Neurofibromatosis type 2 is a hereditary disease with predisposition to the development of multiple tumors of the central and peripheral nervous system. The disease is characterized by significant variability in the clinical picture; the number of neoplasms, their location, and growth rate largely determine the severity of the course. However, assessing the rate of tumor growth requires the availability of a consistent series of instrumental studies conducted within a certain time range, which is not always available at the time of initial treatment. In this study, on the basis of quantitative (age of onset, age of examination) and qualitative (large number of intracranial tumors, large number of spinal tumors, severity of neurological symptoms, mosaic status of the genetic variant) characteristics, an alternative classification of clinical subtypes of neurofibromatosis type 2 was developed. We have revealed statistically significant differences (p-value = 0.037) in the representation of Halliday prognostic classes between the groups identified using the proposed classification, which allows us to suggest the possibility of integrating this approach into clinical practice.

The rate of complete pathomorphological response to neoadjuvant chemotherapy (NACT) in triple-negative breast cancer is low and ranges from 30 to 40%. At the same time, to date, there are practically no predictive markers of the effectiveness of NACT for this subtype of tumors. We suggest an approach to the identification of prognostic epigenetic markers of the sensitivity of triple-negative breast tumors to NACT, which can be diagnosed using methylation sensitive PCR. We have selected markers from the XmaI-RRBS genome-wide bisulfite DNA sequencing dataset performed for tumor biopsies obtained from 34 patients before the initiation of NACT and for six samples of normal breast tissue. The patients were divided into groups of responders (complete pathological response) or nonresponders (presence of residual tumor). CpG dinucleotides were identified, the differential methylation of which distinguishes samples of triple-negative tumors with different sensitivity to NACT, and a panel of methylation markers was developed, including regions of CpG islands of the RUSC1/RUSC1-AS1, MXRA5, and ANKRD46 genes, the design of which meets the requirements for the test systems based on methylation sensitive PCR. The estimated diagnostic accuracy of a panel of these three methylation markers is 0.79 (cvAUC = 0.80, 95% CI: 0.79–0.82).

Введение. Метод метилчувствительной количественной ПЦР (МЧ-кПЦР) в режиме реального времени впервые описан в настоящей работе в многолокусном формате с использованием TaqMan-зондов. Многолокусный формат реакции облегчает тестирование больших выборок пациентов и способствует бережному расходованию коллекционных образцов биологического материала, а также позволяет включать в состав тест-систем необходимые контроли, обеспечивающие оценку полноты гидролиза матрицы и эффективности ПЦР. Цель: разработать тест-систему многолокусной МЧ-кПЦР для количественного анализа уровня метилирования ДНК и охарактеризовать её аналитические свойства. Методы. Материалом исследования служили смеси ДНК с заданным уровнем метилирования (препаратов ДНК, гидролизованных и негидролизованных метилчувствительной рестриктазой). Считали, что ДНК, необработанная метилчувствительной рестриктазой BstHHI, является модельной метилированной матрицей, в то время как гидролизованная ДНК - модельной неметилированной матрицей. МЧ-кПЦР проводили для двух целевых локусов - участков CpG-островков генов PRKCB и GMDS с включением положительного внутреннего контроля эффективности ПЦР и контроля полноты гидролиза геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой рестрикции. Для кинетических кривых исследуемых локусов с помощью пакета qpcR языка программирования R во всех образцах получены значения Cy0, и на основе этих данных рассчитали уровни метилирования модельных препаратов с заданными уровнями метилирования. Аналитическую чувствительность метода определяли путем нахождения значений Limit of Blank (LoB, измеряемое значение при отсутствии метилирования) и Limit of Detection (LoD, наименьший измеряемый уровень метилирования). Результаты. Определены аналитические свойства метода МЧ-кПЦР: аналитическая чувствительность составила 5%; относительная погрешность составила 11,38%; коэффициент детерминации (R2) для локусов PRKCB и GMDS составил 0,98 и 0,77, соответственно. Результаты измерений по локусу GMDS позволили предположить его моноаллельное метилирование в нормальных лимфоцитах крови, что было подтверждено анализом баз данных метилома человека. Исходя из полученных результатов, аналитическая чувствительность метода МЧ-кПЦР выше таковой метода прямого бисульфитного секвенирования по Сэнгеру и не уступает методу бисульфитного пиросеквенирования. Background. The method of multiplex methylation sensitive quantitative real-time PCR (MS-qPCR) is used for the first time in the format of a multiplex system with TaqMan probes. The previously described approaches to MSRE-qPCR are insufficient for the implementation of the technique in studies of large samples of patients, which is due to the lack of a multiplex reaction format and internal controls. We propose an MS-qPCR method with the possibility of multiplexing and the presence of internal PCR controls. Aim: to characterize the analytical properties of the developed multiplex MS-qPCR method. Methods. DNA from lymphocytes from healthy donors was used as a material for the study. We have postulated that DNA undigested with methylation sensitive restriction enzyme is a model methylated template (undigested), while hydrolyzed DNA is a model unmethylated template. To determine the analytical sensitivity, mixtures of digested and undigested DNA were used. Development of the MS-qPCR panel was carried out taking into account the design requirements developed by the team: the inclusion of a positive internal control of the PCR efficiency and a control of digestion of genomic DNA by the methylation sensitive restriction enzyme. For the kinetic curves of the studied loci in all samples, Cy0 values were obtained using the qPCR package of the R programming language, and on the basis of these data, methylation levels were calculated, and box plots were presented. The analytical sensitivity of the method was determined by finding the Limit of Blank (LoB) and Limit of Detection (LoD) values. Results. The coefficient of determination (R2) for the normally non-methylated locus is 0.98, and for the locus with normal monoallelic methylation, 0.77. Analytical sensitivity of the MS-qPCR method is 5%; the relative error was 11.38%. Conclusions. Based on the results obtained, the analytical sensitivity of the MS-qPCR method is higher than that of the direct Sanger bisulfite sequencing, and comparable to bisulfite pyrosequencing. The use of TaqMan probes allows multiplexing of several target loci in one reaction, which is a fine solution to the problem of a small amount of available biological material.

Emergence of genome-wide DNA methylation screening techniques allowing identification of differentially methylated regions that discriminate groups of clinically different samples has stimulated development of epigenetic diagnostic tests, especially for applications in cancer diagnostics. Translation of markers identified on genome-wide datasets into clinically applicable tests requires specific test systems design and validation on independent cohorts. Objective of this study was to select DNA methylation markers for prediction of luminal B breast cancer (BC) neoadjuvant chemotherapy (NACT) response from the genome-wide DNA methylation sequencing results; to design quantitative PCR assays for their detection, and to estimate their diagnostic values in order to provide a panel for accurate prediction of response to NACT. Genome-wide methylation analysis of 43 luminal B subtype BC biopsy specimens taken before NACT was performed by bisulfite sequencing (XmaI-RRBS). Informative DNA methylation markers were selected from XmaI-RRBS data using the Wilcoxon–Mann–Whitney test. For these markers, Methylation Sensitive Restriction Enzyme qPCR (MSRE-qPCR) assays were designed and an independent cohort of 35 luminal B samples was assessed. Most informative markers were combined in panels and assessed by multiplex MSRE-qPCR. The area under the ROC curve (AUC) with cross-validation was calculated for each panel. Best NACT response DNA methylation classifier for luminal B breast cancer includes CpG islands of TTC34, LTBR and CLEC14A genes. For LTBR, lower methylation levels predict higher NACT efficacy, with AUC of 69%, while for TTC34 and CLEC14A higher NACT efficacy was associated with higher methylation levels, with AUCs of 56% and 57% respectively. Combination of the three markers in a panel enhances diagnostic values to AUC of 76%, sensitivity of 70% and specificity of 79%. A three-gene DNA methylation markers panel including TTC34, LTBR and CLEC14A genes accurately predicts luminal B breast cancer response to NACT and is adapted for potential clinical application, being implemented as a multiplex MSRE-qPCR assay for use with real-time PCR instruments.

The hormonal therapy is among the most effective treatment of the hormone-dependent breast cancer however its efficiency is limited by the acquired resistance to the hormonal drugs. Previously we have shown the exosomes involvement in the transferring of the hormonal resistance from the resistant to the sensitive cells, and here the study of the features of the exosomes of the resistant cells was performed. Experiments were performed on the MCF-7 breast cancer cells, MCF-7/T resistant subline developed under long-term tamoxifen treatment, and MCF-7/exoT resistant subline developed under resistant exosomes treatment. Exosomes were prepared from the conditioned medium by the differential ultracentrifugation, and exosome imaging was carried out by transmission electron microscope. The analysis of exosomal microRNAs was performed by HiSeq2500 and at least 5 million reads per samples were obtained. Library preparation was carried out with NEBNext® Small RNA Library Prep Set for Illumina® (E7330S). More than 2500 miRNAs were identified in the exosomal samples. DNA methylation was evaluated by the RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing) method. The analysis of the exosomal microRNAs revealed 471 microRNAs over-expressed in the exosomes of the resistant cells. Among them, three DNMT1/3-targeting microRNAs - miR-148b-3р, miR-193a and miR-383, were identified. The subsequent analysis of the cellular proteins revealed the decreased expression of DNMT1/ DNMT3 both in the primary-resistant MCF-7/T cells and in the exosome-treated MCF-7/exoT cells. The suppression of DNMT1/3 correlated with the hypomethylation of particular CpG islands in DNA of the resistant cells. Taken together, the results obtained demonstrate the important role of the DNA (de)methylation in the exosome-mediated transferring and maintaining of the hormone resistance in the breast cancer cells.

Epigenetic processes play a significant role in carcinogenesis, cancer recurrence and metastasis, and may serve as useful clinical biomarkers. Analysis of epigenetic regulator (ER) genes mutation landscape in gastric cancer (GC) samples may reveal novel genetic variants and therapeutic targets. This study presents an application of epigenetic regulators targeted NGS panel to GC patients. We investigated somatic mutations of 25 epigenetic regulation genes using the NGS panel in 95 gastric cancer samples. We revealed 1995 unique variants: 301 synonymous substitutions, 414 nonsynonymous substitutions, 34 nonsense mutations in 95 samples of gastric cancer. For further analysis, we selected frame shift mutations, nonsense and missense not annotated in the ClinVar, COSMIC, dbSNP databases and/or substitutions with MAF frequency < 0.0005. We studied survival the survival of patients using the Kaplan-Meier method. Based on these criteria, we identified 60 somatic mutations in 45/95 (48%) samples; in 50/95 (52%) samples, we did not find the corresponding mutations. All identified somatic variants were verified in tumor non-tumor tissue by Sanger sequencing. Somatic mutations are distributed as follows KMT2D -8, ARID1A-7, CHD7-6, KMT2A-6, KMT2C-5, CHD5-4, DNMT3B-3, MBD1-3, ARID2-2, CREBBP-2, SMARCA2-2, SMARCA4-2, HDAC2-2, CHD4-2, SIRT1-2, DNMT1- 1, TET1-1, EP300-1, EZH-1. All identified variants were investigated using the predictor programs PolyPhen2, PROVEAN, SNPs & GO, and MutPred2 and analyzed for pathogenicity. 28/60 mutations were identified as pathogenic, 9/28 (32%) were verified in non-neoplastic tissue, and were germline variants with a low frequency, or previously not described germline variants. 23/60 (38%) of the identified variants are new, not described in the databases. When assessing the survival of patients using the Kaplan-Meier method, we showed that survival was significantly reduced in the presence of somatic mutations in the epigenetic regulation genes and tumor size of T4, compared with the T4 group without mutations (p = 0.043), patients have mutations in the ER genes and distant metastases (M1), compared with the group without mutations (p < 0.0001). It was also revealed that mutations in ARID1A prevail in patients with distant metastases (p = 0.03). Although, of course, clinical associations are somewhat premature, since the group of patients is not very large yet.

Цель. Изучение изменений в образцах злокачественных опухолей молочной железы статуса метилирования остатков цитозина в составе CpG-островков, моноаллельно метилированных в норме. Методы. Для определения CpG-динуклеотидов, моноаллельно метилированных в опухолевых и нормальных тканях молочной железы, использовали полученные авторами ранее результаты широкогеномного бисульфитного секвенирования Xmal-RRBS. Изменения моноаллельного метилирования в опухолях визуализировали с помощью гистограмм для различных метилотипов молочной железы. Результаты. В геномах умеренно метилированных опухолей нормально моноаллельно метилированные CpG-динуклеотиды имеют тенденцию к почти равновероятному изменению как в неметилированное, так и в полностью метилированное состояния. В геномах гиперметилированных опухолей нормально моноаллельно метилированные CpG-динуклеотиды чаще меняют своё состояние на полностью метилированное. Заключение. Наблюдаемый характер изменений позволяет предположить, что динамика диктуется в умеренно метилированных опухолях процессами, не определяющими её вектор, а в гиперметилированных - дополнительно - направленным процессом, повышающим уровень метилирования CpG-динуклеотидов. По аналогии с ранее опубликованными результатами исследования динамики изменений метилирования импринтированных локусов в опухолях человека, мы предполагаем, что процесс случайного определения вектора изменения характера метилирования опосредован нарушениями копийности участков моноаллельного метилирования ДНК. Причиной равновероятных разнонаправленных изменений моноаллельного метилирования может быть геномный дисбаланс, который может случайным образом приводить к делециям (или приобретенной однородительской дисомии) либо метилированного, либо неметилированного аллеля. Aim: to evaluate changes in the methylation status of cytosine residues in CpG islands, monoallelically methylated in the norm, in samples of malignant breast tumors. Methods. To determine CpG dinucleotides monoallelically methylated in tumor and normal breast tissues, we used the results of Xmal-RRBS genome-wide bisulfite sequencing obtained earlier. Changes in monoallelic methylation in tumors were visualized using histograms for different breast methylotypes. Results. In the genomes of moderately methylated tumors, normally methylated CpG dinucleotides have a tendency to an almost equiprobable methylation change to both the unmethylated and fully methylated states. In the genomes of hypermethylated tumors, normally monoallelically methylated CpG dinucleotides more often change their state to fully methylated. Conclusions. The observed nature of the changes suggests that the dynamics is dictated in moderately methylated tumors by processes that do not determine their vector, and in hypermethylated tumors, additionally, by a directed process that increases the methylation level of CpG dinucleotides. By analogy with the previously published results of a study of the dynamics of changes in methylation of imprinted loci in human tumors, we assume that the process of random determination of the vector of methylation changes is mediated by copy number aberrations at the regions of monoallelic DNA methylation. The reason for the equally probable bidirectional changes in monoallelic methylation may be a genomic imbalance that can randomly lead to deletions (or acquired uniparental disomy) of either the methylated or unmethylated allele.

Введение. Спорадическая ретинобластома развивается в результате мутаций de novo в обоих аллелях гена RB1 в клетках сетчатки глаза. При спорадической ретинобластоме первоначальная мутация в гене RB1 нередко является мозаичной, то есть образуется в постзиготической ранней эмбриональной клетке, что приводит к неравномерному распределению мутантных клонов между различными тканями организма. Возможность идентифицировать мозаичный вариант мутации в гене RB1 имеет значение как для медико-генетического консультирования, так и для клинического ведения пациентов, поскольку мозаицизм влияет на развитие клинической картины заболевания, риск развития опухоли в другом глазу и других опухолей и на риск передачи мутации следующему поколению. Цель: установить частоту и спектр постзиготических мозаичных мутаций в гене RB1 в выборке больных со спорадической ретинобластомой, определить содержание мутантного аллеля в образцах с мозаицизмом. Метод. Исследование проведено на материале ДНК лимфоцитов крови больных со спорадической ретинобластомой. Скрининг точковых мутаций, малых инсерций/делеций в гене RВ1 осуществляли методом полупроводникового высокопроизводительного параллельного секвенирования (ВПС). Исключение протяженных делеций в гене RВ1 проводили методом MLPA. Для поиска мозаичных мутаций с очень низким содержанием (менее 10%) мутантного аллеля был разработан и проведен углубленный анализ данных ВПС, основанный на биоинформатических и статистических подходах. Для верификации выявленных мозаичных патогенных мутаций использовали секвенирование ДНК по Сэнгеру. Результаты. В исследованной выборке больных со спорадической унилатеральной формой ретинобластомы мозаичные мутации встречаются чаще, чем при спорадической билатеральной форме; различия статистически достоверны. В то же время, частоты мозаичных мутаций с высокой и низкой представленностью мутантных аллелей между группами больных с унилатеральной и билатеральной ретинобластомой достоверно не различаются. Все мозаичные мутации, представлены нуль-аллелями; мозаичных миссенс-мутаций в нашей выборке не обнаружено. Не выявлено мозаичных мутаций в 1-м и 2-м экзонах гена RB1, расположенных проксимальнее альтернативного промотора, импринтинг которого определяет пенетрантность мутаций в зависимости от родительского происхождения мутантного аллеля. Заключение. Применение глубокого ВПС в сочетании с усовершенствованным алгоритмом анализа результатов, направленным на выявление мозаичных мутаций, повышает эффективность ДНК-диагностики ретинобластомы, способствуя совершенствованию медико-генетического консультирования и лечения больных. Background. Sporadic retinoblastoma develops as a result of de novo mutations in both alleles of the RB1 gene. Often in sporadic retinoblastoma, the initial mutation in RB1 is mosaic, that is, it is formed in a postzygotic, early embryonic cell, which leads to an uneven distribution of mutant clones between different tissues of the body. The ability to identify a mosaic variant of a mutation in the RB1 gene is important for both medical genetic counseling and clinical management of patients, since mosaicism affects the development of the clinical picture of the disease, the risk of developing a tumor in the other eye, as well as other tumors, and the risk of mutation transmission to the next generation. Aim: to establish the frequency and spectrum of somatic mosaic mutations in the RB1 gene in patients with sporadic retinoblastoma and to quantify the content of the mutant allele in cases with mosaicism. Methods. The study was carried out on the DNA of blood lymphocytes from patients with sporadic retinoblastoma. Screening of point mutations, small insertions/deletions in the RB1 gene was performed by semiconductor high-throughput parallel sequencing (NGS). Exclusion of gross deletions in the RB1 gene was performed by MLPA. To search for mosaic mutations with a very low representation (less than 10%) of the mutant allele, an in-depth analysis of the NGS data was developed an in-house algorithm based on bioinformatic and statistical approaches. To verify mosaic pathogenic mutations identified with NGS, Sanger sequencing was used. Results. Mosaic mutations were found more common among patients with sporadic unilateral form of retinoblastoma than in those with sporadic bilateral form; the differences are statistically significant. At the same time, the frequencies of mosaic mutations with a high and low representation of mutant alleles between the groups of patients with unilateral and bilateral retinoblastoma did not differ significantly. All mosaic mutations are null alleles; mosaic missense mutations were not found in our patients’ cohort. No mosaic mutations were detected in the 1st and 2nd exons of the RB1 gene, located proximal to the alternative promoter, the imprinting of which determines the penetrance of mutations depending on the parental origin of the mutant allele. Conclusion. The use of deep high-throughput parallel sequencing in combination with an improved algorithm for analyzing the NGS results, aimed at identifying mosaic mutations, increases the efficiency of DNA diagnostics of retinoblastoma, contributing to the improvement of medical genetic counseling and treatment of patients.

Введение. Ретинобластома - злокачественная опухоль детского возраста, причиной которой является биаллельная инактивация гена RB1. Ранняя молекулярно-генетическая диагностика ретинобластомы необходима как для адекватного выбора алгоритма лечения пациента с такой опухолью, так и для медико-генетического консультирования семьи. Цель: охарактеризовать частоту и спектр мутаций в гене RB1 у российских больных с ретинобластомой. Методы. Исследование проведено на материале ДНК лимфоцитов крови, полученном от 492 больных с ретинобластомой. Скрининг точковых мутаций, малых инсерций/делеций в гене RВ1 осуществляли методом полупроводникового высокопроизводительного параллельного секвенирования. Исключение протяженных делеций в гене RВ1 проводили методом MLPA. Результаты. Исследовано 492 неродственных пациента с ретинобластомой, среди которых 38,2% (188/492) с билатеральной формой заболевания и 61,8% (304/492) - с унилатеральной. В группе больных с билатеральной формой ретинобластомы герминальная мутация обнаружена у 96,8% (182/188) пациентов, в группе больных с унилатеральной формой - у 16,4% (50/304). Суммарно в гене RB1 в исследованной группе пациентов обнаружено 339 мутаций: 232 - герминальных и 107 - соматических. Выявлен практически полный спектр молекулярных изменений, включающий нонсенс-мутации - 37,5% (127/339), миссенс-мутации - 5,3% (18/339), мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания - 18,9% (64/339), мутации сайтов сплайсинга - 13,9% (47/339) и протяженные делеции - 24,5% (83/339). Выводы. Применение глубокого высокопроизводительного параллельного секвенирования и метода MLPA позволяет эффективно выявлять молекулярно-генетические изменения в гене RB1. Типы мутаций, обнаруженные в исследованной группе, их частота и распределение совпадают с результатами исследователей из других стран. Background. Retinoblastoma is a childhood malignant tumor caused by biallelic inactivation of the RB1 gene. Early molecular genetic diagnosis of retinoblastoma is necessary both for an adequate choice of an algorithm for treating a patient, and for competent medical genetic counseling of the family Objective. To establish the frequency and spectrum of mutations in the RB1 gene in the group of patients with retinoblastoma. Methods. The study was carried out on the DNA of blood lymphocytes from 492 patients with retinoblastoma. Screening of point mutations, small insertions/deletions in the RB1 gene was performed by semiconductor high-throughput parallel sequencing. Exclusion of gross deletions in the RB1 gene was performed by MLPA. Results. 492 unrelated patients with retinoblastoma were studied, including 38.2% (188/492) with bilateral form and 61.8% (304/492) with unilateral form. In the group of patients with bilateral retinoblastoma, germline mutation was found in 96.8% (182/188) patients, and in the group of unilateral patients, in 16.4% (50/304). In total, the RB1 gene in the studied group of patients 339 mutations were found, 232 germline and 107 somatic. An almost complete spectrum of molecular changes was revealed, including nonsense mutations, 37.5% (127/339); missense mutations, 5.3% (18/339); frame shift mutations, 18.9% (64 / 339); splice site mutations, 13.9% (47/339); and large deletions, 24.5% (83/339). Conclusion. The use of deep high-throughput parallel sequencing and the MLPA method allows efficient detection of molecular genetic changes in the RB1 gene. The types of mutations found in the studied group, their frequency and distribution are the same as the results of researchers in other countries.

Genome-wide DNA methylation sequencing provides plenty of differentially methylated regions for further implementation with MSRE-qPCR. Multiplex design is challenging requiring unified PCR conditions for all primers/probes, high specificity for target regions and inclusion of MSRE recognition sites. To address these requirements, we developed a method to design multiplex panels of amplicons, and to estimate their diagnostic potential. We have applied this method to our genome-wide DNA methylation XmaI-RRBS data for triple-negative breast cancer (TNBC) to predict response to neoadjuvant chemotherapy (NAC).

Введение. Выявление и всесторонняя характеристика новых молекулярных маркеров злокачественных опухолей остаётся актуальной задачей онкологии. Ранее по результатам проведенного авторами широкогеномного скрининга дифференциального метилирования ДНК нормальных и опухолевых тканей молочной железы (МЖ) было выявлено аномальное деметилирование CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2 в опухолях относительно нормы. Цель. Настоящее исследование посвящено молекулярной и клинической характеристике аномального деметилирования этого CpG-островка и экспрессии генов LTB4R/LTB4R2 при раке молочной железы (РМЖ). Методы. Для разведочного анализа использовали полученные авторами ранее результаты широкогеномного бисульфитного секвенирования Xmal-RRBS 110 образцов РМЖ и 6 образцов нормальной МЖ. В этой выборке был проведен сравнительный анализ уровней метилирования CpG-динуклеотидов в нормальной и опухолевой ткани 10 образцов трижды негативного (ТН) РМЖ с аномальным деметилированием LTB4R/LTB4R2 и 6 образцов нормальной МЖ с использованием критерия Манна-Уитни. Для подтверждения аномального деметилирования в образцах ТН РМЖ было использовано бисульфитное секвенирование по Сэнгеру. Для изучения корреляции между уровнями метилирования и экспрессии и для оценки прогностической значимости экспрессии генов LTB4R/LTB4R2 использовали данные 3 уровня по измерению метилирования с чипов Illumina HumanMethylation 450K, экспрессии RNA-seq, а также клинические характеристики 731 образцов из проекта TCGA-BRCA. Отличия между кривыми Каплана-Мейера сравнивали с использованием логранкового критерия. Результаты. Определено, что аномальное деметилирование CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2 характерно для эпигеномного подтипа умеренно метилированных образцов ТН РМЖ. Определены дифференциально метилированные CpG-динуклеотиды CpG-островка генов LTB4R/LTB4R2; их дифференциальное метилирование подтверждено бисульфитным секвенированием по Сэнгеру. Установлена отрицательная корреляция между уровнем их метилирования и экспрессией генов LTB4R и LTB4R2. Показано, что общая выживаемость достоверно снижена в группе ТН РМЖ с высокой экспрессией LTB4R, а также в группе нормально-подобных опухолей МЖ с низкой экспрессией LTB4R и в группе LumB опухолей МЖ с низкой экспрессией LTB4R2. Различия показателей выживаемости позволяют рассматривать уровни экспрессии LTB4R/LTB4R2 как прогностический маркер при РМЖ, однако следует учитывать, что прогноз зависит от молекулярного подтипа опухоли. Это относится также к использованию уровней экспрессии LTB4R/LTB4R2 в качестве потенциального предиктивного маркера чувствительности таких опухолей к ингибиторам лейкотриеновых рецепторов при проведении клинических испытаний. Background. The identification and comprehensive characterization of new molecular markers of malignant tumors remains an urgent task of oncology. Earlier, according to the results of a genome-wide screening of differential DNA methylation of normal and tumor breast tissues, abnormal demethylation of the CpG island of LTB4R/LTB4R2 genes in tumors relative to norm was revealed. Aim. The present study focuses on the molecular and clinical characterization of abnormal demethylation of this CpG island and expression of the LTB4R/LTB4R2 genes in breast cancer (BC). Methods. For exploratory analysis, we used the previously obtained results of genome wide bisulfite sequencing of breast cancer (BC) and normal mammary gland samples. From this set, 10 samples of triple-negative (TN) breast cancer with abnormal LTB4R/LTB4R2 demethylation and 6 normal breast samples were selected, for which a comparative analysis of CpG methylation levels in cancer vs norm using the Mann-Whitney test was performed. Sanger bisulfite sequencing was used to confirm abnormal demethylation in TN BC samples. The analysis of the obtained electrophoregrams was carried out using the SeqBase software developed by the authors. To validate and assess the level of predictive significance of LTB4R/LTB4R2 gene expression, level 3 data were used to measure methylation from Illumina HumanMethylation 450K arrays, RNA-seq expression, as well as clinical characteristics for 731 samples from the TCGA-BRCA project. Kaplan-Meier curves were compared using a logrank test. Results. Abnormal demethylation of LTB4R/LTB4R2 genes in breast tumors was confirmed by Sanger sequencing. Among samples from the TCGA-BRCA project, a group of TN BC samples with low methylation of LTB4R/LTB4R2 genes was identified. Overall survival was significantly reduced in the TN breast cancer group with high LTB4R expression, as well as in the group of normal-like breast tumors with low LTB4R expression, and in the LumB group overall survival was significantly reduced when tumors demonstrated low LTB4R2 expression. Conclusions. Fine mapping of abnormal demethylation in individual CpG dinucleotides of the LTB4R/LTB4R2 genes will make it possible to design an effective PCR system that may potentially be used to define patients with TN breast cancer that would benefit from leukotriene receptor therapeutic inhibition. Different expression levels of LTB4R/LTB4R2 allow their use as a prognostic marker for breast cancer, but the prognosis directly depends on the molecular subtype of a tumor. This also applies to the use of different levels of LTB4R/LTB4R2 expression as a predictive marker of the sensitivity of such tumors to leukotriene receptor inhibitors in case they enter clinical trials.

Введение. Программное обеспечение, предоставляемое производителями автоматических генетических анализаторов, в большинстве случаев позволяет провести адекватный анализ результатов секвенирования ДНК по Сэнгеру для матриц с составом нуклеотидов, близким к эквивалентному. Однако для рассмотрения результатов секвенирования матриц, отличающихся неэквивалентным нуклеотидным составом, требуется проводить анализ электрофореграмм с сохранением информации об интенсивности сигналов флуоресценции. В особенности это касается секвенирования ДНК, модифицированной бисульфитом натрия. Цель: разработать и апробировать в практике научных исследований компьютерную программу для обеспечения адекватного анализа электрофореграмм секвенирования ДНК по Сэнгеру на основе бережного отношения к первичным данным и аккуратного определения базовых линий в спектральных каналах отдельных нуклеотидов. Методы. Программа SeqBase написана на языке C#, программная платформа .NET Framework 4.0, и выполняется в среде исполнения CLR (Common Language Runtime) для операционных систем семейства Windows. Адрес установочного пакета программы SeqBase: http://www.epigenetic.ru/projects/seqbase. Результаты. Разработана компьютерная программа, предназначенная для анализа первичных результатов секвенирования по Сэнгеру (хроматограмм капиллярного электрофореза), полученных на автоматических генетических анализаторах и представленных в файлах формата ABIF (*.ab1), обеспечивающая следующие возможности: 1) просмотр исходных электрофореграмм как в общем виде, так и раздельно по спектральным каналам; 2) кадрирование области анализа; 3) сглаживание сигналов; 4) ручная установка базовой линии по каждому из спектральных каналов; 5) сведение базовых линий по всем каналам; 6) ручная коррекция подвижности фрагментов ДНК в зависимости от типа флуоресцентной метки терминирующего нуклеотида. Апробация программы успешно проведена в рамках ряда исследований, результаты которых опубликованы в рецензируемых научных изданиях. Заключение. Использование программы SeqBase целесообразно для анализа результатов секвенирования по Сэнгеру матриц ДНК с неэквивалентным нуклеотидным составом, в особенности, модифицированных бисульфитом натрия, во избежание получения ложных результатов и для уточнения количественных оценок. Background. The software provided by the manufacturers of automatic genetic analyzers, in most cases, allows an adequate analysis of the results of Sanger DNA sequencing for templates with a nucleotide composition close to the equivalent. However, to consider the results of sequencing of templates with non-equivalent nucleotide composition, it is necessary to analyze electrophoregrams with preservation of primary information on the intensity of fluorescence signals. This is especially important for the sequencing of DNA modified with sodium bisulfite. Aim: to develop and validate in the practice of scientific research a computer program that ensures adequate analysis of electrophoregrams of Sanger DNA sequencing based on preservation of the primary data and on accurate determination of baselines in the spectral channels of individual nucleotides. Methods. The SeqBase program is written in C#, the programming platform .NET Framework 4.0, and runs in the CLR (Common Language Runtime) for Windows operating systems. SeqBase installation package address is http://www.epigenetic.ru/projects/seqbase. Results. A computer program has been developed designed to analyze the primary results of Sanger sequencing (chromatograms of capillary electrophoresis) obtained from automatic genetic analyzers and presented in files of the ABIF (*.ab1) format, which provides the following functions: 1) viewing the original electrophoregrams both in general form and separately by spectral channels; 2) cropping the area of analysis; 3) signal smoothing; 4) manual setting of the baseline for each of the spectral channels; 5) convergence of baselines on all channels; 6) manual correction of the mobility of DNA fragments depending on the type of fluorescent label of the terminating nucleotide. The program has been successfully tested in a number of studies, the results of which have been published in peer-reviewed scientific journals. Conclusion. The use of the SeqBase program is advisable for the analysis of the results of Sanger sequencing of DNA templates with non-equivalent nucleotide composition, especially those modified with sodium bisulfite, to avoid false results and to clarify quantitative estimates.

Синдром Сотоса представляет собой редкое аутосомно-доминантное заболевание с частотой встречаемости около 1:14000 новорожденных. Несмотря на ряд характерных клинических проявлений, его диагностика затруднена в связи с высокой степенью перекрывания фенотипа с рядом других наследственных синдромов, таких как синдром Видемана-Беквита или синдром Марфана. Молекулярно-генетической причиной синдрома Сотоса являются мутации в гене NSD1, приводящие к дисфункции белка. В статье представлены и охарактеризованы варианты в гене NSD1, найденные в ходе диагностики методами высокопроизводительного параллельного секвенирования (NGS) и MLPA. Sotos syndrome is a rare autosomal dominant disorder with an incidence of about 1 in 14,000 newborns. Despite a number of characteristic clinical manifestations, its diagnosis is difficult due to the high degree of overlap of the phenotype with a number of other hereditary syndromes, such as Beckwith-Wiedemann syndrome or Marfan syndrome. The molecular genetic cause of Sotos syndrome is mutations in the NSD1 gene, leading to protein dysfunction. The article presents and characterizes variants in the NSD1 gene found during diagnostics using high-throughput sequencing (NGS) and MLPA.

По результатам широкогеномного исследования нами обнаружено аномальное метилирование промотора гена дигидропиримидиназы DPYS в образцах рака молочной железы (РМЖ). Поскольку дигидропиримидиназа вовлечена в катаболизм антагонистов пиримидинов, представляет интерес роль метилирования DPYS в определении чувствительности опухолей к препаратам этой группы. Детальный анализ состояния метилирования DPYS в 29 образцах биопсий РМЖ люминального В подтипа, полученных до неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) с использованием антагонистов пиримидинов, показал, что опухоли с метилированным промотором DPYS более чувствительны к НАХТ, чем с неметилированным промотором (площадь под ROC-кривой AUC=0,87). Результаты указывают на целесообразность включения антагонистов пиримидинов в схемы НАХТ РМЖ люминального В подтипа тем пациенткам, в биопсийном материале опухолей которых, взятых до лечения, определяется гиперметилированное состояние промотора гена DPYS. Within a genome-wide study, we have identified abnormal methylation of the dihydropyrimidinase DPYS gene promoter in breast cancer (BC). Since dihydropyrimidinase is involved in the catabolism of pyrimidine antagonists, the role of DPYS methylation in determining the sensitivity of tumors to such drugs is of interest. Detailed analysis of DPYS methylation in 29 biopsy samples of the LumB BC subtype obtained before neoadjuvant chemotherapy (NACT) with pyrimidine antagonists discovered that tumors with methylated DPYS promoter are more sensitive to NACT than tumors with unmethylated DPYS (AUC=0.87). Our results indicate the advisability of including pyrimidine antagonists in the LumB BC NACT regimens for patients whose tumor biopsy samples taken before treatment demonstrate hypermethylation of the DPYS promoter.

Almost 80% of cases of hereditary retinoblastoma do not have a family history and arise as a result of de novo mutations in the RB1 gene. An NGS test was performed on 208 unrelated patients with sporadic RB, including 145 patients with a unilateral form and 63 patients with a bilateral one. In the group of patients with bilateral RB, pathogenic variants in the RB1 gene were detected in 90.5% (57/63) cases. In 4.8% (3/63) of patients, a mosaic variants were determined. In the group of patients with unilateral RB, changes in the RB1 gene were detected in 17.9% (26/145) cases. Among the examined patients, somatic mosaicism was detected in 9.0% (13/165) cases. NGS allows us to determine the allelic frequency of variants, which makes the search for somatic mosaicism effective.

По результатам широкогеномного скрининга дифференциального метилирования в образцах рака молочной железы (РМЖ) нами было обнаружено аномальное деметилирование CpG-островка гена лейкотриенового рецептора LTB4R, которое может приводить к его эктопической экспрессии. В настоящей работе мы использовали данные, полученные при анализе 1083 образцов РМЖ в рамках проекта TCGA-BRCA, для определения влияния экспрессии LTB4R на эффективность лечения циклофосфамидом. Анализ кривых выживаемости пациенток с трижды-негативным (ТН) РМЖ с высокой экспрессией LTB4R в опухолях показал увеличение общей выживаемости при лечении циклофосфамидом (p<0,05). Для LumB подтипа РМЖ эффект циклофосфамида не зависел от экспрессии LTB4R. Полученные результаты расширяют возможности персонализации терапии РМЖ. Based on the results of genome-wide screening of differential methylation in breast cancer samples (BC), we have identified abnormal demethylation of the LTB4R leukotriene receptor gene CpG island, which can lead to its ectopic expression. In this paper, we used the data obtained for 1083 BC samples under the TCGA-BRCA project to determine impact of LTB4R expression on the effectiveness of treatment with cyclophosphamide. Analysis of survival curves for patients with triple-negative (TN) breast cancer and high expression of LTB4R showed an increase in overall survival of patients treated with cyclophosphamide (p <0.05). For LumB BC subtype, the effect of cyclophosphamide was not dependent on LTB4R expression. The results obtained expand the possibilities of personalizing BC therapy.

Stargardt disease is a hereditary retinal dystrophy associated with mutations in the ABCA4 gene. Currently, no etiopathogenetic drugs nor treatment methods for Stargardt disease have completely passed clinical trials. The review summarizes experimental and clinical studies of drugs aimed at reducing the accumulation of vitamin A dimers, lipofuscin, complement inhibition and RPE regeneration by stem cell transplantation, as well as gene therapy studies with intravitreal vector injection of the ABCA4 functional gene.

Проведено комплексное молекулярно-генетическое обследование пациентов с диагнозом туберозный склероз. Комплекс включает высокопроизводительное параллельное секвенирование с глубоким покрытием для выявления точковых мутаций и инделов, MLPA для выявления протяженных делеций и секвенирование по Сэнгеру. В выборке из 202 пациентов мутации найдены в 96,5% случаев; из них точковые мутации и инделы - в 93,3%, а протяженные делеции - в 6,7%. В 5,9% были найдены мутации с низкой аллельной представленностью (мозаицизм). A comprehensive molecular genetic examination of patients with diagnosis of tuberous sclerosis was carried out. The complex includes NGS with deep sequencing for detecting point mutations and indels, MLPA for identification of extended deletions, and Sanger sequencing. Mutations was found in 96,5% cases from 202 samples. Point mutation and indels were found in 93,3% cases, extended deletions were found in 6,7%. Mutations with low allelic representation were found in 5,9%.

Для понимания особенностей регуляции и механизмов взаимодействия белков матрикса и трансмембранных рецепторов и их роли в поддержании структуры и функции ткани молочной железы в норме и при канцерогенезе важно установить вклад изменений экспрессии этих белков в процессы развития, роста, инвазии и метастазирования опухолей. Изучение статуса метилирования генов, кодирующих белки ламининов, нидогенов, интегринов, кадгеринов, матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в нормальной и опухолевой ткани необходимо для установления роли этих генов и механизмов их регуляции при раке молочной железы. Нами проведено исследование состояние метилирования этих генов в нормальных и опухолевых тканях молочной железы с целью поиска эпигенетических маркеров, ассоциированных с клинико-морфологическими характеристиками опухолей. To understand mechanisms of interaction between extracellular matrix proteins and transmembrane receptors, as well as their role in maintaining the structure and function of breast tissue in norm and in cancer, an important issue is to determine the contribution of changes in the expression of these proteins to the processes of development, growth, invasion and metastasis of breast cancer. Studies of the methylation status of genes encoding laminins, nidogens, integrins, cadherins, matrix metalloproteinases and their inhibitors in normal and tumor tissues are necessary to determine the roles of these genes and the mechanisms of their regulation in cancer. We have studied methylation status of these genes in normal and tumor tissues of the mammary gland in order to search for epigenetic markers associated with the clinical and morphological characteristics of the tumors.

Эпигенетические механизмы регулируют структуру хроматина и создают устойчивые закономерности экспрессии генов в процессе жизни клеток. Нарушение эпигенетической регуляции играет значительную роль в канцерогенезе, инвазии, рецидивировании и метастазировании опухолей и может служить полезным клиническим маркером. Мутационное профилирование генов эпигенетической регуляции в опухолевых образцах рака желудка позволит определить новые клинические и прогностические маркеры и дополнительные таргеты для лечения пациентов. В статье представлены первые результаты исследования соматических мутаций в генах эпигенетической регуляции, проведенного методом NGS. Epigenetic mechanisms regulate chromatin structure and create stable patterns of gene expression during cell life. Violation of epigenetic regulation plays a significant role in carcinogenesis, invasion, recurrence and metastasis of tumors, and can serve as a useful clinical marker. Mutational profiling of epigenetic regulation genes in tumor samples of gastric cancer will allow us to identify new clinical and prognostic markers and additional targets for the treatment of patients with gastric cancer. This article presents the first results of a study of somatic mutations in the epigenetic regulation genes carried out using NGS.