为了解目前流行的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的生物学特征及其遗传变异情况,从疑似感染TGEV的猪群中采集发病仔猪小肠,病料处理后在ST细胞上盲传,至第5代出现特征性细胞病变,通过PCR和间接免疫荧光验证,成功分离出2株TGEV,被命名为HE-1和HE-4.RT-PCR方法扩增测序其S基因,对14株TGEV S基因进化和变异情况进行分析.氨基酸比对发现,与TGEV经典毒株Purdue株相比,分离株在第562～564 aa处缺少NNT糖基化位点,与TS株相比在第375～377 aa处缺少NDT糖基化位点;同时,HE-4株在影响抗原位点D位点的第385 aa处发生突变.这种糖基化位点的缺失和抗原位点的突变,对TGEV生物学特性的影响有待进一步研究.

为了使猪圆环病毒2b型(PCV2b)Cap蛋白在猪圆环病毒病等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,本试验将编码PCV2b Cap蛋白的ORF2基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并构建pET-32a-ORF2重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21受体菌后,通过IPTG诱导表达重组蛋白,将重组蛋白用镍柱进行纯化并免疫大白兔,制备兔抗PCV2b Cap蛋白的多克隆抗体.利用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光及病毒交叉反应等试验对制备的多克隆抗体进行生物学特性检测.ELISA检测结果显示,该抗体效价可达到1∶216;Western blotting检测结果显示,该多克隆抗体可与PCV2b产生特异性的反应条带,说明其具有较好的反应活性;间接免疫荧光试验结果显示,该多克隆抗体能识别感染PK-15细胞中的PCV2b,说明该多克隆抗体具有鉴别诊断PCV2b的能力;病毒交叉试验结果显示,该多克隆抗体能与PCV2b反应,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪源病毒发生交叉反应,表明该多克隆抗体具有高度特异性.本试验制备的抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗体为PCV2b病原特性研究及该病的临床检测奠定基础.

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因序列设计2对反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立针对TGEV N基因的RT-LAMP快速检测方法,并对该检测方法的特异性与灵敏性进行了评价.该方法在63℃恒温下作用50 min,使TGEV N基因获得了高效率特异性扩增,与猪流行性腹泻病毒等其他猪易感病毒无交叉反应,具有很好的特异性;同时该方法具有极高的灵敏性,可检测到131.4 fg/μL的目标病毒DNA,比普通PCR的灵敏度高3个数量级.反应结束后加入SYBR Green Ⅰ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光.经47份临床样品RT-LAMP检测结果与已得到验证的RT-PCR和ELISA结果进行比对,结果显示符合率为100％.

This experiment was undertaken to prepare polyclonal antibody by immunization of BALB/c mouse with PEDV S gene eukaryotic expression plasmid (pVAX1-S) as antigen. The biological activity of the polyclonal antibody was assayed by indirect ELISA, indirect immunofluorescence (IF) test and Western Blot. The results showed that the antiserum titer was 1∶214. Not only the recombinant S protein could be identified by the polyclonal antibody, but also the PEDV-derived S protein. This study provided experimental basis of characterization of PEDV immunological properties and disease diagnosis.