단백질과 같은 다른 골드 키위 성분보다 증가시킬 수 있다. 특정 양태들에서는 골드 키위의 다른 성분으로부터 분리된(예를 들어 정제된 형태) 폴리페놀이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.
[0198][0198] 폴리페놀의 강화와 추출 방법은 당업계에서 널리 알려져 있다(예를 들어 Sun-Waterhouse 등, 2009; Eidenberger 등, 2014 참조). 가급적이면 이 결과 조성물의 폴리페놀 양은 폴리페놀 강화 또는 분리 단계가 없이 조제된 조성물에 비해 최소 2배, 최소 3배, 최소 4배, 최소 5배 또는 최소 10배 더 많아야 한다. 폴리페놀 강화 조성물, 페놀류 농축물, 그리고 분리된 페놀류를 포함한 조성물은 분말로 건조되어 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 양태들에서는 이러한 분말이 캡슐화되고, 각 캡슐마다 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg 또는 약 400 mg의 분말이 포함되거나, 100 mg-200 mg, 100-300 mg 또는 200-400 mg 범위의 분말이 포함된다.
[0199][0199] 투여 형태에는 예를 들어 한 가지 이상의 유착방지제, 결합제, 코팅, 분해제, 향미제, 색소, 감미료, 윤활제, 활택제, 유동제, 고결방지제, 흡수제 또는 보존제를 포함하는 첨가제가 포함될 수 있다. 유용한 첨가제로는 스테아린, 스테아린산 마그네슘, 당류 및 그 유도체(예를 들어 이당류: 수크로스, 락토스); 다당류 및 그 유도체(예를 들어 전분, 셀룰로스, 또는 변형 셀룰로스(마이크로크리스탈린 셀룰로스, 그리고 하이드록시프로필 셀룰로스와 같은 셀룰로스 에테르); 당알코올(이소말트, 자일리톨, 소르비톨 및 말리톨 등); 단백질(젤라틴 등); 합성 중합체(폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜); 지방산, 왁스, 셸락, 플라스틱스 및 식물 섬유소(옥수수 단백질 제인); 하이드록시프로필 메틸셀룰로스; 교차결합 중합체(예를 들어 교차결합 폴리비닐피롤리돈(크로스포비돈) 및 교차결합 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스(크로스카르멜로스 나트륨)); 전분 글리콘산 나트륨; 이산화규소, 흄드 실리카(fumed silica), 활석 및 탄산마그네슘이 포함되며, 이에 국한되지 않는다.
[0200][0200] 본 발명의 골드 키위 조성물은 예를 들어 탄수화물, 식이섬유, 폴리페놀 및 악티니딘과 같은 다양한 성분을 포함할 것으로 예상된다. 다양한 양태들에서는 분말 25 mg당 10-20 mg의 탄수화물, 0.5-5.5 mg의 식이섬유, 0.1 -0.5 mg GAE의 폴리페놀, 그리고 100-500 AU의 악티니딘이 존재할 수 있다. 특정한 일 양태에서는 분말 25 mg당 약 18 mg의 탄수화물, 약 3.0 mg의 식이섬유, 약 0.28 mg GAE의 폴리페놀, 그리고 약 230 AU의 악티니딘이 존재할 수 있다.
[0201][0201] 본 발명의 골드 키위 조성물은 활성 성분으로 특정 폴리페놀을 포함할 수 있다. 이 조성물의 폴리페놀은 여기에서 자세히 설명된 바와 같이 시험관 내 소화 등의 조성물 소화 시점에도 여전히 존재할 수 있다. 예를 들어 소화 후 이 조성물의 클로로제닉산 함량은 건조 중량에 기반할 때 최소 40 μg/g, 최소 45 μg/g, 최소 50 μg/g 또는 최소 55 μg/g이거나, 40-60 μg/g 또는 45-55 μg/g의 범위에 속할 수 있다. 이 조성물의 E-카페오일-3-글루코시드 함량은 건조 중량에 기반할 때 최소 45 μg/g, 최소 50 μg/g, 최소 55 μg/g, 최소 60 μg/g, 최소 65 μg/g, 최소 70 μg/g 또는 최소 75 μg/g이거나, 40-80 μg/g 또는 50-70 μg/g의 범위에 속할 수 있다. 이 조성물의 에피카테킨 함량은 건조 중량에 기반할 때 최소 6 μg/g, 최소 7 μg/g, 최소 8 μg/g, 최소 9 μg/g, 최소 10 μg/g, 최소 11 μg/g, 최소 12 μg/g, 최소 13 μg/g 또는 최소 14 μg/g이거나, 8-12 μg/g 또는 9-11 μg/g의 범위에 속할 수 있다. 이 조성물의 네클로로제닉산 함량은 건조 중량에 기반할 때 최소 15 μg/g, 최소 18 μg/g, 최소 20 μg/g, 최소 22 μg/g, 최소 25 μg/g, 최소 30 μg/g 또는 최소 35 μg/g이거나, 10-30 μg/g 또는 15-25 μg/g의 범위에 속할 수 있다.
[0202][0202] 추가적인 양태들에서는 소화 후 골드키위 조성물의 플로리진 함량이 건조 중량 기반 최소 45 μg/g, 최소 50 μg/g, 최소 55 μg/g, 최소 60 μg/g, 최소 65 μg/g, 최소 70 μg/g 또는 최소 75 μg/g이거나, 40-80 μg/g 또는 50-70 μg/g의 범위에 속할 수 있다. 프로시아디닌 B2 함량은 건조 중량에 기반할 때 최소 15 μg/g, 최소 20 μg/g, 최소 25 μg/g, 최소 30 μg/g, 최소 35 μg/g, 최소 40 μg/g 또는 최소 45 μg/g이거나, 20-40 μg/g 또는 25-35 μg/g의 범위에 속할 수 있다. 케르세틴 람노시드 함량은 건조 중량에 기반할 때 최소 15 μg/g, 최소 18 μg/g, 최소 20 μg/g, 최소 22 μg/g, 최소 25 μg/g, 최소 30 μg/g 또는 최소 35 μg/g이거나, 10-30 μg/g 또는 15-25 μg/g의 범위에 속할 수 있다.
[0203][0203] 그 외의 추가적인 양태들에서는 소화 후 이 조성물의 카테킨 함량이 건조 중량 기반 최소 0.5 μg/g, 최소 1 μg/g, 최소 2 μg/g 또는 최소 3 μg/g이거나, 1-4 μg/g 또는 2-3 μg/g의 범위에 속할 수 있다. 이 조성물의 E-카페오일-4-글루코시드 함량은 건조 중량에 기반할 때 최소 3 μg/g, 최소 4 μg/g, 최소 5 μg/g, 최소 6 μg/g, 최소 7 μg/g, 최소 8 μg/g 또는 최소 9 μg/g이거나, 4-8 μg/g 또는 5-7 μg/g의 범위에 속할 수 있다. 이 조성물의 케르세틴 루티노시드 함량은 건조 중량에 기반할 때 최소 1 μg/g, 최소 2 μg/g, 최소 3 μg/g, 최소 4 μg/g 또는 최소 5 μg/g이거나, 1-5 μg/g 또는 2-4 μg/g의 범위에 속할 수 있다.
[0204][0204] 소화가 발생하지 않을 때 본 발명의 골드 키위 조성물은 100 g당 총 폴리페놀 함량이 1000-1200 mg GAE, 900-1300 mg GAE 또는 800-1400 mg GAE의 범위에 속할 수 있다. E-카페오일-3-글루코시드 함량은 건조 중량에 기반할 때 60-120 μg/g, 80-100 μg/g 또는 90-110 μg/g의 범위에 속하거나, 약 80 μg/g, 약 90 μg/g, 약 100 μg/g, 약 110 μg/g, 약 115 μg/g 또는 약 120 μg/g일 수 있다. 에피카테킨 함량은 건조 중량에 기반할 때 20-60 μg/g 또는 30-50 μg/g의 범위에 속하거나, 약 20 μg/g, 약 30 μg/g, 약 40 μg/g, 약 45 μg/g, 약 50 μg/g 또는 약 60 μg/g일 수 있다. 네클로로제닉산 함량은 건조 중량에 기반할 때 20-60 μg/g 또는 30-50 μg/g의 범위에 속하거나, 약 20 μg/g, 약 30 μg/g, 약 39 μg/g, 약 40 μg/g, 약 41 μg/g, 약 50 μg/g 또는 약 60 μg/g일 수 있다. 프로시아니딘 B2 함량은 건조 중량에 기반할 때 40-120 μg/g, 50-100 μg/g, 65-90 μg/g 또는 60-80 μg/g의 범위에 속하거나, 약 40 μg/g, 약 50 μg/g, 약 60 μg/g, 약 70 μg/g, 약 75 μg/g, 약 80 μg/g, 약 90 μg/g 또는 약 100 μg/g일 수 있다.
[0205][0205] 본 발명의 골드 키위 조성물은 활성 성분으로 섬유소도 포함할 수 있다. 특정 양태들에서는 총 섬유소 함량이 건조 중량 기반 12.4-12.7%, 12.0-13.0% 또는 10-15%의 범위에 속하거나, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14% 또는 약 15%일 수 있다. 다른 양태들에서는 용해성 섬유소 함량이 건조 중량 기반 3.4-3.5%의 범위에 속하거나, 3.0-4.0% 또는 3.2-3.8%의 범위에 속하거나, 약 3.0%, 약 3.1%, 약 3.2%, 약 3.3%, 약 3.4%, 약 3.5%, 약 3.6%, 약 3.7%, 약 3.8%, 약 3.9% 또는 약 4.0%일 수 있다. 추가적인 양태들에서는 불용해성 섬유소 함량이 건조 중량 기반 8.9-9.3%의 범위에 속하거나, 8.0-10.0% 또는 8.5-9.5%의 범위에 속하거나, 약 8.0%, 약 8.5%, 약 9.0%, 약 9.5% 또는 약 10.0%일 수 있다.
[0206][0206] 본 발명의 골드 키위 조성물은 중성 당 및 우론산을 비롯한 다양한 당류를 포함할 수도 있다. 본 발명의 조성물에는 특이적으로 펙틴 다당류가 포함된다. 중성 당과 관련해서는 람노스, 아라비노스, 갈락토스 및 글루코스 중 한 가지 이상이 본 발명의 조성물에 포함된다.
[0207][0207] 본 발명의 골드 키위 조성물은 악티니딘 효소를 포함할 수 있다. 특정 양태들에서는 악티니딘 수치가 그램당 8,000-11,000 FU, 6,000-16,000 FU, 7,000-11,000 FU 또는 8,000-10,000 FU의 범위에 속하거나, 약 8,000 FU, 약 9,000 FU, 약 10,000 FU, 약 11,000 FU, 또는 약 15,000 FU일 수 있다. 악티니닌 수치 측정 방법들은 당업계에서 널리 알려져 있으며 흔히 사용되고 있다. 예를 들어 Drummond(2013) 및 Kaur 등(2010)을 참조한다. 예를 들어 N-α-CBZ-리스-p-니트로페놀(Z-리스-pNp; Sigma Aldrich Pty Ltd) 소화도를 25℃(즉, 77℉)와 같은 온도에서 측정하여 악티니딘 수치/활성을 결정하는 것이 가능하다(Boland 및 Hardman, 1972). 측정치는 조성물의 AU/g 또는 AU/mg으로 표시할 수 있다. 또는 형광분석법을 사용하여 악티니딘 수치를 측정함으로써 시스테인 단백분해효소 활성을 평가하는 것이 가능하다(Nieuwenhuizen 등, 2012; Maddumage 2013). 특히 형광 기질인 Z-FRAMC(벤질록시카르보닐-Phe-Arg-7-아미노-4-메틸쿠마린), H-D-Ala-Leu-Lys-AMC 또는 Bz-Arg-AMC(Feinchemikalien AG)가 사용될 수 있다. 측정치는 조성물의 FU/g 또는 FU/mg으로 표시할 수 있다.
[0208][0208] 본 발명의 골드 키위 조성물은 여기에서 입증된 바와 같이 Lactobacillus 또는 Bifidobacterium 군의 요소들뿐 아니라 Faecalibacterium prausnitzii 를 포함하는 Clostridiales 군 요소들과 같은 유익한 장 유기체(예를 들어 유익한 박테리아)의 증식을 촉진하는 데 활성을 나타낼 것으로 예상된다. Erysipelotrichales 및 Bacteroidales 균주와 같은 다른 유익한 유기체들도 증식이 촉진될 수 있다. 여기에는 Clostridium coccoides , Bacteroides thetaiotaomicron , Bacteroides ovatus , Bacteroides cellulosilyticus , Roseburia intestinalis , Roseburia inulinovorans , Ruminococcus bromii 및 Ruminococcus flavefaciens 을 포함하는 유익한 유기체들도 포함된다. 또한 Bacteroides - Prevotella -Porphyromonas 및 Lachnospiraceae 군 내 유익한 유기체들뿐 아니라 여기에 기술되는 다른 유기체들도 포함된다.
[0209][0209] 본 발명의 다양한 양태에서는 본 골드 키위 조성물(예를 들어 0.3-0.5 mg/ml의 분말로 희석 가능한 25 mg의 분말)이 한 가지 이상의 Lactobacillus 및/또는 Bifidobacterium 균주들(예를 들어 10억 cfu부터 시작)을 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 100% 또는 최소 110%만큼 증가시킬 수 있다. 특정한 일 양태에서는 0%로 정규화된 대조군 대비 50%를 초과하는 증식률을 달성하기 위해, 10억 cfu의 프로바이오틱 유기체(들)에 첨가된 25 mg의 분말이 사용될 수 있다. 이러한 증가는 여기에서 자세히 설명된 바와 같이 시험관 내 소화 등의 조성물 소화 시점에도 여전히 관찰될 수 있다. 가급적이면 Salmonella 및/또는 Staphylococcus 균주와 같이 해로운 장 유기체(예를 들어 유해한 박테리아)들의 동시적인 증가가 없어야 한다. 일부 경우에서는 한 가지 이상의 해로운 유기체가 감소되는 것이 가능할 수도 있다.
[0210][0210] 본 발명의 골드 키위 조성물은 Clostridium leptum 계통발생군에서 유래한 박테리아들과 같은 Clostridiales 박테리아를 포함하는 대변 박테리아와, 특히, Faecalibacterium prausnitzii 를 포함한 Faecalibacterium 균주의 증식을 촉진하는 데도 활성을 나타낼 수 있다. 변비가 있는 시험대상자와 같은 시험대상자들을 대상으로 골드 키위 분말 치료 시 Faecalibacterium prausnitzii 의 상대 풍도 증가율은 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 100%, 최소 150% 또는 최소 200%이 되거나, 20%-200%, 50%-150% 또는 70%-100%의 범위에 속할 수 있다.
[0211][0211] 본 발명의 골드 키위 조성물은 짧은 사슬 지방산의 수치를 증가시키는 데 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 특정 양태들에서는 본 조성물(예를 들어 10 mg의 분말)이 아세테이트, 낙산염 및 프로피온산 중 한 가지 이상을 최소 10%, 최소 15%, 최소 18%, 최소 20%, 최소 22%, 최소 25%, 최소 28% 또는 최소 30%만큼 증가시킬 수 있다. 이러한 증가는 여기에서 자세히 설명된 바와 같이 시험관 내 소화 등의 조성물 소화 시점에도 여전히 관찰될 수 있다.
[0212][0212] 키위 조성물 사용 방법
[0213][0213] 상기에 명시된 바와 같이, 본 발명의 골드 키위 조성물들은 전반적인 장 건강을 개선하거나 보완하고, 또는 염증, 변비, 미생물총 불균형, 과민성 대장 증후군 및 염증성 장질환을 포함한 다양한 소화관 상태를 치료 또는 예방하는 데 사용할 수 있다. 또한 이러한 조성물들은 배변 활동의 규칙성을 유지 또는 개선하고 소화관 내 F. prausnitzii 를 포함하는 유익한 박테리아를 유지 또는 증가시키는 데 사용할 수 있다.
[0214][0214] 변비는 장 기능 장애 또는 구조상의 문제로 인해 발생할 수 있으며, 다음 증상 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 배변 감소, 불완전 및 보조 배변, 힘주기, 된변 또는 덩어리진 변 형태, 복부 팽만, 고창, 복통, 설사제 의존. 변비를 일으키는 흔한 원인은 다음과 같다: 부적절한 수분 섭취, 부적절한 식이 섬유소, 규칙적인 식사 또는 일과에 대한 지장, 부적절한 활동 또는 운동, 유제품 대량 섭취, 스트레스, 배변 회피(예: 통증으로 인해), 설사제 또는 대변 연화제 과용, 갑상선기능저하증, 신경계 질환(파킨슨병 또는 다발경화증 등), 칼슘 또는 알루미늄 함유 제산제, 약물(특히 마약제 등의 진통제, 항우울제 또는 철분보충제), 우울증, 식사장애, 과민성 대장 증후군, 임신, 결장암, 장 내 신경 및 근육 기능 부족.
[0215][0215] 미생물총 불균형의 병인(예: 유익균 감소, 유익균 비율 변화 및/또는 유해균 증가)은 복잡하며 아직 완전하게 설명할 수 있는 수준은 아니다. 불균형은 항생제 등의 특정 약물, 소화관 장애 또는 식사 부족으로 인해 발생할 수 있다. 장 내 미생물총 불균형은 다음 증상 중 하나 이상의 증상으로 나타날 수 있다: 설사(특히 항생제 관련 설사), 묽은 변, 변비 및/또는 복부 팽만.
[0216][0216] 미생물총 불균형은 다양한 위장계통 장애뿐만 아니라 다른 장애와도 상관관계를 갖는다. 더욱 자세하게는 미생물총 불균형은 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 만성 소화 장애증, 크론병, 궤양성 대장염, 괴사소장결장염, 장염, 장감염, 발암(위암종, 결장직장암종 포함), 담석증, 내독소혈증, 간 질환(간경화, 간성뇌증 등)과 연관성이 있을 수 있다.
[0217][0217] 소화관 내 미생물총 불균형은 다음을 비롯한 다수의 다양한 건강 상태에 연관성이 있다:
[0218][0218] TIFF 112017061777213-pct00002.tif 177 131
[0219][0219] 소화관 염증은 위축설염, 구석입술염, 구강 안면 육아종증, 식도염, 위염(위축위염, 유문협착증, 대장염, 회장염 포함), 크론병, 만성 소화 장애증, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 병변, 열창 및 다양한 궤양(구강궤양, 식도궤양, 위궤양, 장궤양(특히 궤양성 대장염) 포함)을 비롯한 다양한 질환과 연관성이 있을 수 있다. Enterobacteriaceae , Pasteurellaceae , Veillonellaceae , Fusobacteriaceae , Proteobacteria , Campylobacter , Shigella , Yersinia , Listeria , Salmonella , Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Clostridium difficile , Helicobacter pylori , Mycobacterium avium , Enterococcus faecalis , Fusobacterium varium , Giardia , Entamoeba histolytica , 로타바이러스, 노로바이러스, 아데노바이러스, 아스트로바이러스 및 홍역바이러스의 군/세균을 비롯한 박테리아, 원충 및/또는 바이러스성 세균 등의 유해 세균과도 연관성이 있을 수 있다. 특정 상황에서 부상, 의약품 또는 수술로 인해 염증이 발생할 수 있다.
[0220][0220] 본 발명의 골드 키위 조성물은 위장 염증, 변비, 불규칙한 배변, 미생물총 불균형, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환 또는 이 문서에 설명된 기타 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 대표적인 용량으로서, 해당 조성물은 250-2500 mg, 500-5000 mg, 1000-4000 mg 또는 1500-4500 mg 또는 2000-3000 mg 또는 약 250 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 800 mg, 약 1000 mg, 약 1200 mg, 약 1500 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 2000 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg, 약 2500 mg, 약 2600 mg, 약 2700 mg, 약 2800, 약 2900, 약 3000 mg, 약 3200, 약 3500, 약 3600 mg, 약 4000 mg, 약 4200 mg, 약 4800 mg, 약 5000 mg, 약 5400 mg, 약 6000 mg 또는 약 6600 mg의 일당 골드 키위 분말이나 액상이 사용되는 경우에 동일한 용량으로 투여할 수 있다. 투여는 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회 가능하다. 투여는 식중 또는 식전에 가능하다. 당업자가 순조롭게 적절한 용량과 제형을 결정한다.
[0221][0221] 본 발명의 골드 키위 조성물에는 장관 투여, 경구 투여 및 직장 투여를 비롯한 다양한 투여 경로를 활용할 수 있다. 경구 투여는 정제, 캡슐, 포, 점적, 엘릭시르, 지제, 액제, 유탁제, 현탁액, 물약, 퓌레, 페이스트, 시럽, 겔, 젤리, 강장제 또는 알려진 기타 제형을 활용할 수 있다. 코위관을 비롯한 십이지장관 또는 위관으로 장관 투여할 수 있다. 관장제, 좌약 또는 기타 적합한 방식으로 직장 투여할 수 있다. 당업계엔 다양한 투여 방식이 알려져 있고 당업자가 이를 활용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 특정 투여 제형에 국한되지 않는다.
[0222][0222] 특정 양태에서 본 발명의 조성물은 하나 이상의 프로바이오틱 세균과 병용 투여될 수 있다. 예를 들어, 골드 키위 조성물은 하나 이상의 프로바이오틱 세균과 조합된 제형으로 조제될 수 있다. 대신에, 골드 키위 조성물은 하나 이상의 프로바이오틱 세균과 더불어 별개 제형으로 조제될 수 있다. 예시적 프로바이오틱 세균에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. Bacillus coagulans (예: GBI-30 및 6086 균주), Bifidobacterium longum (예: 아종 infantis 35624), Lactobacillus acidophilus (예: NCFM 및 CL1285 균주), Lactobacillus paracasei (예: St11 및 NCC2461 균주), Lactobacillus johnsonii (예: La1 및 NCC533 균주), Lactobacillus LC1, Lactobacillus plantarum (예: 299v 및 HEAL 9 균주), Lactobacillus reuteri (예: ATCC 55730, SD2112, 프로텍티스(ATCC 55730의 딸 균주인 DSM 17938), 프로덴티스(DSM 17938/ATCC 55730 및 ATCC PTA 5289 조합) 및 RC-14® 균주), Saccharomyces boulardii , Lactobacillus rhamnosus (예: GR-1® 균주), Lactobacillus casei (예: LBC80R 균주), Lactobacillus bulgaricus , Streptococcus thermophilus 및 Lactobacillus bifidus . 프로바이오틱으로서 유익할 수 있는 기타 세균에는 Faecalibacterium prausnitzii 를 비롯한 Faecalibacterium 균주, 또한 Bacteriodes fragilis 등의 Bacteroidaceae 균주가 포함된다.
[0223][0223] 기타 양태에서 본 발명의 골드 키위 조성물은 하나 이상의 프리바이오틱 제제(예: 조합된 제형 또는 개별 제형)와 병용 투여될 수 있다. 이전에 확인된 바와 같이, 프리바이오틱 제제는 소화가 잘 되지 않는 섬유소 또는 발효성 화합물로 구성되어 있는데, 이러한 제제는 소화관의 상부를 통과하고 유익한 세균의 기질로서 활성을 나타내어 대장에 서식하는 유익한 세균의 증식 및/또는 활성을 촉진한다.
[0224][0224] 이러한 제제는 짧은 사슬, 긴 사슬 또는 풀 스펙트럼 프리바이오틱 제제일 수 있다. 짧은 사슬 프리바이오틱 제제에는 당류 분자당 2개에서 8개의 결합이 포함된다. 긴 사슬 프리바이오틱 제제에는 당류 분자당 9개에서 60개 이상의 결합이 포함된다. 풀 스펙트럼 프리바이오틱 제제는 당류 분자당 2개에서 60개 이상의 분자 결합 길이 전체 범위가 포함된다. 예시적 프리바이오틱 제제에는 올리고당, 이눌린, 올리고당 강화 이눌린, 프룩토올리고당, 자일로올리고당, 폴리덱스트로오스, 갈락토올리고당, 트랜스갈락토올리고당, 만난올리고당, 락툴로오스, 타가토스 및 전분이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
[0225][0225] 이 문서에 제시된 결과에 기반할 때, 공개된 조성물에 존재하는 폴리페놀이 프리바이오틱 제제로 활성을 나타날 수 있다고 여겨진다. 따라서 본 발명의 조성물에 하나 이상의 페놀류 화합물을 추가하여 조성물 내부에서의 프리바이오틱 활성을 보충하는 것이 유용할 수 있다. 예시적 화합물에는 페놀산 등의 페놀 유도체, 리그닌, 프로안토시아니딘, 안토시아닌, 안토시아니딘, 이소플라본, 카테킨, 타닌, 케르세틴, 나린게닌 및 헤스페리딘 등의 플라보노이드가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 차, 코코아, 와인, 대두, 페이조아, 감귤류의 과일, 사과, 포도, 베리, 키위(특히 Hort16와 Gold3를 비롯한 골드 키위) 중 하나 이상에서 추출한 페놀류 화합물이 특별히 포함되었다. Gold3 골드 키위에서 추출한 구체적인 페놀류에는 카테킨, 클로로제닉산, E-카페오일-3-글루코시드, E-카페오일-4-글루코시드, 에피카테킨, 네오클로로제닉산, 플로리진, 프로시아니딘 B1 및 B2, 케르세틴 람노시드 및 케르세틴 루티노시드가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
[0226][0226] 추가적인 양태에서 본 발명의 조성물은 하나 이상의 신바이오틱(프리바이오틱과 프로바이오틱을 조합한) 제제와 병용 투여될 수 있다. 예를 들어, 골드 키위 분말은 하나 이상의 신바이오틱 제제와 조합된 제형으로 조제될 수 있다. 대신에, 골드 키위는 하나 이상의 신바이오틱 제제와 더불어 별개 제형으로 조제될 수 있다. 예를 들어, Bifidobacteria 또는 Lactobacilli 를 프룩토올리고당 또는 이눌린 또는 갈락토올리고당과 조합할 수 있다. 특정 신바이오틱 조합에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. Bifidobacteria 및 프룩토올리고당, Lactobacillus rhamnosus (예: GG 균주) 및 이눌린.
[0227][0227] 추가 양태로서, 본 발명의 조성물은 섬유소 및/또는 소화 효소와 병용 투여될 수 있다. 예를 들어, 골드 키위 분말은 섬유소 및/또는 소화 효소를 구성하는 하나 이상의 조성물과 조합된 제형으로 조제될 수 있다. 대신에, 골드 키위 분말은 섬유소 및/또는 소화 효소를 구성하는 하나 이상의 조성물과 별개로 투여되는 제형으로 조제될 수 있다. 예시적 섬유소 조성물에는 수용성 및/또는 불용성 섬유소 조성물(예: 밀 덱스트린, 폴리카보필칼슘, 실리움, 이눌린, 메틸셀룰로스, 글루코만난, 아마, 아마인, 밀싹, 아카시아 세네갈 및 루바브 중 하나 이상이 포함된 조성물)이 포함된다. 예시적 소화 효소에는 악티니딘, 프로테아제, 리파아제, 아밀라아제, 셀룰로스, 판크레아틴, 펩신, 브로멜라인, 파파인, 트립신 및 키모트립신이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 소화 효소 조합 또한 활용할 수 있다(예: 악티니딘을 추가하거나 추가하지 않은 조합을 비롯한 프로테아제, 리파아제 및 아밀라아제 조합).
[0228][0228] 추가적인 양태에서 본 발명의 골드 키위 조성물은 하나 이상의 항염증제 및/또는 항균제와 병용 투여될 수 있다. 특히 흥미로운 점은 항생제 치료 도중 및/또는 이후의 프리바이오틱 보충제로서 본 발명의 조성물을 사용한다는 점이다. 예를 들어, 골드 키위 분말은 하나 이상의 항염증제/항균제와 조합된 제형으로 조제될 수 있다. 대신에, 골드 키위는 하나 이상의 항염증제/항균제와 더불어 별개 제형으로 조제될 수 있다. 예시적 항염증제/항균제에는 아미노살리실산염(예: 메살라진(예: Pentasa®) 및 설파살라진(예: Salazopyrin®)), 코르티코스테로이드(예: 부데소니드(예: Entocort®) 및 초산하이드로코티손(예: Colifoam®))이 포함되지만 이에 국한되지 않으며, 또한 아타지오프린(예: Azasan®, Imuran®), 메르캅토퓨린(예: Purinethol®, Purixan™), 시클로스포린(예: Gengraf®, Neoral®, Sandimmune®), 인플리시맙(예: Remicade®), 아달리무맙(예: Humira®), 골리무맙(예: Simponi®), 메토트렉세이트(예: Rheumatrex™, Methoblastin™), 나탈리주맙(예: Tysabri™), 베돌리주맙(예: Entyvio™), 우스테키누맙(예: Stelara®) 및 메트로니다졸(예: Flagyl®)과 시프로플록사신(예: Cipro®, Ciplox™)을 비롯한 항생제도 포함된다.
[0229][0229] 예시
[0230][0230] 이 문서에 설명된 예시는 본 발명의 특정 실시예를 설명하고자 하는 목적으로 제공되며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한할 의도로 제공된 것이 아니다.
[0231][0231] 예시 1: 키위 분말 준비
[0232][0232] 냉동 골드 키위 퓌레(냉동 골드 키위 퓌레 단일 농도(씨 빼냄))는 뉴질랜드 타우랑가 소재 Kiwifruit Processing Company Ltd에서 확보했다. 퓌레는 Zespri® 수출품 표준규격검사필 표식을 부착하고 직접 등급을 평가하도록 재배된 100% 뉴질랜드 골드 키위( Actinidia chinensis G3)로 만들었다. 껍질을 벗기고 씨를 빼내어 부드럽고 진한 퓌레만을 남기는 제조 공정을 통해 퓌레를 생산했다.
[0233][0233] 냉동 골드 키위 퓌레의 제품 설명은 다음과 같다.
[0234][0234] 키위 골드 색상을 나타내며, 일반적으로 색상에 약간의 변화가 있다. 맛은 일반적인 익은 골드 키위 맛이다. 질감은 부드럽고 씨가 없다. 퓌레에는 썩거나 발효된 과육 또는 이물질이 전혀 포함되어 있지 않으며, 검출 가능한 E coli 도 없다. 브릭스(Brix) 값은 16-21°이다. (12.5° 브릭스(Brix), 20℃에서의) 점도는 약 12.0이지만, 계절이 바뀌면서 변동될 수 있다. pH는 3.2-3.8이다. 체의 크기는 1 mm 미만이다. 제품은 사용 전까지 -18℃에서 냉동 보관된다.
[0235][0235] 이와 더불어, 냉동 녹색 키위 퓌레(냉동 녹색 키위 퓌레 단일 농도(씨 빼냄))는 뉴질랜드 타우랑가 소재 Kiwifruit Processing Company Ltd에서 확보했다. 퓌레는 Zespri® 수출품 표준규격검사필 표식을 부착하고 직접 등급을 평가하도록 재배된 100% 뉴질랜드 녹색 키위( Actinidia deliciosa , Hayward 품종)로 만들었다. 껍질을 벗기고 씨를 빼내어 부드럽고 진한 퓌레만을 남기는 제조 공정을 통해 퓌레를 생산했다.
[0236][0236] 냉동 녹색 키위 퓌레의 제품 설명은 다음과 같다.
[0237][0237] 키위 녹색 색상을 나타내며, 일반적으로 색상에 약간의 변화가 있다. 맛은 일반적인 익은 녹색 키위 맛이다. 질감은 부드럽고 씨가 없다. 퓌레에는 썩거나 발효된 과육 또는 이물질이 전혀 포함되어 있지 않으며, 검출 가능한 E coli 도 없다. 브릭스(Brix) 값은 13-18°이다. (12.5° 브릭스(Brix), 20℃에서의) 점도는 약 12.0이지만, 계절이 바뀌면서 변동될 수 있다. pH는 3.2-3.8이다. 체의 크기는 1 mm 미만이다. 제품은 사용 전까지 -18℃에서 냉동 보관된다.
[0238][0238] 키위 분말 확보 공정은 다음과 같았다.
[0239][0239] 1) 냉동 Gold3 퓌레를 뉴질랜드 타우랑가 소재 Kiwifruit Processing Company Ltd에서 구매했다.
[0240][0240] 2) 냉동 퓌레를 동결 건조(얼린 상태로 건조)했다. 냉동 건조 공정은 일반적으로 최대 약 48시간 동안 70℃를 초과하지 않는 환경에서 수행되었다. 이렇게 건조된 퓌레를 US 20 메쉬로 으깨어 자유롭게 흐르는 분말을 생산했다.
[0241][0241] 3) 녹색 키위 분말을 확보하는 데에도 동일한 방법을 사용했다.
[0242][0242] 예시 2: 키위 분말 폴리페놀 측정
[0243][0243] 녹색 및 골드 키위 분말의 폴리페놀 프로파일을 테스트했다. 동결 건조한(얼린 상태로 건조한) 녹색(Hayward) 및 골드(Gold3) 키위 분말을 예시 1에 따라 준비했다.
[0244][0244] Monro et al. 2010에 설명된 바와 같이 분말은 시험관 내 상부 위장관 모델을 사용해서 소화되었다. 소용돌이를 일으키기 전에 pH 2.5에서 간단히 물 20 mL와 20% 식염수 5 mL를 샘플 5 g에 추가했다. 이후 0.05 M 염산에 1% 펩신 1 mL을 추가한 후 천천히(220 rpm) 지속적으로 혼합하며 37℃에서 30분 동안 배양했다. 샘플을 pH 6.5로 조정한 후 Sigma Aldrich®에서 확보한 2.5% 담즙산 5 mL와 5% 판크레아틴 1 mL를 3% 염화나트륨(NaCl)에 추가했다.
[0245][0245] 이후 샘플에 소용돌이를 일으키고 나서 샘플을 천천히(220 rpm) 지속적으로 혼합하며 37℃에서 2시간 동안 배양했다. 이후 소화된 샘플을 투석 백(500 Da MWCO, Thermofisher Scientific에서 확보)으로 이동시켜 야간에 4℃의 10 mM NaCl에서 투석시켰고, 그 이후 투석액을 변경하고 추가로 2시간 동안 2℃에서 투석했는데, 이는 소장에서의 흡수를 나타낸다. 샘플을 -80℃에서 보관한 후 동결 건조했다.
[0246][0246] 소화 전후의 동결 건조한 녹색 및 골드 키위 분말 샘플(100 mg)을 5 mL 에탄올/물/포름산(80:20:1)으로 추출했다. 추출 혼합물을 30분 동안 초음파 처리한 후 야간에 보관했다. 전속력으로 샘플을 원심 분리하여 미립자를 제거했고 액체 크로마토그래피 - 질량 분석(LC-MS) 분석을 수행하기 전에 2배로 희석했다. 자세한 사항은 아래 표 2에 제시되어 있다.
[0247][0247] TIFF 112017061777213-pct00003.tif 99 126
[0248][0248] 정확한 표준의 보정 곡선으로 화합물 농도를 계산했다.
[0249][0249] 도 1에 제시된 바와 같이, 소화된 Gold3 분말(상부관 위장 소화를 시뮬레이션)은 소화 전(도 1)과 비교할 때 폴리페놀 프로파일이 변경되었다. 그러나 전반적인 페놀류 함량은 유지되었다. 특히 소화 전의 269 μg/g 폴리페놀 함량 대 소화 후의 264 μg/g 페놀류 함량이 Gold3 분말에서 관찰되었다(도 1, 테스트된 페놀류 화합물 전체를 조합). 또한 소화 후의 녹색 키위 분말에서 폴리페놀 프로파일이 변경되었지만, 소화로 인해 전반적인 함량은 감소했다(도 1). 녹색 키위 분말의 경우 소화 전 시점에서의 전반적인 폴리페놀 함량은 258 μg/g이었고 소화 후 시점에서의 함량은 153 μg/g이었다(도 1, 테스트된 페놀류 화합물 전체를 조합).
[0250][0250] 예시 3: 키위 분말에 대한 미생물 대량 처리 분석
[0251][0251] Gold3 골드 키위 분말은 완두 전분(14.28:1 습윤 중량)으로 드럼 건조한 페이스트 제형에서 확보했다(뉴질랜드 소재 Cedenco Foods에서 준비). 예시 2에 설명된 바와 같이 상부 위장관 모델로 분말 샘플(5 g)을 시험관 내에서 소화시켰다.
[0252][0252] 이후 물 또는 디메틸 술폭시드(DMSO)에서 소화된 샘플의 용해도를 높임으로써 농도가 100 mg/mL로 균일해졌다. 이후 샘플을 탈이온화 멸균수로 100배 희석해 DMSO를 처리하기 쉬운 농도로 감소시켜 박테리아 세포 용해를 방지했다. 물과 DMSO '추출물'을 미생물 대량 처리 분석 웰에 추가해 최종 농도를 1.0 mg/mL로 맞췄다.
[0253][0253] 연구에서 사용된 세균에는 프로바이오틱 Escherichia coli 니슬 1917, Lactobacillus rhamnosus HN001(DR20), Bifidobacterium lactis HN019(DR10) 및 병원체 Salmonella enterica 혈청형 티피무륨 ATCC 1772 및 Staphylococcus aureus ATCC 25932가 포함되었다.
[0254][0254] Rosendale et al. 2008에 설명된 바와 같이 흡광도(optical density, OD) 측정 용도의 아흔 여섯 개 웰이 있는 마이크로 플레이트를 활용한 증식 생물학적 분석이 이 작업에 활용되었다. 증식의 변화량(Δ증식)을 계산하고 이를 효과의 정도를 나타내는 데 활용했다. 증식의 변화량은 OD를 대조군 OD 백분율로 변환하고, 100을 빼는 방식으로 계산했는데, 이는 대조군의 증식량을 0의 기준선 값으로 효과적으로 표준화했다.
[0255][0255] 마이크로 플레이트당 하나의 박테리움 균주를 사용했으며 각 추출물은 하나의 농도 범위(0, 0.0124, 0.037, 0.111, 0.333, 1 mg/mL)에서 마이크로 플레이트당 네 번 분석되었다. 마이크로 플레이트에 동일한 용량(50 μL)의 박테리아 접종원을 접종했고 플레이트 판독기(FLUOstar Optima®)로 즉시 OD를 595 nm 파장에서 측정해 0의 증식값을 결정했다. 37℃에서 24시간 동안 마이크로 플레이트를 배양한 후 OD를 결정해 배양균의 증식을 측정했다.
[0256][0256] 결과에 따르면 Gold3 골드 키위 분말은 Bifidobacteria 및 Lactobacillus 균주의 증식을 지원하는 동시에 대조군 대비 병원체 박테리아의 수에 유의한 변화가 나타날만큼의 영향을 주지 않았다.(도 2)
[0257][0257] 예시 4: 키위 분말 테스트용 혼합 발효 모델
[0258][0258] Gold3 골드 키위 분말은 완두 전분(14.28:1 습윤 중량)으로 드럼 건조한 페이스트 제형에서 확보했다(뉴질랜드 소재 Cedenco Foods에서 준비). 예시 2에 따라 분말 샘플(5 g)을 소화시켰다. 소화된 샘플의 용해도를 물에서 높임에 따라 최종 농도가 10 mg/mL가 되었다.
[0259][0259] 세 명의 건강한 인간 지원자로부터 막 배설된 대변 샘플을 수집했다. 단일 대변 기증자의 혼합 미생물총으로 접종한 테스트 튜브에서 소화된 골드 키위 분말을 배양했고, 세 명의 각 기증자에게 이를 반복했다. 이산화탄소가 존재하는 환경에서, 사전에 양을 줄인 발효배지(9 mL)가 포함된 헝게이트(Hungate) 튜브에 샘플 또는 대조군 1 mL로 보충했고 해당 튜브를 10%(w/v) 대변 슬러리 1 mL로 접종했다. 37℃에서 천천히(150 rpm) 궤도를 그리며 흔들면서 튜브를 배양했다. 고무 격막을 통해 주사기와 22게이지 바늘로 부샘플을 주기적으로(0, 5, 10, 24, 48시간) 제거하여 샘플의 공기 노출을 방지했다.
[0260][0260] 발효 튜브에서 제거한 샘플을 1.5 mL Eppendorf tubes®에 수집한 후 5분 동안 13,000 x g으로 즉시 원심 분리하였다. 세포와 입자가 없는 상청액을 새 Eppendorf tubes®에 수집한 후 필요하기 전까지 -80℃에서 냉동시켰다.
[0261][0261] 상청액을 해동시키고 2-에틸부트레이트(최종 농도 5 mM)를 내부 표준으로 하여 0.01 M 인산 완충 식염수에 1:4 비율로 희석시켰다. 이후 샘플을 4℃에서 5분 동안 3,000 x g로 원심 분리했다. 농축된 염산(0.125 mL), 디에틸에테르(0.5 mL)를 추가해서 상청액(0.25 mL)을 산성화한 후에 5분 동안(4℃) 10,000 x g으로 소용돌이를 일으키고 원심 분리하였다. 상부 디에틸에테르 상을 수집해 황산 마그네슘으로 건조한 후 20분 동안 80℃까지 가열하는 방식으로 1% 터트-부틸디메틸클로로실란을 활용해 N-터트-부틸디메틸실릴-N-메틸트리플루로로아세타미드와 유도체합성하였다.
[0262][0262] 발효 샘플의 세균 유기산 대사물 농도를 아래 표 3에 따라 가스 크로마토그래피(GC)로 정량화했다.
[0263][0263] TIFF 112017061777213-pct00004.tif 88 133
[0264][0264] 농도가 알려진 유기산 표준 혼합물을 샘플과 함께 분석하고 이를 사용해 2-에틸부트레이트 반응에 맞게 표준화된 상대 피크 영역을 활용한 표준 곡선을 만들었다. μmol 유기산/mL fermenta로 결과를 표현했다.
[0265][0265] 도 3에 제시된 바와 같이, Gold3 골드 키위 분말의 존재로 인해 특히 초기 노출 시간 12시간 후에 유기산 생성 증가가 촉진되었다. 관찰된 상승을 고려해 볼 때, 이는 골드 키위 분말 내부의 소화가 잘 안 되는 발효성 성분(탄수화물 및 폴리페놀)이 나누어져 증식 및 에너지 생성 기질로 사용되었음을 나타낸다. 이는 프리바이오틱으로서의 활성과 일치한다.
[0266][0266] 예시 5: 규칙성 향상 목적의 Gold3 골드 키위 분말 테스트 임상 시험
[0267][0267] 임상시험계획서 개요
[0268][0268] 본 연구는 각각 4주 동안 네 가지의 다른 중재를 받으며 각 중재 사이에 2주 휴약기를 갖는 참가자들을 활용한 무작위배정, 이중 맹검, 위약 대조 교차 시험으로 설계되었다. 시험 설계에 대한 대략적인 정보는 도 4에 제시되어 있다.
[0269][0269] 임상시험 참가자
[0270][0270] 신문과 라디오 광고, 커뮤니티, 지역 보건국, 캔터베리 대학(뉴질랜드 크라이스트처치 소재) 링컨 대학(뉴질랜드 링컨 소재), 소식지, 일반 의원 진료소 내 포스터와 이전 참가자에 대한 기존 데이터베이스를 통해 두 참가자군을 모집했다.
[0271][0271] 총 쉰 한 명의 지원자 중 총 스물 아홉 명의 참가자를 모집했다. 참가자를 코호트 1("건강한", 변비에 대한 임상적 증상이 없는 참가자)과 코호트 2("기능성 변비", Rome III 기준에 기반하여 C3 기능성 변비가 있는 것으로 분류된 참가자)와 같이 두 개의 코호트로 분류했다.
[0272][0272] Rome III 기준:
[0273][0273] 1) 다음 중 둘 이상이 포함되어야 함: a) 최소 25%의 배변 도중 힘주기, b) 최소 25%의 배변에서 덩어리진 또는 딱딱한 대변, c) 최소 25%의 배변에서 항문직장관이 막히는 느낌, d) 최소 25%의 배변에서 숙변이 있는 듯한 느낌, e) 최소 25%의 배변에서 배변을 원활하게 하도록 수동으로 움직임, f) 주당 세 번 미만의 배변
[0274][0274] 2) 설사제 사용을 하지 않고도 가끔씩 설사, 및
[0275][0275] 3) 과민성 대장 증후군에 대해 부족한 기준.
[0276][0276] 포함 기준은 다음과 같았다: 18-60세, 19-30 k/m 2 의 BMI 한도, 5.6 mmol/L 미만의 공복 시 혈당; 시험대상자는 연구 기간 전반에 걸쳐 자신이 습관적으로 먹는 음식과 음료 섭취(유사한 제품에 대한 연구 식품 대용 외) 및 신체적 활동 패턴을 유지할 의지가 있어야 했음, 시험대상자는 연구 기간 동안 Metamucil®, Benefibre® 및 Phloe™ 등의 고섬유 보충제를 섭취하지 않을 뿐만 아니라 신선한 키위 섭취를 삼갈 것을 요청받음, 참가자는 식단에 미칠 수 있는 영향으로 인해 연구 기간 동안 해외 여행을 피할 것을 요청 받음.
[0277][0277] 제외 기준은 다음과 같았다: 위장 경보 증상의 존재(혈변, 잦은 설사, 끊임없는 복통 포함), 다이어트 중인 사람 또는 채식주의, 생식주의 또는 상당한 고섬유식을 표방하는 사람, 위마비 또는 락토스 과민증, 체중 감량 수술(위밴드 또는 위장 접합술), 임산부, 임상적으로 유의미한 신장, 간, 내분비성, 심장, 폐, 췌장, 신경, 혈액 또는 담즙 장애 및 키위에 대해 알려진 알레르기 또는 민감성.
[0278][0278] "건강한" 시험군은 변비에 대한 임상적 증상이 없었던 참가자로 구성되었다. "기능성 변비"(functionally constipated, FC) 시험군에는 Rome III 기준(Drossman 2006)에 기반할 때 C3 기능성 변비가 있는 것으로 판명된 참가자가 선택되었다. 참가자 스무 명(남성 2명, 여성 18명)이 건강한 시험군에 모집되었다. 평균 연령은 38세(범위: 23-56세)였고 평균 신체 질량 지수는 23 kg/m 2 였다(평균 19-29 kg/m 2 ). 참가자 아홉 명(남성 1명, 여성 8명)이 FC 시험군에 모집되었다. 평균 연령은 44세(범위: 38-54세)였고 평균 신체 질량 지수는 25 kg/m 2 였다(평균 21-29 kg/m 2 ). 훨씬 아래에 있는 표 6도 참조한다.
[0279][0279] 건강한 시험군의 참가자 스무 명 중 열아홉 명이 연구를 완료했다. 여성 참가자 한 명은 개인적인 사유로 연구를 중단했다. FC 시험군의 참가자 아홉 명 모두는 연구를 완료했다. 참가자 중재 할당 순서는 Williams Latin Square 설계와 컴퓨터로 생성한 무작위 번호로 생물 통계학자가 무작위배정하였다. 분석이 완료된 후 연구의 맹검이 해제되어 중재 순서가 공개되었다. 신속한 검토 하에서 New Zealand Human Disability and Ethics Committee로부터 도덕적 승인을 확보했고(신청서 번호 12/STH/72/AM01) 이는 Australia New Zealand Clinical Trials Registry에 등록되었다. 등록 번호 ACTRN: 12612001270808.
[0280][0280] 임상 테스트 방법
[0281][0281] 중재는 Anagenix Limited(뉴질랜드 웰링턴 소재)에서 제공받은 4 x 600 mg 캡슐로 전달되었고 중재 맹검을 보존하기 위해 동일하게 보이도록 준비되었다(표 4).
[0282][0282] TIFF 112017061777213-pct00005.tif 45 139
[0283][0283] TIFF 112017061777213-pct00006.tif 122 139
[0284][0284] 모든 참가자는 네 가지 다른 조합의 중재를 받았다. 28일 동안 각 중재 시에 위약(녹색 이소말트)(2400 mg/day), ACTAZIN™ L(600 mg/day), ACTAZIN™ H(2400 mg/day) 및 GOLD(2400 mg/day), 각 치료 단계 사이 14일의 휴약기 포함.
[0285][0285] ACTAZIN™ L(저용량, 녹색 키위) 및 ACTAZIN™ H(고용량, 녹색 키위)는 저온 공정을 거친 Actinidia deliciosa 'Hayward' 녹색 키위로 조제되었고 GOLD는 저온 공정을 거친 Actinidia chinensis 'Zesy002' Gold3 골드 색상의 과육을 가진 키위로 조제되었다. 예시 1을 참조한다.
[0286][0286] 각 4주 중재 기간의 시작 시점과 종료 시점에 참가자는 대변 샘플 제공을 요구받았다. 측정된 매개변수(세균 생태, 세균 대사물)에 대한 기준선으로 배변 습관을 되돌리기 위한 충분한 시간을 주도록 2주의 휴약기가 선택되었다.
[0287][0287] 또한 각 중재 기간의 시작 시점과 종료 시점에 참가자는 대변 샘플을 제공하고 Birmingham 과민성 대장 증후군(IBS) 증상 설문지 (Johnston et al. 2010) 뿐만 아니라 건강과 관련된 IBS 특정 삶의 질 설문지 (Patrick et al. 1998) 를 작성할 것을 요청받았다.
[0288][0288] 기준선부터 연구 종료 시점까지 각 날짜마다 참가자는 제공받은 일일 다이어리에 다양한 매개변수를 기록했다. 이러한 매개변수는 다음과 같았다. 1) 배변 수, 2) 불완전 및 보조 배변, 3) 힘주기, 4) Bristol 대변 등급에 의해 정해진 대변 형태, 5) 복부 팽만, 6) 고창, 7) 복통, 8) 설사약 사용.
[0289][0289] 데이터는 GenStat(v.16, 2013, VSNi Ltd., Hemel Hempstead, UK)의 분산 분석(analysis of variance: ANOVA)을 이용하여 분석되었다. 두 코호트의 데이터는 별도로 분석되었다. 각 관찰 기간에서 확보한 결과는 하나의 완전 블록 설계로 분석되었으며, 참여자와 참여자 × 단계를 블록으로 구성하고 단계(1, 2, 3 또는 4)와 중재(약물제거 포함)를 요인으로 구성하였다. 평균 약물제거 데이터는 통계 분석용 베이스라인으로 사용되었다. 잔여물은 검사를 실시하여 ANOVA의 가정이 충족되었는지를 확실히 보장할 수 있도록 하였으며, 여기에서 필요 데이터는 분산 안정화를 위해 로그 변환하였다.
[0290][0290] 건강한 코호트에 대해서는 각 중재에 대해 반응하는(즉, 선행 약물제거 기간 동안 주당 최소 일회 이상의 배변 활동 증가를 보임) 참여자들을 비교하기 위해 Cochran Q 검정을 이용하여 사후 하위군 분석이 실시되었다. 그 후에는 참여자들을 반응자(최소 일회 이상의 비위약 중재에 대해 반응을 보임) 또는 비반응자로 분류하였다. 반응자 하위군(19명의 참여자 중 14명(74%))의 데이터는 ANOVA를 사용하여 분석되었다.
[0291][0291] 일차 시험 결과는 배변 빈도의 유의한 증가였다.
[0292][0292] 예시 6: 규칙성 개선 치료 결과
[0293][0293] 참여자들의 인구학적 정보는 표 6에 제시되었다. 건강한 코호트와 기능성 변비 코호트 내 순응도는 각각 98% ± 9 및 99% ± 8였다.
[0294][0294] TIFF 112017061777213-pct00007.tif 67 132
[0295][0295] 이 시험의 결과는 표 7 및 8에 요약되었다.
[0296][0296] 건강한 코호트( n = 19)는 일일 배변 활동 횟수, Bristol 대변 점수, 배변긴장 및 고창에 있어서 중재 기간과 약물제거 기간 간에 유의한 차이가 관찰되었다(각각 p = 0.002, p = 0.036, p = 0.044 및 p = 0.007). ACTAZIN-H 및 GOLD 중재 시 일일 배변 활동 횟수는 약물제거 기간에 비해 유의하게 높았으며(각각 p = 0.014 및 p = 0.009), 각 중재는 주당 배변 활동 횟수가 약 0.8회 증가했다. 표 7.
[0297][0297] 반응자 하위군( n = 14)에서는 ACTAZIN-L, ACTAZIN-H 및 GOLD의 섭취 시 일일 배변 활동 횟수가 약물제거 기간에 비해 유의하게 증가하였다(각각 p = 0.005, p < 0.001 및 p = 0.001). 표 7.
[0298][0298] 28일간 중재 치료는 중대한 이상반응의 보고 없이 대체로 내약성이 우수했고, 자가 보고 고창 외에는 일일 설문지상에 기록된 건강(well-being) 파라미터에 대한 영향도 없었다( p < 0.05). 이는 건강한 코호트 ACTAZIN-H군에서 비교적 높은 편이었다( p = 0.007). 표 7.
[0299][0299] 기능성 변비가 있는 사람들(n = 9)에서는 식이 중재가 약물제거 기간에 비해 배변 활동 빈도를 유의하게 증가시키지 않았다. 표 8. 그 이유는 시험 샘플 크기가 작았기 때문이었으며, 이는 배변 빈도의 유의한 차이를 감지하는 데 있어 통계적 검정력의 한계를 야기한다. 그러나 기능성 변비군은 전반적으로 소화 파라미터가 개선되었으며 기타 변비 증상이 해소되었다.
[0300][0300] 기능성 변비군에서는 소화 건강 지수(Digestive Health Index)의 종합적인 개선이 관찰되었다. 도 5a. 기능성 변비가 있는 참여자 아홉 명 중 여덟 명은 약물제거 기간에서 확보한 평균 변화의 총합에 기반하여 계산했을 때 힘주기, 불완전한 배변, 손을 사용한 작업, 팽만감, 위장내 가스, 설사제 사용 및 통증에 있어서 위장 건강 파라미터가 개선되었다. 도 5a. 각 파라미터별 채점은 참여자들의 일일 일지에 기반하였다.
[0301][0301] 증상성 모집단에서 주당 배변 활동 횟수가 일회를 초과하여 증가하는 경우는 임상적으로 의미 있는 영향도로 간주되며(식약청(Food and Drug Administration) 2012), 경증 또는 간헐적 변비 환자들의 증상을 잠재적으로 개선할 수 있다. 녹색(헤이워드) 키위와 골드(Gold3) 키위에서 유래한 ACTAZIN™과 GOLD는 건강한 모집단에서 이러한 정도의 유효성을 입증하였다. 특히 건강한 코호트의 반응자 하위군에서는 약물제거 기간에 비해 주당 배변 활동 횟수가 약 1.5회 증가하였다.
[0302][0302] [0008] 요약하자면, 이 시험에서 ACTAZIN™과 GOLD는 건강한 코호트의 대변 형태에 영향을 주지 않고 규칙성과 불순물제거를 개선시켰다. 기능성 변비군의 경우에는 GOLD가 전반적인 소화 파라미터를 개선하고, 힘주기, 불완전한 배변, 손을 사용한 작업, 팽만감, 위장내 가스, 설사제 사용 및 통증을 포함하는 주요 변비 증상들을 완화시켰다.
[0303][0303] TIFF 112017061777213-pct00008.tif 210 128
[0304][0304] TIFF 112017061777213-pct00009.tif 220 134
[0305][0305] 예시 7: Gold3 골드 키위 분말이 대장 미생물 집단에 미치는 영향을 평가하는 임상시험
[0306][0306] 개요
[0307][0307] 키위 유래 보충제가 대장 미생물 조성 및 대사에 미치는 영향을 확인하기 위해 예 5에서 기술된 사람 중재 시험이 사용되었다. 이 시험에서는 설명과 같이 두 개의 키위 유래 보충제인 ACTAZIN™ 녹색( Actinidia deliciosa `Hayward') 및 GOLD 골드( Actinidia chinensis `Zesy002' Gold3)(Anagenix Ltd, Wellington, New Zealand)가 식이 중재로 사용되었다. 이 캡슐들은 고유한 키위 화합물의 무결성을 유지할 수 있도록 조제된 냉장 가공 식이 보충제였다. 조제는 상기의 예 1에 따라 실시되었다.
[0308][0308] ACTAZIN™(2400 mg 및 600 mg)과 GOLD(2400 mg) 키위 보충제에 대해 평가가 이루어졌다. 모집된 시험대상자들은 19명의 참여자로 구성된 건강한 시험군과 9명의 참여자로 구성된 기능성 변비군이었으며, 각 군별로 모든 치료와 위약을 무작위 교차 방식으로 4주간 섭취하였고, 치료 사이 사이에 2주간의 약물제거 기간이 배치되었다. 대장 미생물총 조성의 변화는 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석을 통해 확인되었고, 대사 최종 생성물은 가스 크로마토그래피를 이용하여 측정되었다.
[0309][0309] 기능성 변비군에서는 Faecalibacterium prausnitzii 상대 풍도가 3.4%에서 GOLD 보충 이후 7.0%로 유의하게 증가한 것이 관찰되었다( P = 0.024) F. prausnitzii 의 비중이 낮은 점은 위장 장애 및 특히 염증성 병리가 있는 경우와 관련되는 경우가 많았다. F. prausnitzii 는 주요 낙산염 생산자이며 항염 효과를 나타내는 것으로 알려져 있기 때문에, GOLD 보충이 F. prausnitzii 풍도를 증가시킨다는 발견은 대장 미생물총의 장내세균총불균형을 치료할 수 있는 전략을 제시해준다.
[0310][0310] DNA 추출, PCR 및 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석
[0311][0311] 모든 대변 샘플은 드라이아이스상에 포장되어 Plant & Food Research, Palmerston North로 전달되었으며 이 곳에서 샘플들은 -20℃로 보관되었다. 각 샘플은 멸균 미소관 내에서 250밀리그램으로 계량되었고 DNA는 MO-BIO PowerSoil® DNA 분리 키트(MO-BIO Laboratories, Carlsbad, CA, US # 12888)를 이용하여 각 샘플에서 추출되었다.
[0312][0312] 16S rRNA 유전자의 가변 영역 V3-V4( Escherichia coli rRNA 유전자 내 위치 341-805)을 증폭하기 위해 정방향(forward) 프라이머 Bakt_341F JPEG 112017061777213-pct00010.jpg 6 152 (SEQ ID NO: 1)와 역방향(reverse) 프라이머 Bakt_805R JPEG 112017061777213-pct00011.jpg 6 152 (SEQ ID NO: 2)을 이용하여 PCR 검사가 실시되었다(Herlemann 등, 2000; W=A/T, H=A/C/T, V=G/C/A, N=G/A/T/C). 굵게 표시된 프라이머 염기 서열이 장내 유전자 증폭체(amplicon) 영역과 결합하는 데 사용되었고 프라이머의 나머지 부분이 Illumina® 인덱스 어댑터와 결합하는 데 사용되었다.
[0313][0313] 각 PCR 검사는 HotStarTaq® 마스터 믹스(QIAGEN, Melbourne, Australia) 25 μL, 템플릿 DNA 또는 음성 컨트롤(멸균 H 2 O) 1 μL 및 최종 농도 0.1 μM인 각 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머 12 μL를 포함한 총 50 μL 용량에서 실시되었다. PCR 조건으로는 15분간 95℃에서의 초기 변성과 그 이후 95℃에서의 30초 변성 서른 주기, 30초간 55℃에서의 결합(annealing), 30초간 72℃에서의 확장, 그리고 5분간 72℃에서의 확장 단계가 포함되었다.
[0314][0314] PCR 생성물은 QIAquick PCR 정화 키트(QIAGEN, Melbourne, Australia)를 이용하여 컬럼 정화되었고, Qubit® 2.0 형광계(Life Technologies™)로 정량화된 뒤, New Zealand Genomics Ltd(NZGL), Massey Genome Service(MGS), New Zealand(NZ)로 전달되었다. NZGL에서는 두 번째 PCR 단계가 실시되었고 유전자 증폭체(amplicon)에 대해서는 라이브러리 QC 검사, 희석 및 혼주가 실시되었다. 그 후 라이브러리는 Illumina® MiSeq 기기에 장착하여 세 차례의 2 x 250 bp 쌍말단(paired end: PE) 검사를 실시하였다.
[0315][0315] 생물정보학
[0316][0316] [0011] Illumina® MiSeq 염기 서열 분석 데이터는 소프트웨어(Quantitative Insights into Microbial Ecology(QIIME) 소프트웨어 버전 1.8.0)에서 분석되었다(Caporaso 등, 2010). 쌍말단 리드(read)를 단일 연속 염기 서열에 통합하기 위해서는 최소 40 bp 중첩, 최소 350 bp 길이 및 최대 500 bp 길이의 파라미터를 갖는 PANDASeq가 사용되었다(Masella 등, 2012). 잠정적 키메라는 염기 서열로부터 여과되었고 리드(read)는 97%의 동질성 임계값을 기반으로 USEARCH 및 UCLUST를 이용하여 조작상 분류 단위(operational taxonomic units: OTU)에 군집화되었다(Edgar 2010). 샘플 처리를 가속화하고 샘플당 약 15,000개의 리드(read)를 정규화하기 위해 계통발생학적 및 분류학적 할당에 충분한 만큼 총 리드(read)의 하위 샘플이 채취되었다(Caporaso 등, 2011; Schloss 등, 2012).
[0317][0317] 염기 서열 정렬은 PyNAST를 이용하여 실시되었으며(Caporaso 등, 2010) Greengenes 핵심 참조자료 데이터베이스(버전 13_8)가 참조되었다(DeSantis 등, 2006). 분류학적 할당은 RDP Naive Bayesian 분류기를 이용하여 실시되었다(Wang 등, 2007). 건강한 시험군과 FC군은 개별적으로 분석되었으며, 네 가지 치료가 미생물 군락 조성에 미치는 영향은 각 치료 후 각 박테리아 속의 평균 풍도를 치료 전 평균 값과 비교하여 확인하였다(여덟 개 샘플 중 최소 한 개에서 풍도 1% 초과).
[0318][0318] GC에 따른 유기산 정량화
[0319][0319] 각 대변 샘플의 500-1000 mg 부분은 깨끗한 관에서 계량되었고 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)에서 1:10의 비율로 희석되었다. 내부 표준(낙산 에틸)이 포함되어 최종 5 mM의 농도로 조정되었다. 유기산은 앞서 설명된 바와 같이 GC에 따라 변형 방법으로 정량화되었다(Richardson 등, 1989).
[0320][0320] 분석은 불꽃 이온화 검출기와 HP-1 컬럼(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)이 장착되어 있는 Shimadzu 가스 크로마토그래프 시스템(GC-17A, Kyoto, Japan)에서 실시되었다. 이 기기는 GC Solution Chromatography Data System 소프트웨어(Shimadzu, 버전 2.3)를 이용하여 제어되었고 크로마토그램이 획득되었다. 표준 곡선은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 낙산, 젖산, 숙신산, 이소발레르산, 발레르산, 헵탄산 및 헥사노익산 표준 용액 분석 후에 작성되었다. 유기산 농도는 μmol/대변 g으로 표시되었다.
[0321][0321] 통계 분석
[0322][0322] 통계 계산은 통계 패키지를 이용하여 R Studio에서 실시되었다 (R studio 2012). 속 수치의 분류 간 유의한 차이와 각 치료 전후 유기산의 농도 간 유의한 차이를 평가하기 위해 Wilcoxon 부호 순위(Wilcoxon Signed Rank) 검정이 실시되었다. R Studio에서 p.adjust 기능의 허위 발견율(False Discovery Rate: FDR) 방법을 이용하여 다수의 비교에 대해 보정한 후에 0.05 미만으로 나타나는 P 값은 유의한 것으로 간주되었다(Benjamini 및 Hochberg 1995).
[0323][0323] 예시 8: 미생물 대장 집단에 대한 치료 결과
[0324][0324] 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석
[0325][0325] 대변 샘플 유래 박테리아 DNA에서 증폭된 16S rRNA 유전자 가변 영역에 대해 고처리량 염기 서열 분석이 실시되었다. 그 결과는 2630만 리드(read)였다. 품질 여과, 키메라 제거 및 하위 샘플링 후에 샘플당 평균 14879개(최소 14139개-최대 14999개) 염기 서열에서 총 372만 리드(read)가 확보되었다.
[0326][0326] 염기 서열 동질성 임계가 97%일 때 모든 샘플에서 218개의 종-수준 계통형이 관찰되었다. 건강한 시험군에서는 Clostridiales 가 5.0%에서 GOLD 보충 후 7.6%로 유의하게 증가하였다( P = 0.042)(표 9). FC군에서는 Faecalibacterium prausnitzii 가 3.4%에서 GOLD 치료 후 7.0%로 유의하게 약 두 배 증가했으며( P = 0.024), Dorea spp.는 0.9%에서 ACTAZIN™ H 치료 후 1.4%로 증가했다( P = 0.008)(표 10). FC 군의 경우, Ruminococcus spp.가 9.9%에서 위약 치료 기간 후 5.6%로 감소했다( P = 0.024)(표 10).
[0327][0327] FC군에서 GOLD를 사용한 참여자 아홉 명 중 여덟 명이 순 F. prausnitzii 증가를 나타냈으며, 단 한 명에서만 미미한 감소가 관찰되었다(도 5b). 건강한 시험군과 FC군을 비교했을 때, 관찰된 속 중 다수에서 시험군 간 유의한 차이가 확인되었으며, 그 중에서도 Bacteroides spp. 및 Ruminococcaceae 는 건강한 시험군에서 유의하게 더 높았고 Akkermansia spp.는 FC군에서 유의하게 높았다.
[0328][0328] 유기산 생산
[0329][0329] 이 시험에서는 대변 샘플에서 젖산염, 포름산 및 이소발레르산이 검출되지 않았다. 건강한 시험군에서는 헥사논산의 농도가 0.6 μmol/g에서 GOLD 치료 후 0.2 μmol/g으로 유의하게 감소하였다( P = 0.030)(표 11). FC군에서는 숙신산염의 농도가 2.3 μmol/g에서 위약 치료 후 1.7 μmol/g으로 유의하게 감소하였다( P = 0.040)(표 12). 그 외 유의한 유기산 농도 변화는 어느 치료에서도 없었다. 각 치료 전후 정량적 차이는 대체로 미미했으나, 예외적으로 아세테이트는 일부 치료 후에 최대 13 μmol/g만큼 증가 또는 감소했다.
[0330][0330] TIFF 112017061777213-pct00012.tif 198 160
[0331][0331] TIFF 112017061777213-pct00013.tif 204 155
[0332][0332] TIFF 112017061777213-pct00014.tif 206 116
[0333][0333] TIFF 112017061777213-pct00015.tif 85 130
[0334][0334] TIFF 112017061777213-pct00016.tif 206 117
[0335][0335] TIFF 112017061777213-pct00017.tif 82 130
[0336][0336] 고찰
[0337][0337] 여러 박테리아군은 키위 유래 보충제의 섭취 후 풍도가 유의하게 변경된 것으로 확인되었다. 건강한 시험군에서 Clostridiales 는 GOLD(Gold3) 보충 후 2.6% 증가했다. 단, 이러한 증가의 영향은 아직 조사 중이다. FC군에서 F . prausnitzii 상대 풍도는 4주간 골드 키위 기반 GOLD로 보충한 후 유의하게 상승(3.6%)했다.
[0338][0338] 주목할 점은 F. prausnitzii 가 현재 알려져 있는 낙산염 생산자라는 것이다. 낙산염은 대장 상피 세포의 주요 에너지원이며, 염증을 완화하는 역할뿐만 아니라 발암, 병원성 집락형성 및 산화 스트레스를 완화하는 역할도 담당하고 있다(Hamer 등, 2008; Macfarlane 및 Macfarlane 2011). 최근 한 시험에서는 낙산염 생산 박테리움인 Clostridium tyrobutyricum 의 투여가 마우스를 덱스트란 황산 나트륨염 유도 대장염으로부터 보호해준다는 것이 입증되었다(Hudcovic 등, 2012). 따라서 대장에서 F. prausnitzii 양을 증가시키는 것은 낙산염 생산량의 증가를 통해 위장 장애의 증상을 완화하는 데 도움이 될 수 있다.
[0339][0339] 사람 위장관은 약 10 14 개의 미생물학적 세포로 구성되어 있으며(Egert 등, 2006) F. prausnitzii 풍도는 약 5%이기 때문에(Miquel 등, 2013), 이는 곧 약 5조개의 F. prausnitzii 세포 농도와 동일하며, 이로 인해 미생물학적 활성 및 대사에 주목할 만한 영향이 미칠 수 있다. 이 시험에서는 FC군의 모든 샘플에서 F. prausnitzii 의 풍도 비중이 총 5.6%였으며(FC군에서 모든 치료 및 약물제거를 포함하는 모든 샘플을 통틀어 평균 계산) 건강한 시험군에서는 6.1%로 관찰되었다. FC군 참여자들의 샘플은 GOLD 보충제 투여 전에 F. prausnitzii 의 풍도가 3.4%로 비교적 낮았으나 GOLD 치료 후 7.0%로 두 배 증가하였다. 건강한 시험군에서는 7.2%의 수치가 5.3%로 감소하는 것이 관찰되었으며, 그 이유는 베이스라인에서 이미 수치가 높았기 때문일 수 있다. 이는 다른 시험들에서도 관찰된 바 있으며, 이러한 시험들에서는 박테리아군의 베이스라인 농도가 식이 중재에 대한 반응으로 관찰된 효과의 정도에 대해 상당한 영향을 미쳤다(Kolida 등, 2007; Tuohy 등, 2001).
[0340][0340] 치료 후 여러 유기산 간에는 미미한 차이가 있었으며, 이는 유기산 조성 및 농도에 대한 현장 확인의 대용으로 대변 샘플을 이용했기 때문일 수 있다. 유기산 농도는 대장에서 말단쪽에 가까울수록 감소하는데, 이는 이차 발효, 혈류로의 흡수 및/또는 대장세포의 유기산(특히 낙산염) 이용 때문이다(Bach 등, 2000). 그러므로 대변 샘플의 유기산 측정에서는 현장에서의 유기산 농도가 상당히 과소평가될 수 있다(Millet 등, 2010).
[0341][0341] 낙산염은 FC군의 참여자 대변 샘플에서 약간 더 높은 수치로 나타났으며, 이는 F. prausnitzii 풍도가 증가한 점에 부합하였다. 이 시험에서는 어느 군의 대변 샘플에서도 젖산염, 포름산 및 이소발레르산이 검출되지 않았다. 젖산염은 많은 대사 네트워크의 중간물이며 정상 대사 과정에서 미생물총의 요소에 의해 소모되기 때문에 건강한 사람들의 대변 샘플에서는 보통 높은 농도로 검출되지 않는다(Duncan 등, 2004; Belenguer 등, 2011). 포름산도 중간물로서 기능하며 메탄, 이산화탄소 및 수분으로 변환될 수 있을 뿐 아니라 보통 기부에 가까울수록 발효 초기 단계에서만 생산된다(Pryde 등, 2002; Huda-Faujan 등, 2010).
[0342][0342] F. prausnitzii 는 실험실에서 배양하기 어려운 산소 민감성 박테리움임에도 불구하고 대사적인 기능 및 발표 프로파일에 대한 특성이 충분히 규명되어 있다(Duncan 등, 2002). F. prausnitzii 는 장 내에서의 수치적으로 우세하고 낙산염을 생산하는 성질을 지니고 있음에도 불구하고 아직 소화 건강 개선의 용도로 사용된 바가 없다. 여러 위장 장애에서 F. prausnitzii 의 풍도가 대폭 감소하는 것이 관찰된다는 점을 고려할 때, F. prausnitzii 는 프로바이오틱으로 조제하여 IBS 또는 IBD가 있는 사람들에게 투여할 수 있다는 주장이 제시된 바 있다(Sokol 등, 2008; Sartor 2011). 그러나 이러한 노력은 여전히 진행 중이다. 현재 F. prausnitzii 는 산소 민감성으로 인해 프로바이오틱 조성물의 성분으로서 조제하는 데 어려움이 있다.
[0343][0343] 골드 키위 유래 보충제인 GOLD는 공생 F. prausnitzii 의 증식을 선택적으로 촉진시킬 수 있는 수단을 제공하기 때문에 염증 관련 위장 장애에 특히 유용한 것으로 간주된다. 결론적으로 GOLD는 기능성 변비가 있는 참여자들에서 F. prausnitzii 결핍 장내세균총불균형을 개선하였다. 따라서 Gold3 골드 키위 분말은 미생물총을 건강한 상태로 회복시키고 항염적 유익성과 더 높은 현장 낙산염 농도를 제공하는 데 유용하다.
[0344][0344] 예시 9: 사람 임상시험에서의 미생물군유전체 qPCR 분석
[0345][0345] 요약
[0346][0346] 이 시험에서는 사람 중재 시험에서 ACTAZIN™(2400 mg) 및 GOLD(2400 mg) 키위 보충제가 대변의 미생물 농도에 미치는 영향을 조사하였으며 시험관 내 발효 실험이 실시되었다. 그 목적은 키위 기반 중재가 샘플의 미생물학적 조성에 미치는 영향을 확인하는 것이었다. 대장 미생물총 조성의 변화는 이전에 확보된 기존의 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석 데이터을 보완하는 실시간 정량적 중합 효소 연쇄 반응(quantitative polymerase chain reaction: qPCR)으로 확인되었다. 상기의 예 7 및 8을 참조한다.
[0347][0347] 실시간 qPCR은 위장관의 미생물학적 생태학을 조사하는 데 흔히 이용되는 방법이다. 이 방법은 수많은 시험에서 사용되어 왔으며 미생물 수를 정량적으로 나타내줄 수 있다. 정량화는 Roche LightCycler® 480 기기에서 실시되었다. 총 박테리아 외에도 정량화된 개별 박테리아군들은 Clostridium coccoides 군, Lachnospiraceae , Bacteroides - Prevotella - Porphyromonas 군, Bifidobacteria , Lactobacilli 및 Faecalibacterium prausnitzii 였다. 상기의 박테리아군은 시험관 내 발효 작업에서도 정량화되었다. 단, 이전에 이미 검사된 Lactobacilli 는 예외였다.
[0348][0348] 기능적 변비가 있는 시험군에서 F. prausnitzii 의 농도는 GOLD 보충 후에 증가하였으며, 통계적으로 유의한 수준에 약간 못 미쳤다. F. prausnitzii 의 비중이 낮은 점은 위장 장애 및 특히 염증성 병리가 있는 경우와 관련되는 경우가 많았다. GOLD 보충 시 F. prausnitzii 농도가 증가한다는 발견은 염기 서열 분석 데이터에서 확인된 유의한 수준의 풍도 증가와 부합하는 결과로서 GOLD 섭취 시 프리바이오틱 효과를 뒷받침해준다.
[0349][0349] 배경
[0350][0350] 녹색 키위는 대장 환경의 미생물학적 생태학을 변화시키는 것을 비롯해 위장 건강의 여러 측면을 개선하는 것으로 확인되었다(Blatchford 등, 2015a; Blatchford 등, 2015b; Parkar 등, 2012). 이러한 유익성은 소화 저항성 탄수화물(digestion resistant carbohydrates: DRC), 폴리페놀 및 비타민 C의 고유 수치로부터 유래하는 것으로 추측된다(Chan 등, 2007; Ferguson 및 Ferguson 2003). 골드 키위의 유익성에 대해서는 명확하게 확립된 바가 없다. 이 시험은 기존 사람 임상시험에서 확보된 샘플을 이용하여 실시된 실험에 대해 자세히 설명한다(예 5의 설명 참조). 이 무작위배정, 이중맹검, 위약 대조 교차 시험에서는 두 가지의 키위 유래 성분인 ACTAZIN™(녹색 키위) 및 GOLD(Gold3 골드 키위)의 역할이 소화 건강에 미치는 영향을 조사하였다.
[0351][0351] 기존 시험에서 측정된 일차 평가변수는 배변 빈도, 대변 형태 및 삶의 질 점수였다. 상기의 예 5 및 6을 참조한다. 이차 평가변수로는 짧은 사슬 지방산(short-chain fatty acids: SCFAs)을 측정하는 것과 더불어 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석을 통해 대변의 미생물 집단의 상대 풍도에서 나타나는 변화를 측정하는 일이 포함되었다. 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석에서는 샘플들의 미생물학적 생태학에 대한 전반적인 정보(상대 풍도 백분율 형태)가 확보되었으나 정량적 결과는 제공되지 않았디. 상기의 예 7 및 8을 참조한다.
[0352][0352] 따라서 기존 시험에서 확보된 DNA 샘플, 즉, GOLD 2400 mg 중재 전후 샘플( n = 52), ACTAZIN™ 2400 mg 중재 전후 샘플( n = 52) 및 위약 전후 샘플( n = 52)이 현재 시험에 사용되었다. 이러한 샘플들은 qPCR을 이용하여 선택 박테리아군의 농도를 결정하는 데 사용되었다. 이는 샘플 내 박테리아 농도에 대한 정량적 측정치를 제공한다.
[0353][0353] 재료 및 방법
[0354][0354] 이 시험 설계는 예 5에 자세히 설명된 바와 같이 무작위배정 이중맹검 위약 대조 교차 시험으로서 네 주 동안 각기 다른 치료를 사용하고 각 치료 간 두 주간의 약물제거가 이루어지는 것이었다. 중재는 아래 표 13에 제시된 바와 같이 치료 맹검 유지를 위해 동일한 성상으로 조제된 4개의 600 mg 캡슐로 제공되었다. 또한 예 5를 참조한다. 분말화된 성분은 설명과 같이 뉴질랜드 녹색 키위와 골드 키위에 각각 기반하여 조제되었다. 상기의 예시 1 및 5을 참조한다.
[0355][0355] TIFF 112017061777213-pct00018.tif 30 131
[0356][0356] 평가된 일곱 개의 박테리아군 각각에 대해 대표 속으로 선택 박테리아가 사용되었다(표 14). 모든 분리주는 별도 명시 사항이 없는 한 부틸 고무 스토퍼로 밀봉된 Hungate 튜브를 이용하여 하룻밤 동안 37℃에서 무산소로 배양되었다. 모든 배지는 별도 명시 사항이 없는 한 Oxoid(Adelaide, 호주)로부터 확보하였다.
[0357][0357] Lactobacillus reuteri (DPC 16)는 de Man-Rogosa-Sharpe: MRS) 액체 배지에서 배양되었다. Bifidobacterium bifidum (DSM 20082)은 중량 대 용량(w/v) 0.05% L-시스테인 염산염(Sigma-Aldrich)으로 보충된 MRS에서 배양되었다. Roseburia intestinalis (DSM 14610)는 반추위내 세균 배지에서 배양되었다(DSMZ Medium 330). Lachnospira multipara (ATCC 19207)는 여과된 반추위액으로 보충된 RM02 배지에서 배양되었다(Leahy 등, 2010). Bacteroides fragilis (ATCC 25285)는 중량 대 용량(w/v) 0.05% L-시스테인 염산염(Sigma-Aldrich)으로 보충된 Wilkins-Chalgren 무산소성균 액체 배지에서 2일간 배양되었다. Faecalibacterium prausnitzii (DSM 17677)는 중량 대 용량(w/v) 0.5% 효모 추출물, 중량 대 용량(w/v) 0.0005% 헤민(haemin)(Sigma-Aldrich), 중량 대 용량(w/v) 0.0005% 비타민 K(Sigma-Aldrich) 및 0.2% L-시스테인 염산염(Sigma-Aldrich)으로 보충된 뇌심장 침출(brain heart infusion: BHI) 액체 배지에서 배양되었다. Escherichia coli (Nissle)는 산소성 조건 하에 트립틱 소이 액체 배지(tryptic soy broth: TSB)에서 37℃로 배양되었다.
[0358][0358] TIFF 112017061777213-pct00019.tif 221 137
[0359][0359] 프라이머에 대한 각 표준 균주의 특이성은 SnapGene® 소프트웨어( www.snapgene.com )에서 컴퓨터상 분석을 이용하여 평가되었습니다. 세포 밀도는 Neubauer 혈구측정기를 이용하여 확인되었고, 배지는 필요에 따라 1.0 x 10 8 또는 1.0 x 10 9 cells/mL로 희석 또는 농축되었다. 그 후 MO-BIO PowerSoil® DNA 분리 키트(MO-BIO Laboratories, Carlsbad, CA, US # 12888)를 이용하여 DNA가 추출되었다. 표준 곡선은 각 군을 대표하는 박테리아 균주의 희석 시리즈를 이용하여 구성하였다. 샘플과 표준은 Roche LightCycler® 480 실시간 PCR 기기에서 절대 정량화를 통해 3회 반복 검사가 실행되었다. 이중 가닥 DNA 증폭 검출 시에는 Roche SYBR Green I Master Mix(04707516001) 검출 화학이 사용되었다. 총 반응량은 SyBr Green I Master mix 10 μL , 정방향(forward) 프라이머(2.5 μM에서 5X 농축) 4 μL, 역방향(reverse) 프라이머(2.5 μM에서 5X 농축) 4 μL 및 DNA 템플릿 또는 멸균수(템플릿 컨트롤 없음) 2 μL를 포함하여 20 μL였다.
[0360][0360] 각 qPCR 검사에는 5분간의 활성화 주기(95℃) 한 개, 검사 주기 32-40개(95℃(30초)에서의 변성 단계, 표 14에 따른 결합(annealing) 단계, 그리고 1분간 72℃에서의 확장 단계 포함), 그리고 융해 곡선 주기(초당 0.1℃에서 60-95℃, 연속 형광 획득 사용)와 이후 40℃에서의 냉각 주기가 포함되었다. 융해 곡선 Tm 콜링(calling) 주기에서는 표적 생성물과 프라이머 이합체 등의 비특이적 이중 가닥 생성물을 구별할 수 있었다. 프라이머는 PCR 등급수에서 2.5 μM의 농도로 희석되었다. 그 후 1:5 비율로 희석되어 PCR 반응에서 0.5 μM 농축액을 확보하였다.
[0361][0361] 통계 계산은 통계 패키지를 이용하여 R에서 실시되었다 (R Development Core Team 2008). 각 치료 전후 유의한 차이를 평가하는 데는 Wilcoxon 부호 순위(Wilcoxon Signed Rank) 검정이 사용되었다. 시험관 내 발효 시 유의한 차이는 0시점과 다른 시점을 비교하여 확인하였다. R Studio에서 p.adjust 기능의 허위 발견율(False Discovery Rate: FDR) 방법을 이용하여 다수의 비교에 대해 보정한 후에 0.05 미만으로 나타나는 P 값은 유의한 것으로 간주되었다(Benjamini 및 Hochberg 1995).
[0362][0362] 예시 10: 사람 임상시험에서의 미생물군유전체 qPCR 분석 결과
[0363][0363] qPCR 데이터 결과에 따르면 평가된 각 박테리아군마다 상대적으로 안정적인 미생물 프로파일이 확인된다. 각 치료 후에는 적정한 증가 또는 감소가 관찰되었다. 표 15는 건강한 시험군 내 박테리아군별로 계산된 평균 16S rRNA 유전자 복제 수/대변 샘플 그램(LOG 변환)과 각 치료 기간 전후 평균의 표준 오차(standard error of the mean: SEM)를 보여주는 LightCycler® 480 qPCR 데이터이다. 표 16는 기능성 변비군 내 박테리아군별로 계산된 평균 16S rRNA 유전자 복제 수/대변 샘플 그램(LOG 변환)과 각 치료 기간 전후 평균의 표준 오차(standard error of the mean: SEM)를 보여주는 LightCycler® 480 qPCR 데이터이다.
[0364][0364] 표 15와 도 6에서 제시된 바와 같이, 건강한 시험군에서 GOLD 치료 후 총 박테리아, C. coccoides , Lachnospiraceae , Lactobacilli , Bifidobacteria 및 Bacteroides - Prevotella - Porphyromonas 의 적정한 증가가 관찰되었다. 반면에 F. prausnitzii 의 농도는 일정하게 유지되었다. ACTAZIN™ 보충 시에는 총 박테리아, Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas , Lactobacilli , Bifidobacteria 및 F. prausnitzii 군의 미미한 감소가 관찰되었다. 반면에 C. coccoides 군은 일정하게 유지되었고 Lachnospiraceae 군은 약간 증가하였다. 위약 치료 시에는 총 박테리아와 Bacteroides - Prevotella - Porphyromonas 농도가 상승하였고 C. coccoides , Lachnospiraceae , Lactobacilli , Bifidobacteria , 및 F. prausnitzii 군의 농도가 약간 감소하였다.
[0365][0365] 표 16과 도 7에 제시된 바와 같이, 기능성 변비군에서 GOLD 치료 후 총 박테리아, Clostridium coccoides , Lachnospiraceae , Bacteroides - Prevotella -Porphyromonas 및 Lactobacilli 군의 적정한 증가와 Bifidobacterium spp의 미미한 감소가 관찰되었다. F. prausnitzii 농도는 7.03에서 7.45로 가장 많이 증가했으며, 이는 거의 유의성 수준( P = 0.0503)에 근접하였고 16S rRNA 유전자 염기 서열 데이터에서 보고된 유사한 증가 현상과 부합하는 결과였다. 실제 수 증가는 2억 3190만 건의 16S rRNA 유전자 복제 수로서, GOLD 치료 후 179% 증가에 해당한다. ACTAZIN™ 치료 후에는 모든 박테리아군의 감소가 관찰되었다. 기능성 변비가 있는 참여자 아홉 명 중 여덟 명은 GOLD 치료 후 F. prausnitzii 수치가 증가하였다. 도 5c를 참조한다. 위약 치료는 모든 박테리아군의 농도를 상승시켰으나, 예외적으로 Lachnospiraceae 는 일정한 농도를 유지하였다.
[0366][0366] TIFF 112017061777213-pct00020.tif 211 148
[0367][0367] TIFF 112017061777213-pct00021.tif 171 155
[0368][0368] 도 6 및 7은 건강한 시험군과 기능성 변비 시험군에 대한 로그 변환된 데이터 형태와 자연 데이터 형태 모두에서 그래픽상으로 나타나는 박테리아 농도 데이터를 각각 나타낸 것이다. 데이터를 이 형태로 표시하면 시간 경과에 따른 대변의 미생물총 조성 안정도를 선명하게 확인할 수 있다.
[0369][0369] Bacteroides - Prevotella - Porphyromonas 의 박테리아들은 사람 대장 군락 내에서 상당한 양의 일차 분해자들을 구성한다고 알려져 있다. 이 분해자들은 특수화된 제거 체계를 이용하여 비흡수된 탄수화물에 접근하는 데 있어 중요한 역할을 수행한다. 그 중 주요 요소들은 Bacteroides thetaiotaomicron , Bacteroides ovatus 및 acteroides cellulosilyticus 와 같은 셀룰로스, 전분, 이눌린 및 자일란 분해자들이다(Fint 등, 2008; Walker 등, 2008). Roseburia intestinalis , Roseburia inulinovorans , Ruminococcus bromii 및 Ruminococcus flavefaciens 도 C. coccoides 군에 포함되는 주요 일차 분해자들이다(Kurakawa 등, 2015).
[0370][0370] 대장에서 가장 큰 박테리아 하위군인 C. coccoides 군은 일반적으로 총 박테리아 풍도의 25-60%를 차지하며(Hold 등, 2002) 대부분 낙산염 생산자로 구성된다(Louis 및 Flint 2009). 프로바이오틱 상태가 입증된 두 가지 주요 미생물은 Bifidobacteria 와 Lactobacilli 이다. Bifidobacteria 는 건강한 미생물총과 연관되는 경우가 많았던 아세테이트 생산자로서 숙주 건강에 유익한 영향을 줄 수 있다. Lactobacilli 는 수세기 동안 유제품 생산에 사용되어 온 젖산 공생 박테리아군으로 구성되며, 이 박테리아의 프로바이오틱 유효성은 수백 편의 시험에서 연구되었다(Reid 1999).
[0371][0371] 4주간의 Gold3 골드키위 기반 GOLD 보충 후 F. prausnitzii 농도의 증가량은 유의한 수준( P = 0.0503)에 약간 못 미쳤다. F. prausnitzii 는 사람 위장관에서 가장 많은 종 중 하나로, 대개 건강한 성인의 전체 대장 미생물총 가운데 5%를 초과하는 비중을 차지하는 것으로 관찰된다(Miquel 등, 2013). Firmicutes 필룸의 구성 요소인 F. prausnitzii 는 체내 항염 속성이 입증된 사람 대장 공생 서식균이다(Furet 등, 2010; Sokol 등, 2009). F. prausnitzii 는 탄수화물 발효를 통해 낙산염과 더불어 젖산염 및 포름산을 생성한다(Duncan 등, 2002; Duncan 등, 2004). 낙산염은 대장 상피 세포의 주요 에너지원이며, 염증을 완화하는 역할뿐만 아니라 발암, 병원성 집락형성 및 산화 스트레스를 완화하는 역할도 담당하고 있다(Hamer 등, 2008; Macfarlane 및 Macfarlane 2011). GOLD는 공생 F. prausnitzii 의 증식을 선택적으로 자극하기 때문에 염증 관련 위장 장애에 유익한 것으로 간주될 수 있다.
[0372][0372] 요약하자면, qPCR 데이터는 미생물학적 상대 풍도 데이터를 확증해주며, 또한 Gold3 골드 키위 기반 보충제가 기능성 변비를 가진 참여자들의 F. prausnitzii 농도를 증가시킨다는 것을 보여준다. F. prausnitzii 는 대장에서 증식하며 소화관에서의 보호 기능/건강상 유익성을 제공하는 것으로 알려져 있기 때문에, 위의 결과는 곧 유익성을 증명하는 셈이다.
[0373][0373] F. prausnitzii 가 산소에 매우 민감하기 때문에 프로바이오틱 제제로서 형성 및 보관하는 데 어려움이 따른다는 점을 고려하면, 이러한 결과는 유의한 것으로 간주된다(Rigottier-Gois 2013). 그러므로 본 발명의 골드 키위 조성은 다른 방식 하에서 조절하기 어려울 수 있는 F. prausnitzii 농도를 효율적이고 효과적으로 증가시킬 수 있는 수단을 제공한다.
[0374][0374] 당업자는 여기에 제시된 공개물과 개념들을 활용하면 과도한 실험 없이도 다른 실시예와 변형예를 만들어 낼 수 있다. 이러한 모든 실시예와 변형예는 본 발명에 귀속되는 것으로 간주된다.
[0375][0375] 따라서, 당업자는 이 공개물들을 활용함으로써 여기서 설명된 실시예와 실질적으로 동일한 기능 또는 결과를 달성하는 향후 수정예, 대체예 및/또는 변형예들을 각각 해당되는 본 발명의 관련 실시예에 따라 이용할 수 있다는 것을 쉽게 이해하게 될 것이다. 따라서 본 발명의 범위는 여기에 제시되는 물질, 화합물, 수단, 방법 및/또는 단계들의 과정, 제조 및 구성에 대한 수정예, 대체예 및 변형예를 포함한다.
[0376][0376] 참고문헌
[0377][0377] Abdollahi-Roodsaz S, Joosten LA, Koenders MI, Devesa I, Roelofs MF, Radstake TR, Heuvelmans-Jacobs M, Akira S, Nicklin MJ, Ribeiro-Dias F, van den Berg WB 2008. Stimulation of TLR2 and TLR4 differentially skews the balance of T cells in a mouse model of arthritis. Journal of Clinical Investigation 118(1): 205-16.
[0378][0378] Abrahamsson TR, Jakobsson HE, Andersson AF, Bjorksten B, Engstrand L, Jenmalm MC 2012. Low diversity of the gut microbiota in infants with atopic eczema. J Allergy Clin Immunol 129(2): 434-40, 440 e1-2.
[0379][0379] Adaim A. 2010. Investigating the effect of gold kiwifruit consumption on the incidence and symptoms of upper respiratory tract infections in preschool children: a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Masters of Sciences in Human Nutrition and Human Health, Massey University, Auckland, New Zealand.
[0380][0380] Attaluri A, Donahoe R, Valestin J, Brown K, Rao SSC 2011. Randomised clinical trial: dried plums (prunes) vs. psyllium for constipation. Alimentary Pharmacology & Therapeutics 33(7): 822-828.
[0381][0381] Bach Knudsen KE, Jorgensen H, Canibe N. Quantification of the absorption of nutrients derived from carbohydrate assimilation: model experiment with catheterised pigs fed on wheat- or oat-based rolls. The British Journal of Nutrition. 2000; 84: 449-58.
[0382][0382] Backhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, Peterson DA, Gordon JI. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 2005; 307: 1915-20.
[0383][0383] Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate - a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B-Methodological. 1995; 57: 289-300.
[0384][0384] Belenguer A, Holtrop G, Duncan SH, Anderson SE, Calder AG, Flint HJ, et al. Rates of production and utilization of lactate by microbial communities from the human colon. FEMS Microbiol. Ecol. 2011; 77: 107-19.
[0385][0385] Bentley-Hewitt KL, Blatchford PA, Parkar SG, Ansell J, Pernthaner A. Digested and fermented green kiwifruit increases human beta-defensin 1 and 2 production in vitro . Plant Foods for Human Nutrition. 2012; 67: 208-14.
[0386][0386] Blatchford P, Bentley-Hewitt KL, Stoklosinski H, McGhie T, Gearry R, Gibson G, Ansell J 2015a. In vitro characterisation of the fermentation profile and prebiotic capacity of gold-fleshed kiwifruit. Benef Microbes pages 1-12. Published online at DOI: http://dx.doi.org/10.3920/BM2015.0006.
[0387][0387] Blatchford P, Stoklosinski H, Walton G, Swann J, Gibson G, Gearry R, Ansell J 2015b. Kiwifruit fermentation drives positive gut microbial and metabolic changes irrespective of initial microbiota composition. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre 6(1): 37-45.
[0388][0388] Boland, M.J., Hardman, M.J. 1972. Kinetic studies on the thiol protease from Actinidia chinensis . FEBS Letters, 27(2): 282-284.
[0389][0389] Bravo JA, Forsythe P, Chew MV, Escaravage E, Savignac HM, Dinan TG, et al. Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011; 108: 16050-5.
[0390][0390] Buffie CG, Pamer EG. Microbiota-mediated colonization resistance against intestinal pathogens. Nature Reviews Immunology. 2013; 13: 790-801.
[0391][0391] Candela M, Rampelli S, Turroni S, Severgnini M, Consolandi C, De Bellis G, et al. Unbalance of intestinal microbiota in atopic children. BMC Microbiology. 2012; 12: 95.
[0392][0392] Caporaso JG, Bittinger K, Bushman FD, DeSantis TZ, Andersen GL, Knight R. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 2010; 26: 266-7.
[0393][0393] Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 2010; 7: 335-6.
[0394][0394] Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Lozupone CA, Turnbaugh PJ, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011; 108 Suppl 1: 4516-22
[0395][0395] Cardona F, Andres-Lacueva C, Tulipani S, Tinahones FJ, Queipo-Ortuno MI. 2013. Benefits of polyphenols on gut microbiota and implications in human health. Journal of Nutritional Biochemistry, 24: 1415-1422.
[0396][0396] Chan AO, Leung G, Tong T, Wong NY. Increasing dietary fiber intake in terms of kiwifruit improves constipation in Chinese patients. World Journal of Gastroenterology: WJG. 2007; 13: 4771-5.
[0397][0397] Chang C, Lin T, Lu Y, Liu T, Liu J. 2010. Kiwifruit improves bowel function in patients with irritable bowel syndrome with constipation. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition 19(4): 451-457.
[0398][0398] Chassard, C, Dapoigny, M, Scott, KP, Crouzet, L, Del'homme, C, Marquet, P, Martin, JC, Pickering, G, Ardid, D, Eschalier, A, Dubray, C, Flint, HJ and Bernalier-Donadille, A. 2012. Functional dysbiosis within the gut microbiota of patients with constipated-irritable bowel syndrome. Alimentary Pharmacology & Therapeutics 35: 828-838.
[0399][0399] Chen W, Liu F, Ling Z, Tong X, Xiang C 2012. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PloS One 7(6): e39743.
[0400][0400] DeSantis TZ, Hugenholtz P, Larsen N, Rojas M, Brodie EL, Keller K, et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72: 5069-72.
[0401][0401] de Sousa Moraes LF, Grzeskowiak LM, de Sales Teixeira TF, Gouveia Peluzio Mdo C 2014. Intestinal microbiota and probiotics in celiac disease. Clinical Microbiology Reviews 27(3): 482-9.
[0402][0402] de Vos WM, de Vos EA 2012. Role of the intestinal microbiome in health and disease: from correlation to causation. Nutrition Reviews 70 Suppl 1: S45-56.
[0403][0403] de Weerth C, Fuentes S, Puylaert P, de Vos WM 2013. Intestinal microbiota of infants with colic: development and specific signatures. Pediatrics 131(2): e550-8.
[0404][0404] Desbonnet L, Garrett L, Clarke G, Bienenstock J, Dinan TG 2008. The probiotic Bifidobacteria infantis : An assessment of potential antidepressant properties in the rat. Journal of Psychiatric Research 43(2): 164-74.
[0405][0405] Drossman DA. The functional gastrointestinal disorders and the Rome III process. Gastroenterology. 2006; 130: 1377-90.
[0406][0406] Drummond L. 2013. The composition and nutritional value of kiwifruit. Advances in Food and Nutrition Research 68: 33-57.
[0407][0407] Drummond L, Gearry RB. 2013. Kiwifruit modulation of gastrointestinal motility. Advances in Food and Nutrition Research 68: 219-232.
[0408][0408] Duncan SH, Hold GL, Harmsen HJ, Stewart CS, Flint HJ. Growth requirements and fermentation products of Fusobacterium prausnitzii , and a proposal to reclassify it as Faecalibacterium prausnitzii gen. nov., comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2002; 52: 2141-6.
[0409][0409] Duncan SH, Louis P, Flint HJ. Lactate-utilizing bacteria, isolated from human feces, that produce butyrate as a major fermentation product. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70: 5810-7.
[0410][0410] Edgar RC. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 2010; 26: 2460-1.
[0411][0411] Egert M, de Graaf AA, Smidt H, de Vos WM, Venema K. Beyond diversity: functional microbiomics of the human colon. Trends in Microbiology. 2006; 14: 86-91.
[0412][0412] Eidenberger T, Selg M, Fuerst S, Krennhuber K. 2014. In-vitro inhibition of human lipase PS by polyphenols from kiwi fruit. Journal of Food Research. 3(4): 71-77.
[0413][0413] Ferguson AR, Ferguson LR. Are kiwifruit really good for you ? In: Huang HW, editor. Proceedings of the Fifth International Symposium on Kiwifruit. 2003. 131-8.
[0414][0414] Flint HJ, Bayer EA, Rincon MT, Lamed R, White BA 2008. Polysaccharide utilization by gut bacteria: potential for new insights from genomic analysis. Nat Rev Microbiol 6(2): 121-31.
[0415][0415] Fu CJ, Carter JN, Li Y, Porter JH, Kerley MS 2006. Comparison of agar plate and real-time PCR on enumeration of Lactobacillus , Clostridium perfringens and total anaerobic bacteria in dog faeces. Letters in Applied Microbiology 42(5): 490-494.
[0416][0416] Fujimoto T, Imaeda H, Takahashi K, Kasumi E, Bamba S, Fujiyama Y, Andoh A 2013. Decreased abundance of Faecalibacterium prausnitzii in the gut microbiota of Crohn's disease. J Gastroenterol Hepatol 28(4): 613-9.
[0417][0417] Furet JP, Kong LC, Tap J, Poitou C, Basdevant A, Bouillot JL, et al. Differential adaptation of human gut microbiota to bariatric surgery-induced weight loss: links with metabolic and low-grade inflammation markers. Diabetes. 2010; 59: 3049-57.
[0418][0418] Gibson GR, Scott KP, Rastall RA, Tuohy KM, Hotchkiss A, Dubert-Ferrandon A, Gareau M, Murphy EF, Sulnier D, Loh G, MacFarlane S, Delzenne N, Ringel Y, Kozianowski G, Dickmann R, Lenoir-Wijnkoop I, Walker C, Buddington R. 2010. Dietary prebiotics: current status and new definition. Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods, 7: 1-19.
[0419][0419] Geurts L, Neyrinck AM, Delzenne NM, Knauf C, Cani PD. Gut microbiota controls adipose tissue expansion, gut barrier and glucose metabolism: novel insights into molecular targets and interventions using prebiotics. Beneficial Microbes. 2014; 5: 3-17.
[0420][0420] Gostner A, Blaut M, Schaeffer V, Kozianowski G, Theis S, Klingeberg M, et al. Effect of isomalt consumption on faecal microflora and colonic metabolism in healthy volunteers. Br. J. Nutr. 2006; 95: 40-50.
[0421][0421] Guidance for industry: irritable bowel syndrome - clinical evaluation of drugs for treatment. U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/UCM205269.pdf
[0422][0422] Hamer HM, Jonkers D, Venema K, Vanhoutvin S, Troost FJ, Brummer RJ. Review article: The role of butyrate on colonic function. Aliment. Pharmacol. Ther. 2008; 27: 104-19.
[0423][0423] Hazenberg MP, van de Merwe JP, Pena AS, Pennock-Schroder AM, van Lieshout LM. Antibodies to Coprococcus comes in sera of patients with Crohn's disease. Isolation and purification of the agglutinating antigen tested with an ELISA technique. Journal of Clinical & Laboratory Immunology. 1987; 23: 143-8.
[0424][0424] Herlemann DPR, Labrenz M, Juergens K, Bertilsson S, Waniek JJ, Andersson AF. Transitions in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea. ISME Journal. 2011; 5: 1571-9.
[0425][0425] Hold GL, Pryde SE, Russell VJ, Furrie E, Flint HJ 2002. Assessment of microbial diversity in human colonic samples by 16S rDNA sequence analysis. FEMS Microbiol Ecol 39(1): 33-9.
[0426][0426] Huda-Faujan N, Abdulamir AS, Fatimah AB, Anas OM, Shuhaimi M, Yazid AM, et al. The impact of the level of the intestinal short chain fatty acids in inflammatory bowel disease patients versus healthy subjects. The Open Biochemistry Journal. 2010; 4: 53-8.
[0427][0427] Hudcovic T, Kolinska J, Klepetar J, Stepankova R, Rezanka T, Srutkova D, et al. Protective effect of Clostridium tyrobutyricum in acute dextran sodium sulphate-induced colitis: differential regulation of tumour necrosis factor-alpha and interleukin-18 in BALB/c and severe combined immunodeficiency mice. Clinical and Experimental Immunology. 2012; 167: 356-65.
[0428][0428] Husebye E, Hellstroem PM, Sundler F, Chen J, and Midtvedt T. 2001. Influence of microbial species on small intestinal myoelectric activity and transit in germ-free rats. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology 280: G368-G380.
[0429][0429] Hunter DC, Skinner MA, Wolber FM, Booth CL, Loh JMS, Wohlers M, Stevenson LM, Kruger MC. 2012. Consumption of gold kiwifruit reduces severity and duration of selected upper respiratory tract infection symptoms and increases plasma vitamin C concentration in healthy older adults. British Journal of Nutrition 108: 1235- 1245.
[0430][0430] Jeffery IB, O'Toole PW, Ohman L, Claesson MJ, Deane J, Quigley EM, Simren M 2012. An irritable bowel syndrome subtype defined by species-specific alterations in faecal microbiota. Gut 61(7): 997-1006.
[0431][0431] Kalliomaki M, Satokari R, Lahteenoja H, Vahamiko S, Gronlund J, Routi T, Salminen S 2012. Expression of microbiota, Toll-like receptors, and their regulators in the small intestinal mucosa in celiac disease. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 54(6): 727-32.
[0432][0432] L Kaur, SM Rutherfurd, PJ Moughan, L Drummond, and MJ Boland. 2010. Actinidin enhances protein digestion in the small intestine as assessed using an in vitro digestion model, J. Agric. Food Chem. 58 (8): 5074-5080.
[0433][0433] Khalif IL, Quigley EMM, Konovitch EA and Maximova ID. 2005. Alterations in the colonic flora and intestinal permeability and evidence of immune activation in chronic constipation. Digestive and Liver Disease 37: 838-849.
[0434][0434] Koeth RA, Wang Z, Levison BS, Buffa JA, Org E, Sheehy BT, Britt EB, Fu X, Wu Y, Li L, Smith JD, DiDonato JA, Chen J, Li H, Wu GD, Lewis JD, Warrier M, Brown JM, Krauss RM, Tang WH, Bushman FD, Lusis AJ, Hazen SL 2013. Intestinal microbiota metabolism of L-carnitine, a nutrient in red meat, promotes atherosclerosis. Nature Medicine 19(5): 576-85.
[0435][0435] Kok RG, DeWaal A, Schut F, Welling GW, Weenk G, Hellingwerf KJ 1996. Specific detection and analysis of a probiotic Bifidobacterium strain in infant feces. Applied and Environmental Microbiology 62(10): 3668-3672.
[0436][0436] Kolida S, Gibson GR. 2007. Prebiotic capacity of inulin-type fructans. The Journal of Nutrition, 137(11): 2503S-2506S.
[0437][0437] Kolida S, Meyer D, Gibson GR. A double-blind placebo-controlled study to establish the bifidogenic dose of inulin in healthy humans. Eur. J. Clin. Nutr. 2007; 61: 1189-95.
[0438][0438] Koren O, Spor A, Felin J, Fak F, Stombaugh J, Tremaroli V, Behre CJ, Knight R, Fagerberg B, Ley RE, Backhed F 2011. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 Suppl 1: 4592-8.
[0439][0439] Kurakawa T, Ogata K, Matsuda K, Tsuji H, Kubota H, Takada T, Kado Y, Asahara T, Takahashi T, Nomoto K 2015. Diversity of Intestinal Clostridium coccoides group in the Japanese population, as demonstrated by reverse transcription-quantitative PCR. PLoS One 10(5): e0126226.
[0440][0440] Leahy SC, Kelly WJ, Altermann E, Ronimus RS, Yeoman CJ, Pacheco DM, Li D, Kong Z, McTavish S, Sang C, Lambie SC, Janssen PH, Dey D, Attwood GT 2010. The genome sequence of the rumen methanogen Methanobrevibacter ruminantium reveals new possibilities for controlling ruminant methane emissions. PLoS One 5(1).
[0441][0441] Lee YK, Menezes JS, Umesaki Y, Mazmanian SK 2011. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 Suppl 1: 4615-22.
[0442][0442] Lepage P, Hasler R, Spehlmann ME, Rehman A, Zvirbliene A, Begun A, Ott S, Kupcinskas L, Dore J, Raedler A, Schreiber S 2011. Twin study indicates loss of interaction between microbiota and mucosa of patients with ulcerative colitis. Gastroenterology 141(1): 227-36.
[0443][0443] Leung L, Riutta T, Kotecha J, Rosser W. 2011. Chronic constipation: An evidence-based review. The Journal of the American Board of Family Medicine 24(4): 436-451.
[0444][0444] Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI 2006. Microbial ecology - Human gut microbes associated with obesity. Nature 444(7122): 1022-1023.
[0445][0445] Liu LWC. 2011. Chronic constipation: current treatment options. Canadian Journal of Gastroenterology 25(Suppl B): 22B-28B.
[0446][0446] Louis P, Flint HJ 2009. Diversity, metabolism and microbial ecology of butyrate-producing bacteria from the human large intestine. FEMS Microbiol Lett 294(1): 1-8.
[0447][0447] Maccaferri S, Candela M, Turroni S, Centanni M, Severgnini M, Consolandi C, Cavina P, Brigidi P 2012. IBS-associated phylogenetic unbalances of the intestinal microbiota are not reverted by probiotic supplementation. Gut Microbes 3(5): 406-13.
[0448][0448] Macfarlane GT, Macfarlane S. Fermentation in the human large intestine: its physiologic consequences and the potential contribution of prebiotics. J. Clin. Gastroenterol. 2011; 45 Suppl: S120-7.
[0449][0449] R Maddumage, NJ Nieuwenhuizen, SM Bulley, JM Cooney, SA Green, RG Atkinson. 2013. Diversity and relative levels of actinidin, kiwellin, and thaumatin-like allergens in 15 varieties of kiwifruit (Actinidia). J. Agric. Food Chem. 61: 728-739.
[0450][0450] Masella AP, Bartram AK, Truszkowski JM, Brown DG, Neufeld JD. PANDAseq: PAired-eND Assembler for Illumina sequences. BMC Bioinformatics. 2012; 13:31.
[0451][0451] Matsuki T, Watanabe K, Fujimoto J, Miyamoto Y, Takada T, Matsumoto K, Oyaizu H, Tanaka R 2002. Development of 16S rRNA-gene-targeted group-specific primers for the detection and identification of predominant bacteria in human feces. Appl Environ Microbiol 68(11): 5445-51.
[0452][0452] Metcalf AM, Phillips SF, Zinsmeister AR, MacCarty RL, Beart RW, Wolff BG. Simplified assessment of segmental colonic transit. Gastroenterology. 1987; 92: 40-7.
[0453][0453] Millet S, Van Oeckel MJ, Aluwe M, Delezie E, De Brabander DL. Prediction of in vivo short-chain fatty acid production in hindgut fermenting mammals: problems and pitfalls. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2010; 50:605-19.
[0454][0454] Miquel S, Martin R, Rossi O, Bermudez-Humaran LG, Chatel JM, Sokol H, et al. Faecalibacterium prausnitzii and human intestinal health. Current Opinion in Microbiology. 2013; 16: 255-61.
[0455][0455] Monro JA, Mishra S, Venn B. 2010. Baselines representing blood glucose clearance improve in vitro prediction of the glycaemic impact of customarily consumed food quantities. British Journal of Nutrition, 103(2): 295-305.
[0456][0456] Murata Y, Ohmori H, Ichikawa M, Harada A, Agari M, Fukuba H, Yamasaki M, Yasuzawa M, Takemoto M, Ikeda M, Matsumoto N, Tamura T, Sumimoto R, Namba K 2013. Fecal microbiota and fecal characteristics of patients with Parkinson's disease. Journal of Intestinal Microbiology 27(4): 211-215.
[0457][0457] Nadkarni MA, Martin FE, Jacques NA, Hunter N 2002. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology-Sgm 148: 257-266.
[0458][0458] Neufeld KM, Kang N, Bienenstock J, Foster JA 2011. Reduced anxiety-like behavior and central neurochemical change in germ-free mice. Neurogastroenterology and Motility 23(3): 255-64, e119.
[0459][0459] NJ Nieuwenhuizen, R Maddumage, GK Tsang, LG Fraser, JM Cooney, HN De Silva, S Green, KA Richardson, RG Atkinson. 2012. Mapping, complementation, and targets of the cysteine protease actinidin in kiwifruit. Plant Physiology 158(1): 376-388.
[0460][0460] Parkar SG, Rosendale D, Paturi G, Herath TD, Stoklosinski H, Phipps JE, et al. In vitro utilization of gold and green kiwifruit oligosaccharides by human gut microbial populations. Plant Foods for Human Nutrition. 2012; 67: 200-7.
[0461][0461] Parnell JA, Reimer RA. Prebiotic fibres dose-dependently increase satiety hormones and alter Bacteroidetes and Firmicutes in lean and obese JCR:LA-cp rats. The British Journal of Nutrition. 2012; 107: 601-13.
[0462][0462] Paturi G, Butts CA, Bentley-Hewitt KL, Ansell J 2014. Influence of green and gold kiwifruit on indices of large bowel function in healthy rats. J Food Sci 79(8): H1611-20.
[0463][0463] Pryde SE, Duncan SH, Hold GL, Stewart CS, Flint HJ. The microbiology of butyrate formation in the human colon. FEMS Microbiology Letters. 2002; 217: 133-9.
[0464][0464] Qin JJ, Li RQ, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature. 2010; 464: 59-U70.
[0465][0465] R Development Core Team 2008. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. .
[0466][0466] RStudio. RStudio: Integrated development environment for R (Version 0.97.551) Computer software. Boston, MA. http://www.rstudio.org/ . 2012.
[0467][0467] Rajilic-Stojanovic M, Biagi E, Heilig HG, Kajander K, Kekkonen RA, Tims S, et al. Global and deep molecular analysis of microbiota signatures in fecal samples from patients with irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 2011; 141: 1792-801.
[0468][0468] Rajilic-Stojanovic M, de Vos WM. The first 1000 cultured species of the human gastrointestinal microbiota. FEMS Microbiology Reviews. 2014; 38: 996-1047.
[0469][0469] Ramirez-Farias C, Slezak K, Fuller Z, Duncan A, Holtrop G, Louis P 2009. Effect of inulin on the human gut microbiota: stimulation of Bifidobacterium adolescentis and Faecalibacterium prausnitzii . British Journal of Nutrition 101(4): 541-550.
[0470][0470] Rawls JF, Mahowald MA, Ley RE, Gordon JI. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 2006; 127: 423-33.
[0471][0471] Reid G 1999. The scientific basis for probiotic strains of Lactobacillus. Appl Environ Microbiol 65(9): 3763-6.
[0472][0472] Rhee SH, Pothoulakis C, and Mayer EA. 2009. Principles and clinical implications of the brain-gut-enteric microbiota axis. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 6: 306-314.
[0473][0473] Richardson AJ, Calder AG, Stewart CS, Smith A. 1989. Simultaneous determination of volatile and non-volatile acidic fermentation products of anaerobes by capillary gas-chromatography. Lett. Appl. Microbiol. 9: 5-8.
[0474][0474] Rigottier-Gois L. 2013. Dysbiosis in inflammatory bowel diseases: the oxygen hypothesis. The ISME Journal 7: 1256-1261.
[0475][0475] Rinttila T, Kassinen A, Malinen E, Krogius L, Palva A 2004. Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR. Journal of Applied Microbiology 97(6): 1166-1177.
[0476][0476] Rosendale DI, Maddox IS, Miles MC, Rodier M, Skinner M, Sutherland J. 2008. High-throughput microbial bioassays to screen potential New Zealand functional food ingredients intended to manage the growth of probiotic and pathogenic gut bacteria. International Journal of Food Science and Technology, 43(12): 2257-2267.
[0477][0477] Rumah KR, Linden J, Fischetti VA, Vartanian T 2013. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PloS One 8(10): e76359.
[0478][0478] Rush EC, Patel M, Plank LD, Ferguson LR. 2002. Kiwifruit promotes laxation in the elderly. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition 11(2): 164-168.
[0479][0479] Sanchez B, Champomier-Verges MC, Collado Mdel C, Anglade P, Baraige F, Sanz Y, et al. Low-pH adaptation and the acid tolerance response of Bifidobacterium longum biotype longum. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73: 6450-9.
[0480][0480] Sartor RB. Efficacy of probiotics for the management of inflammatory bowel disease. Gastroenterology & Hepatology. 2011; 7: 606-8.
[0481][0481] Saulnier DM, Spinler JK, Gibson GR, Versalovic J. Mechanisms of probiosis and prebiosis: considerations for enhanced functional foods. Curr. Opin. Biotechnol. 2009; 20: 135-41.
[0482][0482] Savino F, Pelle E, Palumeri E, Oggero R, Miniero R 2007. Lactobacillus reuteri (American Type Culture Collection Strain 55730) versus simethicone in the treatment of infantile colic: a prospective randomized study. Pediatrics 119(1): e124-30.
[0483][0483] Scheperjans F, Aho V, Pereira PA, Koskinen K, Paulin L, Pekkonen E, Haapaniemi E, Kaakkola S, Eerola-Rautio J, Pohja M, Kinnunen E, Murros K, Auvinen P 2014. Gut microbiota are related to Parkinson's disease and clinical phenotype. Movement Disorders.
[0484][0484] Schloss PD, Schubert AM, Zackular JP, Iverson KD, Young VB, Petrosino JF. Stabilization of the murine gut microbiome following weaning. Gut Microbes. 2012; 3: 383-93.
[0485][0485] Seeram N. Associate Professor of Bioactive Botanical Research Laboratory, University of Rhode Island. Digestive Health Forum, NutraIngredients-USA, 25 September 2014.
[0486][0486] Singleton, Vernon L, Orthofer, Rudolf, Lamuela-Raventos, Rosa M. 1999. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent 299: 152.
[0487][0487] Skinner MA. 2012. Wellness foods based on the health benefits of fruit: gold kiwifruit for immune support and reducing symptoms of colds and influenza. Journal of Food and Drug Analysis 20(1): 261-264.
[0488][0488] Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, Lakhdari O, Bermudez-Humaran LG, Gratadoux JJ, et al. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 16731-6.
[0489][0489] Sokol H, Seksik P, Furet JP, Firmesse O, Nion-Larmurier I, Beaugerie L, et al. Low counts of Faecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota. Inflammatory Bowel Diseases. 2009; 15: 1183-9.
[0490][0490] Stonehouse W, Gammon CS, Beck KL, Conlon CA, Von Hurst PR, Kruger R. 2012. Kiwifruit: our daily prescription for health. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 91(6): 442-447.
[0491][0491] D Sun-Waterhouse, I Wen, R Wibisono, LD Melton, S Wadhwa. 2009. Evaluation of the extraction efficiency for polyphenol extracts from by-products of green kiwifruit juicing. International Journal of Food Science & Technology. 44(12): 2644-2652.
[0492][0492] Taras D, Simmering R, Collins MD, Lawson PA, Blaut M. Reclassification of Eubacterium formicigenerans Holdeman and Moore 1974 as Dorea formicigenerans gen. nov., comb. nov., and description of Dorea longicatena sp. nov., isolated from human faeces. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2002; 52: 423-8.
[0493][0493] Timm D, Willis H, Thomas W, Sanders L, Boileau T, Slavin J. The use of a wireless motility device (SmartPill(R)) for the measurement of gastrointestinal transit time after a dietary fibre intervention. The British Journal of Nutrition. 2011; 105: 1337-42.
[0494][0494] Tuohy KM, Kolida S, Lustenberger AM, Gibson GR. The prebiotic effects of biscuits containing partially hydrolysed guar gum and fructo-oligosaccharides--a human volunteer study. The British Journal of Nutrition. 2001; 86: 341-8.
[0495][0495] Turnbaugh PJ, Baeckhed F, Fulton L, Gordon JI 2008. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell Host & Microbe 3(4): 213-223.
[0496][0496] Udani J, Bloom D. 2013. Effects of kivia powder on Gut health in patients with occasional constipation: a randomized, double-blind, placebo-controlled study. Nutrition Journal 12(1): 78.
[0497][0497] Vaahtovuo J, Munukka E, Korkeamaki M, Luukkainen R, Toivanen P 2008. Fecal microbiota in early rheumatoid arthritis. Journal of Rheumatology 35(8): 1500-5.
[0498][0498] Vogt JA, Pencharz PB, Wolever TMS. L-Rhamnose increases serum propionate in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 2004; 80: 89-94.
[0499][0499] Walker AW, Duncan SH, McWilliam Leitch EC, Child MW, Flint HJ. pH and peptide supply can radically alter bacterial populations and short-chain fatty acid ratios within microbial communities from the human colon. Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71: 3692-700.
[0500][0500] Walker AW, Duncan SH, Harmsen HJ, Holtrop G, Welling GW, Flint HJ 2008. The species composition of the human intestinal microbiota differs between particle-associated and liquid phase communities. Environ Microbiol 10(12): 3275-83.
[0501][0501] Walker AW, Ince J, Duncan SH, Webster LM, Holtrop G, Ze X, et al. Dominant and diet-responsive groups of bacteria within the human colonic microbiota. ISME Journal. 2011; 5: 220-30.
[0502][0502] Wang L, Christophersen CT, Sorich MJ, Gerber JP, Angley MT, Conlon MA 2011. Low relative abundances of the mucolytic bacterium Akkermansia muciniphila and Bifidobacterium spp. in feces of children with autism. Applied and Environmental Microbiology 77(18): 6718-21.
[0503][0503] Wang T, Cai G, Qiu Y, Fei N, Zhang M, Pang X, Jia W, Cai S, Zhao L 2012. Structural segregation of gut microbiota between colorectal cancer patients and healthy volunteers. ISME Journal 6(2): 320-9.
[0504][0504] Wang Q, Garrity GM, Tiedje JM, Cole JR. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73: 5261-7.
[0505][0505] Williams BL, Hornig M, Parekh T, Lipkin WI 2012. Application of novel PCR-based methods for detection, quantitation, and phylogenetic characterization of Sutterella species in intestinal biopsy samples from children with autism and gastrointestinal disturbances. mBio 3(1).
[0506][0506] Willing BP, Dicksved J, Halfvarson J, Andersson AF, Lucio M, Zheng Z, et al. A pyrosequencing study in twins shows that gastrointestinal microbial profiles vary with inflammatory bowel disease phenotypes. Gastroenterology. 2010; 139: 1844-54 e1.
[0507][0507] Wong JMW, de Souza R, Kendall CWC, Emam A, Jenkins DJA. Colonic health: Fermentation and short chain fatty acids. Journal of Clinical Gastroenterology. 2006; 40: 235-43.
[0508][0508] Wu GD, Chen J, Hoffmann C, Bittinger K, Chen YY, Keilbaugh SA, et al. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science. 2011; 334: 105-8.
[0509][0509] Wu X, Ma C, Han L, Nawaz M, Gao F, Zhang X, Yu P, Zhao C, Li L, Zhou A, Wang J, Moore JE, Millar BC, Xu J 2010. Molecular characterisation of the faecal microbiota in patients with type II diabetes. Current Microbiology 61(1): 69-78.
[0510][0510] Ze X, Duncan SH, Louis P, Flint HJ. Ruminococcus bromii is a keystone species for the degradation of resistant starch in the human colon. ISME Journal. 2012; 6: 1535-43.
[0511][0511] Zoppi G, Cinquetti M, Luciano A, Benini A, Miner A, and Bertazzoni ME. 1998. The intestinal ecosystem in chronic functional constipation. Acta Paediatrica 87: 836-841.
