目的:以临床分离的G型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type G,GCP)GCP-D25菌株为对象,研制GCP全菌灭活苗,并评估疫苗免疫效力.方法:利用甲醛灭活法处理GCP-D25菌液,白油佐剂乳化后免疫1日龄雏鸡检测灭活效果;150只1日龄817肉鸡,随机分为5组(G1～G5),即高剂量免疫组、中剂量免疫组、低剂量免疫组、攻菌对照组和空白对照组.G1～G3组分别于1、8、15日龄通过皮下注射不同剂量的GCP-D25乳化灭活疫苗进行免疫,G4～G5组通过皮下注射PBS,其中G1～G4组于26～29日龄每天灌服1次8×108 CFU/mL GCP新鲜菌液,G5组为不攻菌对照组.分别于一免、二免和三免后第7天采集鸡血液并分离血清,采用ELISA方法检测血清抗体及IL-2、INF-γ水平,同时结合攻菌后鸡临床表现及肠道病变计分等指标评估疫苗免疫保护效果.结果:GCP-D25全菌液能被0.5％甲醛完全灭活,灭活时间为36 h.间接ELISA测定抗原(全菌液)的最佳包被浓度为2×108 CFU/mL,血清最佳稀释度为1∶400.肉鸡免疫保护试验显示,攻菌对照组试验鸡的坏死性肠炎病变平均分显著高于各免疫组(P＜0.01).三免后第7天,各免疫组试验鸡血清抗体呈阳性,高剂量与中剂量免疫组试验鸡IL-2与IFN-γ含量均显著高于空白对照组(P＜0.05).结论:GCP-D25全菌灭活疫苗免疫1日龄817肉鸡可诱导机体产生高水平免疫应答,能够在一定程度上预防鸡坏死性肠炎的发生.

为了解粤北地区鸡传染性病毒性腺胃炎(Transmissible viral proventriculitis,TVP)的病原学特征,于粤北地区8个有生长停滞、羽毛生长不良和消瘦等症状,疑似传染性病毒性腺胃炎的肉鸡场共采集样品420份,根据发病鸡场每10份样品混为1个样本,利用实时荧光定量PCR方法进行检测,8种TVP相关病毒的总检出率为80.95％(34/42),除呼肠孤病毒和传染性支气管炎病毒未检测到阳性外,鸡传染性贫血病毒和马立克氏病病毒感染率分别为57.14％、4.76％,传染性法氏囊病病毒、网状内皮增生症病毒、鸡腺胃坏死病毒和圆圈病毒3型均为2.38％,其中鸡传染性贫血病毒和马立克氏病病毒、马立克氏病病毒和传染性法氏囊病病毒等混合感染的检出率均为4.76％,马立克氏病病毒和鸡腺胃坏死病毒、马立克氏病病毒和圆圈病毒3型等混合感染的检出率为2.38％;发病鸡主要集中于25～80日龄,不同日龄的TVP相关病原学检出率无显著性差异.结果表明粤北地区肉鸡TVP发病率较高,需进一步完善相关疾病免疫策略,研究结果为进一步了解TVP发病规律和有效防控提供科学参考依据.

In this study,a highly sensitive and specific detection method was established based on the B646L（P72） protein gene of African swine fever virus （ASFV）.The nested primers and probes of LNA-OSN-PCR （One Step Nested-Locked Nucleic Acid real-time PCR） were designed with Oligo 7 software;external primers were modified with locked nucleic acids.The reaction system and conditions of LNA-OSN-PCR were established and optimized,and the standard curve of LNA-OSN-PCR was established.Then,the sensitivity,specificity and repeatability of LNA-OSN-PCR were tested.A total of 96 clinical suspected diseased samples were detected by LNA-OSN-PCR and compared with the samples detected by conventional fluorescent PCR method.The reaction conditions and system of LNA-OSN-PCR were established and optimized,and the standard curve of LNA-OSN-PCR had good linearity （R~2=0.9945）.The LNA-OSN-PCR had a minimum detection limit of 3×10 -1 copies/μL,with a coefficient of variation of less than 3%and no cross-reaction with other viral or bacterial nucleic acids.Compared with the qPCR method recommended by OIE,the detection sensitivity of the LNA-OSN-PCR method was increased by 10-100 times.Among the 96 samples tested by LNA-OSN-PCR,55 were positive and 41 were negative,with a higher positive detection rate than traditional qPCR and a better typical amplification curve.By combining the one-step nested PCR and lock-in nucleic acid modification,the LNA-OSN-PCR method for ASFV was established to provide a highly sensitive,specific and economical method for ASFV detection.

自噬(autophagy)是细胞通过降解自身大分子物质或破损细胞器等来维持胞内稳态的一种平衡机制.近年来在顶复门原虫与宿主细胞相互作用研究中发现,顶复门原虫不但可诱导宿主细胞产生自噬并启动天然免疫途径清除寄生虫,亦可进化出独特的机制来抵抗宿主细胞自噬甚至利用其为自身生长提供条件.不同种类顶复门原虫与宿主细胞互作方式不同,所诱导的自噬信号通路亦不尽相同,深入了解二者互作机制及所诱导的自噬途径,对于胞内原虫的防控有着重要的意义.本文对自噬进程中的信号调控及其对以弓形虫、疟原虫为代表的顶复门原虫入侵发育中的作用进行综述.

[目的]明确广东地区鸭疫里默杆菌Riemerella anatipestifer的血清型、耐药状况及遗传进化关系.[方法]从规模化鸭场分离鉴定鸭疫里默氏杆菌,通过玻片凝集试验鉴定血清型;利用试管两倍稀释法测试抗菌药物的最低抑菌浓度,分析药物的敏感性;采用全基因组测序技术分析序列特征并构建核心基因组遗传进化树.[结果]共分离鉴定鸭疫里默氏杆菌168株,血清1、2、3、5、6、7、8、10型均有流行,血清1型的菌株高达54.17％(91/168),其次为2型,占27.97％(47/168).48株代表性菌株对庆大霉素、卡那霉素、盐酸环丙沙星表现高度耐药,耐药率均超过80％;对土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶的耐药率均在60％以上;对阿莫西林、头孢噻肟和大观霉素的耐药率低于30％.受试菌株对5～12种药物耐药,共有44种耐药谱型.成功获得46株菌株全基因组序列,共检出6种耐药基因,其中,耐药基因erm(F)和tet(X)的检出率较高,分别为73.91％(34/46)和82.60％(38/46),同时携带2种以上耐药基因的菌株占95.65％(44/46).18株(39.13％,18/46)菌株ST分型成功,分属11个ST型.所有测序菌株与数据库中来自中国的菌株在遗传进化关系上最接近,主要存在于优势克隆群系Clade 1和Clade 3中.[结论]本研究鸭疫里默氏杆菌分离株的优势血清型为1型,耐药性严重,所携带的耐药基因与耐药表型具有一定相关性,ST型呈多样性,与多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)数据库中来自我国菌株的遗传背景相近.研究结果可为鸭疫里默氏杆菌病疫苗免疫预防与药物治疗提供依据,有助于掌握鸭疫里默氏杆菌遗传进化特征.

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一种核酸长度＞200 nt、不编码或具有有限编码能力的RNA,早期一直被认为是遗传暗物质,但伴随分子生物学技术的进步,越来越多的lncRNAs被发掘.研究表明,incRNA作为基因表达的关键调控因子,能在组蛋白修饰、转录调控和转录后调控等方面影响基因表达,几乎参与所有的细胞生物学过程.顶复门原虫是一类专性胞内寄生虫,入侵机制复杂,对顶复门原虫与宿主的互作研究已成为新型抗虫药物的研发基础.近年来研究发现,lncRNA作为一类新型调控因子广泛参与到顶复门原虫与宿主细胞相互作用中,包括感染免疫、发育分化和信号传导等细胞生物学过程,既可帮助宿主抵御寄生虫入侵,也可协助寄生虫在胞内增殖发育,对疾病的发生发展具有重要的调控作用.笔者通过对lncRNA的生物学分类及其在细胞生理过程中的主要功能进行概述,综合近年来lncRNA在以弓形虫、疟原虫和隐孢子虫为主要代表的顶复门原虫的相关研究,系统梳理了 lncRNA在宿主免疫反应、寄生虫发育分化和表观遗传调控等方面的作用机制,以期为顶复门原虫致病机理研究及高效防控技术研发提供新的思路和参考.

为调查引起粤东地区鸡传染性病毒性腺胃炎的主要病因和感染情况,对粤东地区病鸡样品共490份进行剖检,并按10份合1进行相关病毒检测.结果表明,引起该地区鸡传染性病毒性腺胃炎的疾病主要为免疫抑制性疾病,感染率最高的是鸡传染性贫血病毒,检出率高达53.1％(26/49);马立克病病毒检出率位居第二,为28.6％(14/49).另外,网状内皮增生症病毒和圆圈病毒3型的检出率均为14.3％(7/49),传染性支气管炎病毒等四种病原未检出.研究表明引起免疫抑制性疾病的病毒可能是粤东地区鸡传染性病毒性腺胃炎的主要病原.另外,发病鸡主要集中在28-92日龄的中鸡,夏季和秋季多发,春季少发.本研究通过对粤东地区鸡传染性病毒性腺胃炎的主要病因和感染情况进行系统研究,为粤东地区鸡传染性病毒性腺胃炎的预防和控制提供指导.

顶复门原虫是一类专一性的胞内寄生性原虫,其种类丰富、分布广泛,包括艾美耳球虫、巴贝斯虫、隐孢子虫、疟原虫和弓形虫等.此类原虫具有保守的棒状体、致密颗粒以及微线等顶端复合器结构,这些细胞器可分泌大量的入侵相关蛋白分子介导虫体入侵宿主细胞.而棒状体蛋白是这类原虫在入侵过程中由棒状体分泌的一类蛋白,其在虫体入侵宿主细胞、纳虫空泡形成及胞内虫体的增殖调控等方面发挥着至关重要作用,是最具潜力的疫苗候选抗原.本文对棒状体蛋白的发现、组成、功能及定位进行概述,以目前研究最深入的弓形虫棒状体蛋白为主,归纳总结近年来关于棒状体蛋白作为顶复门原虫疫苗候选分子的研究进展,以期为新型抗原虫分子疫苗的研制提供理论依据.

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法.结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1％;56份临床样品的检测结果与O1E推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100％.结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择.

为了解广东省部分地区赛马肠道寄生虫感染情况,采用饱和蔗糖溶液漂浮法对广东7个马术俱乐部的383份赛马新鲜粪便样本进行检查.结果发现赛马肠道寄生虫总感染率为12.0％(46/383),7个马术俱乐部中有5个呈肠道寄生虫感染阳性,感染率范围为1.2％(1/82)～54.3％(19/35),统计学差异极显著(P<0.01);显微镜观察鉴定出2种/类寄生虫虫卵,圆线虫和马副蛔虫感染率分别为11.5％(44/383)和0.7％(3/383);雌马、雄马和骟马感染率分别为16.1％(5/31)、6.8％(3/44)和12.3％(38/308),不同性别赛马肠道寄生虫感染率无统计学差异(P>0.05).结果表明,需要加强广东省赛马肠道寄生虫的防控.

顶复门原虫属于专性细胞内寄生的单细胞真核生物,其中多种属于重要病原,影响人类的健康和畜牧业的发展.已有研究表明,磷脂酶A2为顶复门原虫发病机制中的关键酶,主要与顶复门原虫入侵、膜重塑等有关,可以影响寄生虫毒力和疾病进展,具有重要的生物学意义.而脂肪滋养蛋白磷脂酶A2(PLP)家族基因结构域与细菌PLP相似性较高,与真核生物PLP存在显著差异,成为研究抗顶复门原虫药物靶点的热点.本文就近年来磷脂酶A2家族中的关键酶PLP及磷脂酶A2的生物学功能在顶复门原虫上研究进展进行综述,以期为寄生原虫病的防治提供理论依据.

G型产气荚膜梭菌可引起鸡坏死性肠炎和肠毒血症,致病力强,在自然界中广泛存在,严重危害养鸡业的发展.坏死性肠炎B样毒素(necrotic enteritis B-like toxin,NetB)是近年来发现的是一种新的β-成孔毒素(β-pore-forming toxin,β-PFT),是G型产气荚膜梭菌的主要致病性毒素和保护性抗原,深入研究该毒素的结构功能及致病机理对于鸡坏死性肠炎的防控具有重要意义,但至今尚无相关系统性综述报道.鉴于此,论文主要对国内外关于G型产气荚膜梭菌的流行概况、NetB毒素的分子结构特征、生物学特性、致病机理及其相关防治制剂等方面的研究进行综述,为进一步基于NetB毒素研制鸡坏死性肠炎的防治制剂提供参考.

人类离不开动物性食品,但很多肉类、水产品等食物携带有寄生虫病原体.食源性寄生虫是引起重要食源性寄生虫病的病原,主要通过人们进食生鲜或未经彻底加热的含有寄生虫虫卵、包囊或幼虫的食品而感染.与细菌和病毒性食源性病原相比,它们长期以来被人们所忽视.近年来,随着生活水平的提高,食品供应全球化进程的加快,人们饮食来源和饮食习惯呈现多样化,尤其对野味及生食的口感追求,促使食源性寄生虫病成为新的"富贵病",我国城镇居民特别是沿海经济发达地区的感染人数呈上升趋势.食源性寄生虫造成的食品安全问题日益突出,不断呈现流行新特点,成为威胁人类健康的重要因素之一,是一个不容忽视的公共卫生问题.综述了重要食源性寄生虫种类(肉源性寄生虫、鱼源性寄生虫、螺源性寄生虫、淡水甲壳动物源性寄生虫、两栖爬行动物源性寄生虫、植物源性寄生虫、水源性寄生虫)、流行新特点及发展趋势,分析了食源性寄生虫病的防控策略和发展方向,以期提升人们对食源性寄生虫的认识,为保障公共卫生和食品安全提供参考.

坏死性肠炎(necrotic enteritis,NE)是家禽中最重要的肠道疫病之一,呈世界性流行,严重危害养鸡业发展.人工复制鸡坏死性肠炎病例是研究该病发病机制及筛选有效药物的重要手段,然而在实际试验过程中,通常受实验动物、感染菌株、诱导病原等多方面因素影响而难以成功复制病例.鉴于此,现综述了影响鸡坏死性肠炎病例成功复制的关键因素,包括攻毒使用的实验动物、菌株毒素、菌株培养条件、诱导病因等,同时探讨了如何通过调整这些因素来改善人工复制鸡坏死性肠炎病例的严重程度,分析了鸡坏死性肠炎病例的病变评分系统,以期为鸡坏死性肠炎的实验室研究及综合防控提供理论基础.

1型鸭疫里默氏杆菌在华南地区流行,本试验在获得1型鸭疫里默氏杆菌天然弱毒株SG株的基础上,采用具有在线控制pH和溶解氧(DO)的5 L发酵罐,通过对发酵培养基、发酵培养过程中DO值、发酵培养转速进行优化,获得1型鸭疫里默氏杆菌弱毒株SG株.结果显示:SG株发酵培养的最适培养基配方中每升培养基含胰蛋白胨17.5 g、大豆蛋白胨7.5 g、酵母提取物7.5 g、葡萄糖2.5 g;SG株发酵培养的最适DO值为20％、最适转速为150 rpm,当发酵8 h活菌数达到高峰(1.27×1010 CFU/mL);以获得的优化工艺在GMP生产车间规模化发酵生产3批鸭疫里默杆菌弱毒株SG株,收获弱毒菌液的活菌数均高于1.0×1010 CFU/mL.本试验为鸭疫里默氏杆菌弱毒疫苗抗原的高效制备提供了指导.

鸡体表寄生虫病是一种由寄生虫寄生于鸡体表所引起的疾病,严重危害禽业发展.鸡体表寄生虫种类繁多,包括虱、螨和蜱等,而且生活史极其复杂,给寄生虫的有效防控带来一定的难度.本文围绕鸡常见体表寄生虫,从其种类特征、危害进行阐述,根据不同的体表寄生虫生物特性,分别从物理防治、生物防治、化学药物防治等方面提出相应的防控措施,以期为防治鸡体表寄生虫病和提高养鸡业经济效益提供参考.

近年来,非洲猪瘟、牛结节性皮肤病等外来可由虫媒传播的疫病肆虐中国,而一些已在国外流行的虫媒传播病原如非洲马瘟等传入中国的风险也越来越高,严重危害中国畜牧养殖业的发展和公共卫生安全.特别是2018年8月以来非洲猪瘟在中国的流行给养猪业带来重要警示信息,即防止猪场媒介生物进入并阻断其携带病原的传播将成为猪场生物安全的重点.蚊、蝇、蠓及蜱等是猪场和发病猪群传播疫病的重要虫媒因素,虫媒种类及从虫媒中分离到的病毒、细菌、寄生虫等病原种类繁杂,虫媒生物特性的差异对病原的传播方式和传播能力也不尽相同.鉴于此,作者详细归纳了猪场存在的主要虫媒种类及其传播的重要猪病病原,包括猪乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒、盖塔病毒、猪肠道冠状病毒、大肠杆菌、猪链球菌等,并探讨其危害性和传播风险,以降低猪场虫媒传播疾病所带来的经济损失.

为了解珠三角地区鸡群中引起传染性病毒性腺胃炎(Transmissible viral proventriculitis,TVP)的相关病毒的感染情况,本研究应用实时荧光定量PCR方法对珠三角地区部分发病鸡场共计990份(每10份混为1个样本,共99个样本)病鸡腺胃样品开展分子流行病学调查,比较了不同日龄、季节、品种TVP的感染情况.结果发现8种TVP相关病毒的总检出率为51.5％(51/99),存在双重和三重感染的情况;其中鸡传染性贫血病毒、马立克氏病病毒、传染性法氏囊病病毒、网状内皮增生症病毒、圆圈病毒3型感染率分别为11.1％(11/99)、43.4％(43/99)、2.0％(2/99)、10.1％(10/99)、1.0％(1/99);临床剖检发现腺胃具有肿大等典型病变;不同季节品种日龄TVP感染率统计学差异.结果表明珠三角地区养鸡场TVP发生情况普遍存在,本次研究为珠三角地区传染性病毒性腺胃炎的流行规律研究及有效防控提供临床数据.

鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种危害严重的肠道寄生原虫病,每年给全球养鸡业造成巨大经济损失.活疫苗是替代抗球虫药防控鸡球虫病的有效手段,而减毒活疫苗安全性能更高,免疫原性更好,更加稳定,有效防控鸡球虫病的暴发.通过理化致弱、鸡胚传代和早熟选育方法诱导虫株毒力减弱是常用的鸡球虫毒力致弱手段,但目前尚缺乏相关方法的系统性综述.鉴于此,为综合了解当前鸡球虫毒力致弱方法的研究进展及其在鸡球虫病弱毒活疫苗的应用研究,本文通过查阅、搜集和整理国内外文献相关研究内容,对鸡球虫强毒株致弱措施和方法及其在鸡球虫病弱毒苗应用现状进行综述,为新一代鸡球虫病弱毒活疫苗的研究提供理论依据.

由柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)引起的球虫病严重损害鸡的肠道健康,给养鸡业造成巨大的经济损失.E.tenella寄生在鸡盲肠上皮细胞,体外培养可在鸡原代肾细胞内发育成卵囊完成内生发育过程,而在其他传代细胞系内只能完成部分生殖阶段,为了延长其在细胞内的发育进程,建立了鸡球虫HCT-8细胞培养模型.将新鲜制备的E.tenella子孢子接种HCT-8细胞,制备细胞爬片,分别进行HE染色和DAPI染色,观察子孢子在细胞内的发育状况.结果表明,子孢子在接种后6 h即可入侵HCT-8细胞,随后子孢子发育为滋养体至48 h形成第一代裂殖体,至54 h第一代裂殖子释放,于72 h形成第二代裂殖体,在144 h第二代裂殖子释放出来,继续培养至168 h未见到卵囊形成,而试验虫株接种鸡体后在144～168 h即可观察到大量未孢子化卵囊排出体外,据此确定子孢子在该细胞内的发育过程结束.本研究所建立的鸡球虫细胞培养模型将子孢子发育至第二代裂殖生殖阶段,将发育阶段向前推进了一个进程,为鸡球虫相关研究工作的开展提供技术平台.