[目的]克隆人γ干扰素(hIFNγ)基因,借助自剪切肽P2A,构建hIFNγ-P2A-RFP(红色荧光蛋白)融合基因转座子表达载体,并在HEK293T细胞中检测其表达水平.[方法]首先,以脂多糖(LPS)激活人外周血淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增hIFNγ基因;再通过重叠延伸PCR,获得hIFNγ-P2A-RFP融合基因,并将其插入PB002G转座子载体.经双酶切和DNA测序鉴定,将重组质粒转染HEK 293T细胞,荧光显微镜观察RFP表达,Western Blotting检测hIFNγ蛋白表达.[结果]克隆了hIFNγ基因,成功构建了PB-hIFNγ-P2A-RFP重组质粒;荧光显微镜观察发现RFP在HEK 293T细胞表达,转染效率达39.3％;Western Blotting检测显示,特异性蛋白条带约为21 kDa,与预期的hIFNγ蛋白大小一致.[结论]成功构建了人γ干扰素PB转座子真核表达质粒,该质粒在HEK 293T细胞中高效表达.

为研究水牛瘦素(Leptin)的功能,构建leptin基因真核表达载体EGFP-leptin,检测leptin在NIH/3T3细胞中的表达并分析其生物学特性.根据水牛leptin基因序列设计引物,并在上下游引物分别添加Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点,以pMD18-T-leptin载体为模板,PCR扩增leptin基因,并亚克隆至载体pEGFP-Nl,以双酶切和DNA测序鉴定EGFP-leptin重组质粒;然后采用脂质体2000将重组质粒转染到NIH/3T3细胞,经G418筛选,获得稳定转染的细胞株,RT-PCR及Western blot检测EGFP-Leptin融合蛋白表达.动物试验分3组,处理组从小鼠尾静脉注入重组质粒1 μg/只,对照组和禁食组注射等体积生理盐水,3 d后称其体质量,采用ELISA法测定小鼠血清中Leptin水平.结果显示,成功构建真核表达载体EGFP-leptin,转染NIH/3T3细胞后出现绿色荧光;RT-PCR和Western blot进一步证实了 Leptin表达.动物试验显示,处理组和禁食组小鼠体质量下降速率高于对照组,差异显著(P＜0.05),处理组血清Leptin水平高于对照组,差异显著(P＜0.05).以上结果表明,EGFP-leptin能够在NIH/3T3细胞中稳定表达,产生的融合蛋白具有良好的生物学活性.

冷冻切片的优点是能完好保存有机溶剂及热敏感抗原,其缺点是制片过程中形成冰晶影响免疫组织化学检测结果.为了解决这一难题,我们对现有的冷冻切片法进行了改良.多聚甲醛固定和蔗糖脱水后的脑、肺和睾丸组织,在包埋和切片之前,利用OCT包埋剂(聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物)进行预包埋,切片后进行苏木精伊红染色(hematoxylin eosin staining,HE染色)和免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining,IHC染色),并比较了改良冷冻切片法、常规冷冻切片法和石蜡切片法制作的切片HE和IHC染色效果.结果 显示,切片前使用OCT包埋剂充分浸润组织6～48 h,可显著地提高冷冻切片质量;与常规冷冻切片法相比,用改良法制作的睾丸和脑组织冷冻切片结构更加清晰,因冰晶形成的空洞较少,总体质量均得到极大提高;与传统石蜡切片相比,改良法制作的肺组织冷冻切片质量尤佳.本研究建立了一种适用于免疫组织化学研究的冷冻切片新方法,无需使用液氮骤冷,大幅降低了多组织样品制片的难度,并且获得了正确的IHC染色结果,从而简化了实验流程,为组织形态学研究和抗原检测提供了可靠手段.