[0001][0001] 본 발명은 플라보노이드의 효소적 당전이(transglycosylation)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알파-티오글리콜리가제를 이용한 플라보노이드의 A-고리 7-OH 위치에 대한 선택적 O-α-glucosylation을 통하여 플라보노이드 7-O-α-글루코시드를 제조하는 방법에 관한 기술이다.
[0002][0002] 플라보노이드(Flavonoids)는 식물이나 다양한 생물체의 이차대사산물로 존재하는 폴리페놀류이며, 인체의 건강 유지 및 증진에 기능을 가진다(비특허문헌 1). 천연에 존재하는 대부분의 플라보노이드가 갖는 수산기(hydroxyl group) 중 한 개 이상의 수산기가 탄수화물과 공유결합을 형성하고 있는 배당체(glycoside) 형태로 수식되어 있다.
[0003][0003] 이러한 탄수화물에 의한 수식은 수용성 및 안정성 등에 크게 영향을 미치며, 당의 결합구조는 섭취 후 인체 내 흡수 및 생체이용율을 결정하는 매우 중요하다(비특허문헌 2).
[0004][0004] 플라보노이드 배당체의 흡수 기전은 효소적 가수분해에 의해 당이 제거된 비배당체형 플라보노이드가 소장에서 흡수되는 것으로 알려져 있으나, 천연에 존재하는 플라보노이드 배당체는 대부분 베타-글루코시드(β-glucoside)로서 포도당이 베타-글리코시드 결합(β-glycosidic bond)으로 연결되어 있으며, 인체 내에는 이를 가수분해 할 수 있는 효소가 존재하지만 효율이 높지 않으며(비특허문헌 3), 포도당 이외의 다른 당이 결합되어 있는 배당체형 플라보노이드의 경우 가수분해가 용이하지 않으므로 섭취한 플라보노이드 배당체의 가수분해가 효과적으로 일어나지 못하고, 플라보노이드 배당체의 생체 이용율은 섭취량에 비해 매우 낮은 것으로 보고되고 있다.
[0005][0005] 이러한 문제를 해결하기 위해 플라보노이드 비배당체(flavonoid aglycone)에 인체 내 소화효소인 알파-글루코시다제(α-glucosidase)에 의해 가수분해될 수 있도록 알파-글리코시드 결합(α-glycosidic bond)으로 포도당을 플라보노이드 수산기에 도입한 알파-글루코시드(α-glucoside)를 합성하기 위한 기술개발이 보고되었다. 효소를 이용한 알파-글루코시드를 합성함에 있어서 덱스트란수크라제(dextransucrase), 글루칸수크라제(glucansucrase), 및 아밀로수크라제(amylosucrase) 등 sucrose를 기질로 하는 당전이 효소를 이용하여 플라보노이드 배당체를 합성하는 연구가 진행된 바 있다. 이들 당전이 효소를 이용하는 경우 특정한 OH기에 대한 당전이 특이성을 나타내지 않으며, 플라보노이드의 3개 고리 중 A-고리에 위치한 7-OH, B-고리에 위치한 3 또는 4-OH 위치에 포도당을 알파-아노머(α-anomer)로 전이시킨 배당체를 합성한 연구 결과가 보고되었다. 그러나 한 개 이상의 이성질체가 함께 합성되며, 단일 화합물에 대한 수율이 5-70% 수준에 그치고 있다.
[0006][0006] 원래 가수분해 효소인 알파-글루코시다제의 경우 반응 기전 상 당전이 활성을 동시에 가지고 있으나 생성된 당전이 상물이 다시 효소에 의해서 가수분해되므로 당전이 산물을 제조하는데는 부적합하였다. 그러나 알파-글루코시다제의 활성 촉매 아미노산 잔기에 대한 변이를 통해 가수분해 활성을 제거하고 반응성이 높은 당 공여체를 이용하여 당전이 반응만을 촉매하도록 설계된 변이체 효소에 대한 연구가 진행된 바 있다.
[0007][0007] 이러한 변이체 효소들 중 티오글리코리가제의 경우 활성 촉매 아미노산 잔기중 산/염기 촉매잔기를 변이시킨 후 변이체 효소로서 반응성이 높은 당공여체를 사용하면 친핵성 촉매기의 작용에 의해서 당-효소 결합 중간체(glycosyl enzyme intermediate)를 형성한다. 이후 친핵성이 높은 티올(thiol)기를 가지는 당수용체를 첨가하면 산/염기 촉매기의 변이에도 불구하고 티올기의 친핵성 공격으로 인해 중간체가 가진 당이 당수용체의 티올기로 전이되는 반응을 촉매한다 (비특허문헌 4).
[0008][0008] 본 발명자는 알파-글루코시다제를 이용하여 제작한 알파-티오글리코리가제를 이용하여 물보다 pKa값이 낮은 수산기를 한 개 가지는 페놀 화합물(pKa 3 내지 8) 및 아크코르빈산(pKa 4.1)을 당수용체로 사용하여 해당 OH 기에 대한 선택적 당전이 화합물 합성 연구를 진행한 바 있다. 하지만 플라보노이드의 경우 물 보다 낮은 pKa 값을 가지는 수산기를 두 개 이상(pKa 6 내지 9) 가지므로 알파-티오글리코리가제를 이용한 당전이 반응을 통해 어는 위치의 수산기에 당이 전달될 지 특정할 수 없었다.
[0009][0009] 이에, 본 발명의 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 알파-티오글리콜리가제를 이용하면 플라보노이드의 A-고리 7-OH 위치에 대한 선택적 O-α-glucosylation을 통하여 플라보노이드 7-O-α-글루코시드를 우수한 효율로 제조할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
[0010][0010] Spencer, Jeremy PE. Chemical Society Reviews 38.4 (2009): 1152-1161. Hollman, Peter CH, et al. Free radical research 31.6 (1999): 569-573. Nemeth, itti, t l. European journal of nutrition 42.1 (2003): 29-42. Kim, Young-Wan, et al. Journal of the American Chemical Society 128.7 (2006): 2202-2203.
[0011][0011] 본 발명은 상기와 같은 문제점을 고려하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 알파-티오글리콜리가제를 이용한 플라보노이드의 A-고리 7-OH 위치에 대한 선택적 O-α-glucosylation을 통하여 플라보노이드 7-O-α-글루코시드를 우수한 효율로 제조하고자 하는 것이다.
[0012][0012] 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
[0013][0013] 상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α-D-글루코실 플루오라이드(α-D-Glucosyl fluoride) 및 플라보노이드를 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 알파-티오글리콜리가제 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는 플라보노이드 7-O-α-글루코시드의 제조방법을 제공한다.
[0014][0014] 상기 플라보노이드는 플라보놀(flavonol), 플라바논(flavanone), 플라바노놀(flavonol), 플라바놀(flavanol) 및 이소플라본(isoflavone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
[0015][0015] 상기 플라보노이드는 퀘르세틴(quercetin), 캠퍼롤(Kaempferol), 헤스페레틴(hesperetin), 나린제닌(naringenin), 탁시폴린(Taxifolin), 카테킨(Catechin), 에피카테킨(epicatechin), 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 아피제닌(apigenin) 및 에리오딕티올(Eriodictyol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
[0016][0016] 상기 반응은 pH 7.5 내지 10에서 수행되는 것일 수 있다.
[0017][0017] 상기 반응은 pH 8.8 내지 9.5에서 수행되는 것일 수 있다.
[0018][0018] 상기 반응은 10 내지 60 ℃에서 수행되는 것일 수 있다.
[0019][0019] 상기 반응은 DMSO(Dimethyl sulfoxide), DMF(N,N-Dimethyl formamide), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 증류수 또는 이들의 혼합물 존재 하에 수행되는 것일 수 있다.
[0020][0020] 상기 알파-티오글리콜리가제는 설폴로버스 설파타리쿠스( Sulfolobos sulfataricus ) 유래의 것일 수 있다.
[0021][0021] 본 발명에 따르면, 알파-티오글리콜리가제를 이용한 플라보노이드의 A-고리 7-OH 위치에 대한 선택적 O-α-glucosylation을 통하여, 생성된 당전이 산물의 재가수분해를 방지함으로써, 플라보노이드 7-O-α-글루코시드를 우수한 효율로 제조할 수 있다.
[0022][0022] 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[0023][0023] 도 1은 α-D-글루코실 플루오라이드 및 플라보노이드를 각각 당공여체 및 당수용체로 사용하여 MalA-D416A에 의해 플라보노이드 7-O-α-글루코시드를 합성하는 과정을 나타낸 이미지이다. 도 2는 본 발명에 따라 제조된 플라보노이드 7-O-α-글루코시드의 구조 및 분리 수율을 나타낸 이미지이다. 도 3은 pH 5 내지 9에서 당공여체로 α-글루코실 플루오라이드와 당수용체로 퀘르세틴을 사용한 당전이 반응(실시예 1)의 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 분석 결과이다[(A) UV 254nm 광 조사, (B) H 2 SO 4 및 탄화(charring)로 시각화; 레인 1: 1 및 2a(대조군), 레인 2: 1 및 2a(블랭크 반응), 레인 3: pH 5.0에서의 반응 혼합물, 레인 4: pH 6.0에서의 반응 혼합물, 레인 5: pH 7.0에서의 반응 혼합물, 레인 6: pH 8.0에서의 반응 혼합물, 레인 7: pH 9.0에서의 반응 혼합물]. 도 4는 당공여체로 α-글루코실 플루오라이드와 당수용체로 퀘르세틴을 사용할 경우 pH가 당전이 반응 효율에 미치는 영향을 확인한 그래프이다. 도 5는 MalA-D416A에 의한 다양한 플라보노이드에 대한 당전이 산물의, (A) UV 254nm 광 조사 및 (B) H 2 SO 4 및 탄화(charring)로 시각화된, 박층 크로마토그래피(TLC) 분석 결과이다[레인 b: 블랭크 반응, 레인 R: 반응 혼합물, 2a: 퀘르세틴, 3a: 캠페롤, 4a: 헤스페레틴, 5a: 나린제닌, 6a: 텍시폴린, 7a: (+)-카테킨, 8a: (-)-에피카테킨, 9a: 제니스테인, 10a: 다이드제인. 및 당전이 산물은 점선원으로 표시함]. 도 6은 MalA-D416A에 의해 촉매되는 퀘르세틴(2a)의 당전이 (transglucosylation)에 대한 시간 경과 분석 그래프이다[각 반응은 pH 7(●), pH 7.5(○), pH 8(▼), pH 8.5(△), pH 9(■) 및 pH 10(□)에서 진행됨].
[0024][0024] 이하, 본 발명의 실 예를 첨부된 도면들을 참조하여 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 실시예는 여러 가지 형태로 변형할 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래의 실시예들로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 도면에서의 요소의 형상은 보다 명확한 설명을 강조하기 위해 과장되었다.
[0025][0026] 천연에 존재하는 플라보노이드 배당체는 대부분 베타-글루코시드(β-glucoside)로서 포도당이 베타-글리코시드 결합(β-glycosidic bond)으로 연결되어 있으며, 인체 내에는 이를 가수분해할 수 있는 효소가 존재하지만 효율이 높지 않아, 플라보노이드 배당체의 생체 이용율은 섭취량에 비해 매우 낮은 것으로 보고되고 있다.
[0026][0027] 이에 따라, 플라보노이드 비배당체(flavonoid aglycone)에 인체 내 소화효소인 알파-글루코시다제(α-glucosidase)에 의해 가수분해될 수 있도록 알파-글리코시드 결합(α-glycosidic bond)으로 포도당을 플라보노이드 수산기에 도입한 알파-글루코시드(α-glucoside)를 합성하기 위한 기술개발이 보고되었다. 덱스트란수크라제, 글루칸수크라제 및 아밀로수크라제 등 sucrose를 기질로 하는 당전이 효소를 이용하는 경우 특정한 OH기에 대한 당전이 특이성을 나타내지 않으며, 플라보노이드의 3개 고리 중 A-고리에 위치한 7-OH, B-고리에 위치한 3 또는 4-OH 위치에 포도당을 알파-아노머(α-anomer)로 전이시킨 배당체를 합성한 연구 결과가 보고되었으나, 한 개 이상의 이성질체가 함께 합성되며, 단일 화합물에 대한 수율이 5-70% 수준에 그치고 있는 실정이다.
[0027][0028] 상기한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는 술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)의 α-글루코시다제(MalA)로부터 유래된 α-티오글리콜리가제를 이용하여, 높은 당전이 효율 및 플라보노이드의 A-고리 7-OH 위치에 대한 높은 선택성을 나타내는 플라보노이드 7-O-α-글루코시드의 제조방법을 제공하고자 한다.
[0028][0030] 본 발명은 하기 α-D-글루코실 플루오라이드 및 플라보노이드를 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 알파-티오글리콜리가제 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는 플라보노이드 7-O-α-글루코시드의 제조방법을 제공한다.
[0029][0031] 상기 α-D-글루코실 플루오라이드는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
[0030][0032] [화학식 1]
[0031][0033] JPEG pat00001.jpg 35 40
[0032][0034] 본 발명에 따른 플라보노이드 7-O-α-글루코시드의 효소적 제조방법은 다단계의 화학반응을 요구하지 않으며, 비교적 온화한 조건에서 당전이 산물을 합성할 수 있으며, 효소 본연의 입체화학적 특이성에 따라 한 종류의 당쇄만을 합성하므로 특정 당전이 산물의 효율을 높일 수 있다. 구체적으로, 상기 알파-티오글리콜리가제를 당전이 반응의 촉매로 사용할 경우 플라보노이드의 A-고리 7-OH 위치에 대한 선택적 O-α-glucosylation을 통하여, 생성되는 당전이 산물의 재가수분해를 방지함으로써, 단일 당전이 산물인 플라보노이드 7-O-α-글루코시드만을 우수한 효율로 합성하는 효과가 있다(도 1 참조).
[0033][0035] 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 알파-티오글리콜리가제를 사용한 당전이 반응에 있어서 티올기(thiol group)를 가지는 당수용체와 반응해서는 중성 pH에서도 티올기의 탈수소화에 의해 티오디사카라이드(thiodisaccharide)를 합성하지만, 플라보노이드와 같이 OH만으로 구성된 당수용체의 경우 알카리 pH 조건, 바람직하게 pH 9 조건에서 실시하면 플라보노이드가 가지는 수산기의 탈수소화를 촉진하여 당전이 반응을 촉매할 수 있다. 이 때 본 발명에서 사용한 알파-티오글리콜리가제의 경우 플라보노이드가 결합 시 특이적이 결합 모드를 형성함으로써 탈수소화된 7-OH기가 당-효소 결합 중간체가 가지는 글루코실 잔기 방향으로 배향됨으로써 위치 선택적으로 플라보노이드의 7-OH 위치에 대한 당전이 반응을 수행할 수 있다.
[0034][0036] 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 당공여체 및 플라보노이드는 1 : 0.1 내지 1.5, 1: 0.5 내지 1.0 또는 1 : 0.7 내지 0:9의 몰비로 반응시킬 수 있다. 상기 몰비 범위 내에서는 알파-티오글리콜리가제에 의해 당공여체가 가수분해 되는 비율을 적절히 조절함으로써 플라보노이드 7-O-α-글루코시드의 수율을 향상시키는 효과가 있다.
[0035][0037] 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 플라보노이드는 플라보놀(flavonol), 플라바논(flavanone), 플라바노놀(flavonol), 플라바놀(flavanol) 및 이소플라본(isoflavone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
[0036][0038] 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 플라보노이드는 퀘르세틴(quercetin), 캠퍼롤(Kaempferol), 헤스페레틴(hesperetin), 나린제닌(naringenin), 탁시폴린(Taxifolin), 카테킨(Catechin), 에피카테킨(epicatechin), 제니스테인(genistein), 다이드제인(daidzein), 아피제닌(apigenin) 및 에리오딕티올(Eriodictyol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
[0037][0039] 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 반응은 pH 7.5 내지 10, pH 8.8 내지 9.5 또는 pH 8.9 내지 9.2에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 pH 범위 내에서는 당전이 효율이 보다 향상되는 효과가 있다.
[0038][0040] 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 반응은 10 내지 60 ℃, 30 내지 50 ℃ 또는 40 내지 50 ℃에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 반응 온도가 10 ℃ 이상인 경우에는 알파-티오글리콜리가제의 활성이 우수하여 위치 선택적 당전이 반응의 효율이 향상되고, 60 ℃ 이하인 경우에는 당공여체의 비효소적 가수분해를 방지하여 당전이 산물이 높은 수율로 합성되는 효과가 존재한다.
[0039][0041] 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 반응은 DMSO(Dimethyl sulfoxide), DMF(N,N-Dimethyl formamide), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 증류수 또는 이들의 혼합물 존재 하에 수행되는 것일 수 있다. 상기한 종류의 용매를 포함하는 경우, 당전이 반응을 수행하는 수성 완충액에서 플라보노이드의 용해도를 향상시키는 효과가 존재한다. 이와 같이 플라보노이드의 용해도가 향상될 경우 당전이 반응 또한 향상될 수 있다.
[0040][0042] 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 설폴로버스 설파타리쿠스( Sulfolobos sulfataricus ) 유래의 알파-글루코시다제 유전자의 416번째 아미노산 잔기를 아스파테이트에서 알라닌으로 변이시킨 것으로, 알파-글루코시다제 돌연변이 효소(Mal-D416A)의 아미노산 서열이다.
[0041][0043] 상기 당공여체는 상기 알파-티오글리콜리가제에 의해 가수분해될 수 있으며, 상기 알파-티오글리콜리가제는 야생형 알파-글루코시다제 또는 야생형 알파-자일로시다제에 비하여 10 2 내지 10 4 배 낮은 촉매효율(Kcat/KM)로 당공여체를 가수분해하여 당전이(transglycosylation) 생성물을 제조할 수 있다.
[0042][0045] 이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 일 구현예를 이용하여 설명한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에서 설명된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이런 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[0043][0046] 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
[0044][0048] 재료 및 장비
[0045][0049] MalA-D416A(서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 알파-티오글리콜리가제)는 종래 공지된 바에 따라 제조 및 정제하였다[Kim, Young-Wan, et al. Journal of the American Chemical Society 128.7 (2006): 2202-2203.24]. 플래시 크로마토그래피용 플라보노이드 및 실리카 겔(200-425 메쉬)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. HPLC는 SunFire TM C18 5μL 컬럼(4.6 × 150mm; Waters, Milford, MA)이 장착된 YL9100 HPLC 시스템(Younglin, Anyang, Korea)을 사용하여 수행하였다. 생성물을 포름산(0.1%)을 함유한 아세토니트릴/물(30:70, v/v)로 유속 0.8 ml/min -1 로 용출하고 각 플라보노이드 생성물의 최적화된 파장(220-380 nm)에서 자외선(UV) 검출기로 분석하였다. 1 H 및 13 C NMR 스펙트럼은 메탄올-d 4 를 용매로 사용하여 400MHz 분광계(JEOL, Tokyo, Japan)로 기록하였다. 당전이 산물에 대한 질량 데이터는 LTQ XL 선형 이온 트랩 질량 분석기(Thermo Scientific)로 기록하였다. TLC는 포름산(0.1%)을 함유하는 에틸 아세테이트/메탄올/물(17:2:1, v/v/v)을 사용하여 알루미늄 지지 0.2mm 실리카 겔 60F254 시트(Whatman/GE Healthcare)에서 수행하였다. 플레이트를 UV(254nm) 및/또는 메탄올 중 황산(10%)에 노출시킨 후 탄화시켜 가시화하였다.
[0046][0051] <실시예>
[0047][0052] 실시예 1 내지 9. 플라보노이드 7-α-O-글리코시드의 제조
[0048][0053] 30%(v/v) DMSO 및 MalA-D416A(1 mg/mL)를 포함하는 완충액(200 mM)에서 당공여체로 25 mM α-D-글루코실 플루오라이드와 당수용체 20 mM의 반응을 45℃에서 수행하였다. 이 때 사용한 당수용체는 쿼르세틴(quercetin, 실시예 1), 카엠페롤(kaempferol, 실시예 2), 헤스페레틴(hesperetin, 실시예 3), 나린제닌(naringenin 실시예 4), 탁시폴린(taxifolin, 실시예 5), (+)-카테친(catechin, 실시예 6), (-)-에피카테친(epicatechin, 실시예 7), 다이드제인(daidzein, 실시예 8), 및 제니스테인(genistein 실시예 9)이었다.
[0049][0055] 실험예 1. 당전이 산물의 예비 규모 반응(preparative scale reaction) 및 구조 분석
[0050][0056] 30%(v/v) DMSO를 함유하는 Tris-HCl 완충액(5 mL; 0.2 M; pH 9.0) 중 당공여체(α-D-글루코실 플루오라이드((1), 0.125 mmol) 및 당수용체(0.1 mmol)의 혼합물을 MalA-D416A(1 mg)로 처리하고, 혼합물을 45℃에서 2시간 동안 반응하였다. 반응 종료 후 C18 SEP PAK 카트리지(Waters)를 이용하여 반응액 내 미반응 당공여체, DMSO, 단백질 및 염 등 수용성 물질을 제거하고 플라보노이드 글루코시드를 정제하였다. 용매를 감압하에 증발시킨 후, 용매 구배 용리(에틸 아세테이트/메탄올/물, 17:2:1 내지 7:2:1)에 의한 플래시 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 당전이 산물을 분리하였다. 정제된 생성물의 구조는 LC-MS, 1D( 1 H 및 13 C) 및 2D(COSY, HSQC, HMBC 및 NOESY) NMR 스펙트럼에 의해 순차적으로 특성화하였다. 각 당전이 산물의 분리 수율은 대상 플라보노이드를 기질로 하여 분리된 생성물의 중량을 이용하여 계산하였다. 분리된 플라보노이드 7-α-O-글리코시드의 구조 및 분리 수율은 도 2에 나타내었다.
[0051][0057] 도 2를 참조하면, 당전이 상물을 플래시 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 수득한 플라보노이드 7-α-O-글리코시드의 분리 수율은 모두 90%를 초과하였다.
[0052][0059] (1) Quercetin 7-α-O-glucoside ( 2b )
[0053][0060] Yellow powder (42.7 mg, isolation yield 92%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 7.16 (m, 1H, Ph-H2'), 6.92 (m, 1H, Ph-H5'), 6.87 (m, 1H, Ph-H6'), 6.23 (m, 1H, Ph-H6), 5.77 (m, 1H, Ph-H8), 5.52 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H1''), 3.56 (m, 1H, H4''), 3.50 (m, 1H, H3''), 3.41 (m, 3H, H6'' and 2''), 3.32 (m, 1H, H5''). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 176.47 (C=O); 166.94 (C-7), 158.32 (C-5), 157.74 (C-9), 150.83 (C-4'), 148.25 (C-3'), 147.84 (C2), 137.03 (C3), 122.41 (C-1'), 121.03 (C-6'), 116.96 (C-5'), 116.50 (C-2'), 104.66 (C-10), 97.76 (C-6), 94.40 (C-8) (Ph-C); 101.39 (C-1''), 76.85 (C-3''), 74.42 (C-4''), 73.83 (C-5''), 73.17 (C-2''), 61.87 (C-6''). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 21 H 20 O 12 - H + ] - = 463.4; found 463.4.
[0054][0062] (2) Kaempferol 7-α-O-glucoside ( 3b )
[0055][0063] Yellow powder (40.4 mg, isolation yield 90%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 8.05 (m, 2H, Ph-H2' and 6'), 6.83 (m, 2H, Ph-H3' and 5'), 6.68 (m, 1H, Ph-H6), 6.39 (m, 1H, Ph-H8), 5.49 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H1''), 3.62 (m, 1H, H4''), 3.42 (m, 1H, H3''), 3.36 (m, 3H, H6'' and 2''), 3.18 (m, 1H, H5''). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 177.70 (C=O); 167.31 (C-7), 159.72 (C-5), 158.29 (C-9), 155.74 (C-4'), 147.37 (C2), 138.31 (C3), 131.98 (2C), 124.04 (C-1'), 117.33 (2C), 105.17 (C-10), 99.92 (C-6), 95.29 (C-8) (Ph-C); 100.03 (C-1''), 76.21 (C-3''), 74.86 (C-4''), 74.16 (C-2''), 73.69 (C-5''), 62.81 (C-6''). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 21 H 20 O 11 - H + ] - = 447.4; found 447.4.
[0056][0065] (3) Hesperetin 7-α-O-glucoside ( 4b )
[0057][0066] White powder (46.0 mg, isolation yield 99%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 6.97 (m, 1H, Ph-H2'), 6.82 (m, 2H, Ph-H5' and 6'), 6.36 (m, 1H, Ph-H6), 5.72 (m, 1H, Ph-H8), 5.37 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H1''), 5.08 (t, 1H, J = 4.7 Hz, H2), 3.92 (s, 3H, OCH 3 ), 3.86 (m, 1H, H4''), 3.67 (m, 1H, H3''), 3.59 (m, 2H, H6''), 3.44 (m, 1H, H2''), 3.31 (m, 2H, H3), 3.19 (m, 1H, H5''). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 198.50 (C=O); 165.19 (C-7), 162.45 (C-5), 161.99 (C-9), 151.24 (C-4'), 148.17 (C-3'), 132.64 (C-1'), 121.53 (C-6'), 118.95 (C-2'), 116.28 (C-5'), 105.66 (C-10), 98.51 (C-6), 96.46 (C-8) (Ph-C); 97.29 (C-1''), 81.48 (C-2), 76.92 (C-3''), 75.86 (C-4''), 74.68 (C-2''), 73.22 (C-5''), 62.27 (C-6''), 57.24 (OCH 3 ), 43.52 (C-3). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 22 H 24 O 11 - H + ] - = 463.4; found 463.4.
[0058][0068] (4) Naringenin 7-α-O-glucoside ( 5b )
[0059][0069] White powder (42.9 mg, isolation yield 99%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 7.23 (m, 2H, Ph-H2' and 6'), 6.76 (m, 2H, Ph-H3' and 5'), 6.18 (m, 2H, Ph-H6 and 8), 5.47 (d, 1H, J = 3.4 Hz, H1''), 5.19 (t, 1H, J = 5.5 Hz, H2), 3.71 (m, 1H, H4''), 3.56 (m, 1H, H3''), 3.43 (m, 3H, H6'' and 2''), 3.28 (m, 2H, H3), 3.16 (m, 1H, H5''). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 197.29 (C=O); 168.42 (C-7), 161.86 (C-5), 160.42 (C-9), 154.21 (C-4'), 132.60 (C-1'), 130.65 (2C), 118.37 (2C), 104.28 (C-10), 97.18 (C-6), 95.83 (C-8) (Ph-C); 101.29 (C-1''), 79.63 (C-2), 76.10 (C-4''), 75.89 (C-3''), 74.52 (C-2''), 72.77 (C-5''), 64.13 (C-6''), 42.96 (C-3). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 21 H 22 O 10 - H + ] - = 433.4; found 433.4.
[0060][0071] (5) Taxifolin 7-α-O-glucoside ( 6b )
[0061][0072] White powder (46.2 mg, isolation yield 99%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 7.01 (m, 1H, Ph-H2'), 6.86 (m, 1H, Ph-H5'), 6.80 (m, 1H, Ph-H6'), 6.39 (m, 1H, Ph-H6), 5.84 (m, 1H, Ph-H8), 5.45 (m, 1H, H2), 5.41 (m, 1H, H3), 5.36 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H1''), 3.72 (m, 1H, H4''), 3.63 (m, 1H, H3''), 3.55 (m, 2H, H6''), 3.42 (m, 1H, H2''), 3.34 (m, 2H, H3), 3.26 (m, 1H, H5''). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 197.58 (C=O); 167.29 (C-7), 163.77 (C-5), 162.27 (C-9), 148.86 (C-4'), 147.41 (C-3'), 130.37 (C-1'), 120.65 (C-6'), 116.33 (C-2'), 115.24 (C-5'), 101.48 (C-10), 99.85 (C-6), 97.28 (C-8) (Ph-C); 98.26 (C-1''), 86.53 (C-2), 75.73 (C-3''), 74.51 (C-4''), 74.10 (C-2''), 73.74 (C-5''), 70.81 (C-3), 63.62 (C-6''). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 21 H 22 O 12 - H + ] - = 465.4; found 465.4.
[0062][0074] (6) (+)-Catechin 7-α-O-glucoside ( 7b )
[0063][0075] White powder (40.7 mg, isolation yield 90%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 7.14 (m, 1H, Ph-H2'), 6.95 (m, 1H, Ph-H5'), 6.87 (m, 1H, Ph-H6'), 5.81 (m, 1H, Ph-H6), 5.67 (m, 1H, Ph-H8), 5.48 (d, 1H, J = 4.0 Hz, H1''), 5.03 (m, 1H, H2), 4.52 (m, 1H, H3), 3.82 (m, 1H, H4''), 3.64 (m, 1H, H3''), 3.58 (m, 3H, H6'' and 2''), 3.48 (m, 2H, H3), 3.25 (m, 1H, H5''), 2.68 (m, 2H, H4). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 159.35 (C-7), 158.21 (C-5), 157.83 (C-9), 145.26 (C-4'), 145.87 (C-3'), 130.29 (C-1'), 120.93 (C-6'), 116.39 (C-5'), 115.35 (C-2'), 99.52 (C-10), 94.34 (C-6), 92.64 (C-8) (Ph-C); 99.01 (C-1''), 85.49 (C-2), 77.53 (C-3''), 75.28 (C-4''), 73.96 (C-5''), 73.43 (C-2''), 67.36 (C-3), 62.74 (C-6''), 29.28 (C-4). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 21 H 24 O 11 - H + ] - = 451.4; found 451.4.
[0064][0077] (7) (-)-Epicatechin 7-α-O-glucoside ( 8b )
[0065][0078] White powder (44.3 mg, isolation yield 98%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 7.06 (m, 1H, Ph-H2'), 6.82 (m, 1H, Ph-H5'), 6.73 (m, 1H, Ph-H6'), 5.72 (m, 1H, Ph-H6), 5.60 (m, 1H, Ph-H8), 5.45 (d, 1H, J = 3.9 Hz, H1''), 5.01 (m, 1H, H2), 4.46 (m, 1H, H3), 3.78 (m, 1H, H4''), 3.60 (m, 1H, H3''), 3.53 (m, 3H, H6'' and 2''), 3.44 (m, 2H, H3), 3.19 (m, 1H, H5''), 2.62 (m, 2H, H4). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 158.37 (C-7), 158.02 (C-5), 157.29 (C-9), 144.83 (C-4'), 144.17 (C-3'), 129.66 (C-1'), 119.18 (C-6'), 114.76 (C-5'), 114.23 (C-2'), 98.24 (C-10), 94.39 (C-6), 92.20 (C-8) (Ph-C); 100.16 (C-1''), 85.08 (C-2), 76.36 (C-3''), 76.02 (C-4''), 74.59 (C-5''), 73.29 (C-2''), 66.33 (C-3), 60.22 (C-6''), 26.36 (C-4). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 21 H 24 O 11 - H + ] - = 451.4; found 451.4.
[0066][0080] (8) Genistein 7-α-O-glucoside ( 9b )
[0067][0081] White powder (41.0 mg, isolation yield 95%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 8.12 (s, 1H, C=CH), 7.37 (m, 2H, Ph-H2' and 6'), 6.83 (m, 2H, Ph-H3' and 5'), 6.72 (m, 1H, Ph-H6), 6.58 (m, 1H, Ph-H8), 5.48 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H1''), 3.52 (m, 1H, H4''), 3.46 (m, 1H, H3''), 3.39 (m, 3H, H6'' and 2''), 3.31 (m, 2H, H3), 3.14 (m, 1H, H5''). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 180.74 (C=O); 167.21 (C-7), 161.63 (C-5), 157.73 (C-9), 156.23 (C-4'), 153.28 (C2), 131.82 (2C), 125.89 (C3), 124.44 (C-1'), 117.12 (2C), 104.63 (C-10), 97.28 (C-6), 94.51 (C-8) (Ph-C); 100.64 (C-1''), 75.51 (C-3''), 74.68 (C-4''), 74.07 (C-2''), 72.68 (C-5''), 61.33 (C-6''). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 21 H 20 O 10 - H + ] - = 431.4; found 431.4.
[0068][0083] (9) Daidzein 7-α-O-glucoside ( 10b )
[0069][0084] White powder (38.3 mg, isolation yield 92%). 1 H NMR (methanol-d 4 , 400 MHz): 8.28 (s, 1H, C=CH), 8.01 (m, 1H, H5), 7.32 (m, 2H, Ph-H2' and 6'), 7.14 (m, 1H, Ph-H6), 7.03 (m, 1H, Ph-H8), 6.78 (m, 2H, Ph-H3' and 5'), 5.56 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H1''), 3.63 (m, 1H, H4''), 3.56 (m, 1H, H3''), 3.45 (m, 3H, H6'' and 2''), 3.37 (m, 2H, H3), 3.24 (m, 1H, H5''). 13 C NMR (methanol-d 4 , 100 MHz): 178.26 (C=O); 166.73 (C-7), 158.34 (C-9), 157.59 (C-4'), 153.27 (C2), 130.69 (2C), 129.57 (C-5), 125.49 (C-1'), 123.74 (C3), 118.69 (C-10), 117.73 (2C), 115.48 (C-6), 99.36 (C-8) (Ph-C); 105.83 (C-1''), 76.35 (C-3''), 74.93 (C-4''), 73.74 (C-2''), 72.02 (C-5''), 61.40 (C-6''). HMBC shows H1'' coupled with C7 and H8 coupled with C1''. NOESY shows H8 coupled with H1''. ESI-MS: calc. for [C 21 H 20 O 9 - H + ] - = 415.4; found 415.4.
[0070][0086] 실험예 2. 당공여체로 퀘르세틴을 사용한 실시예 1의 TLC 분석
[0071][0087] 실시예 1에서 수행한 바와 같이, α-D-글루코실 플루오라이드를 당공여체로 하여 퀘르세틴(2a, 플라보놀 계열에 속함)의 당전이(glucosylation)을 수행하였다. 일반적으로 효소 반응에서 공용매로 사용되는 DMSO를 첨가(30% [v/v])하여 수성 완충액에서 플라보노이드의 용해도를 높였고, 반응 결과를 TLC로 확인하여 도 3에 나타내었다.
[0072][0088] 반응은 종래 야생형(wide-type) MalA의 가수분해 활성을 위한 최적 pH로 보고된 pH 5에서 수행하였다[Choi, Kyoung-Hwa, Sungmin Hwang, and Jaeho Cha. Journal of bacteriology 195.8 (2013): 1789-1799.]. 그러나 도 3을 참조하면, TLC에서는 명백한 당전이 산물이 검출되지 않았다(레인 3). 대조적으로, pH 7-9(레인 5 내지 7)에서 당전이 산물(2b)에 상응하는 투명한 UV 활성 반점이 나타났고, 반점의 강도는 pH 8 및 9에서 강화됨을 확인하였다. 이는 pH 7보다 더 염기성인 pH에서 퀘르세틴(2a)의 OH기의 탈양성자화가 MalA-D416A에 의한 O-글루코실화에 중요한 역할을 한다는 것을 의미할 수 있다.
[0073][0089] 또한, MalA-D416A를 사용한 본 발명의 당전이 반응에서는 특이하게도 종래의 다른 효소적 당전이 반응 결과와 달리, 단 하나의 당전이 산물만이 검출됨을 확인하였다.
[0074][0091] 실험예 2. 퀘르세틴 7-α-O-글리코시드 합성에 대한 pH 영향 분석
[0075][0092] 최적의 pH를 결정하기 위해 pH 6 내지 10 및 45 °C 조건으로 반응을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 당전이 산물(퀘르세틴 7-α-O-글리코시드)의 양은 표준으로서 실험예 1의 예비 규모 반응(preparative scale reaction)으로부터 정제된 화합물을 사용하여 생성된 검량선(calibration curve)을 사용하여 HPLC에 의해 결정하였다. 반응의 초기 속도(rate)는 초기 플라보노이드의 10% 소비 내 데이터로 선형 회귀(linear regression)에 의해 결정하였다.
[0076][0093] 도 4를 참조하면, 실시예 1로부터 분리된 당전이 산물을 표준으로 사용하여 HPLC에 의해 결정된 반응의 초기 속도는 pH 9 및 45℃에서 가장 높았다. pH 10에서 속도의 감소는 기본 조건에서 자발적 가수분해의 향상으로 인한 당공여체의 불안정성으로 설명될 수 있다.
[0077][0094] 플라보노이드의 7-OH기를 활성화시키는 일반 염기 촉매로서 활성 부위의 또 다른 아미노산 잔기의 역할 가능성을 조사하기 위해, para-nitrophenyl α- 및 β-D-글루코피라노시드(glucophyranoside)를 당수용체로 사용하여 제어 반응을 수행하였으나, 당전이 산물이 생성되지 않았다. 이에 따라, MalA-D416A는 일반적인 염기 촉매 잔기의 도움 없이, 글루코실 중간체의 글루코실 모이어티를 염기성 pH에서 플라보노이드의 탈양성자화된 OH기로 글루코실 중간체의 글루코실 부분을 전달할 수 있으며, MalA-D416와 플라보노이드의 특이적 결합특성에 따라 7-OH에 위치 특이적으로 글루코실 부분이 전달됨을 확인하였다.
[0078][0096] 실험예 3. MalA-D416A의 기질 스펙트럼을 조사를 위한 TLC 분석
[0079][0097] 플라보노이드 O-α-글루코사이드 합성에서 MalA-D416A의 기질 스펙트럼을 조사하기 위해, 실시예 1과 더불어 실시예 2 내지 9의 당수용체를 사용한 당전이 반응 결과를 확인하기 위하여 TLC 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다[퀘르세틴 2a(플라보놀, 실시예 1), 카엠페롤 3 a(플라보놀, 실시예 2, 헤스페레틴 4a(플라바논, 실시예 3), 나린제닌 5a(플라바논, 실시예 4), 탁시폴린 6a(플라바노놀, 실시예 5), (+)-카테친 7a(플라바놀, 실시예 6), (-)-에피카테친 8a(플라보놀, 실시예 7), 다이드제인 9a(이소플라본, 실시예 8), 및 제니스테인 10a(이소플라본, 실시예 9)].
[0080][0098] 도 5를 참조하면, 반응의 단일 당전이 산물만 UV 광 하에서 TLC 플레이트에서 검출되어, 트랜스글리코실화에 사용된 모든 플라보노이드는 매우 잘 반응하였음을 확인하였다. 반응 혼합물을 LC-MS로 분석했을 때, 단일 글루코실 모이어티를 갖는 글루코시드에 상응하는 피크만이 검출되었고, 하나 이상의 글루코실 모이어티를 갖는 글루코시드와 관련된 피크는 검출되지 않았다(도면 미도시).
[0081][0100] 실험예 4. 퀘르세틴 7-α-O-글리코시드 합성에 대한 반응시간 영향 분석
[0082][0101] 최대 수율을 얻기 위한 최적의 반응 시간을 결정하기 위해, 실시예 1과 같이 당공여체로 25 mM α-D-글루코실 플루오라이드(1)와 20 mM 퀘르세틴을 기질로 사용하여 당전이(transglucosylation) 반응을 다양한 pH에서 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
[0083][0102] 도 6을 참조하면, 당전이 활성에 대한 pH 분석(도 3)에서 예상한 바와 같이, pH 9에서 생성물 형성이 다른 pH에서보다 가장 빨랐으며, 최대 수율은 2시간 반응 후 HPLC 분석에 의해 99.7%로 확인하였다. pH 8 및 8.5에서는 느린 반응 속도로 인해 최대 수율(각각 98 및 99% HPLC 분석)을 얻기 위해 pH 9에서보다 더 긴 반응 시간이 소요되었고, 최대 수율점 이후에는 당전이 산물의 가수분해가 관찰되어 수율이 약간 감소하였다.
[0084][0104] 따라서, 본 발명에 따라 서열번호 1로 표시되는 알파-티오글리콜리가제(MalA-D416A)를 이용하여, 플라보노이드의 A-고리 7-OH 위치에 대한 선택적 당전이 반응을 수행할 수 있고, 이에 따라, 단일 당전이 산물로서 플라보노이드 7-O-α-글루코시드만을 우수한 효율로 제조할 수 있음을 확인하였다.
[0085][0105] 이상의 상세한 설명은 본 발명을 예시하는 것이다. 또한 전술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명하는 것이며, 본 발명은 다양한 다른 조합, 변경 및 환경에서 사용할 수 있다. 즉 본 명세서에 개시된 발명의 개념의 범위, 저술한 개시 내용과 균등한 범위 및/또는 당업계의 기술 또는 지식의 범위 내에서 변경 또는 수정이 가능하다. 저술한 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 구현하기 위한 최선의 상태를 설명하는 것이며, 본 발명의 구체적인 적용 분야 및 용도에서 요구되는 다양한 변경도 가능하다. 따라서 이상의 발명의 상세한 설명은 개시된 실시 상태로 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 또한 첨부된 청구 범위는 다른 실시 상태도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
