目的 探索热休克蛋白60(HSP60)蛋白表达变化影响膀胱癌细胞逃避自然杀伤(NK)细胞免疫监视的作用及机制.方法 免疫组织化学染色法检测HSP60在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达,统计学分析HSP60在膀胱癌及癌旁组织的表达差异及HSP60表达水平与膀胱癌患者预后的相关性.利用腺病毒载体构建HSP60稳定干涉及过表达的膀胱癌细胞系并与NKL细胞共培养,ELISA及LDH释放实验检测NK细胞活化及杀伤能力的变化.Western blot法检测膀胱癌细胞乳酸脱氢酶A(LDHA)表达,试剂盒检测乳酸分泌.在HSP60稳定干涉及过表达的膀胱癌细胞系,利用小干涉RNA (siRNA)敲低或利用质粒过表达膀胱癌细胞中的LDHA,检测对NKL细胞杀伤能力的影响.利用线粒体活性氧探针MitoSOX检测线粒体活性氧(ROS)水平,Western blot法检测膀胱癌细胞缺氧诱导因子1α (HIF-1α)的蛋白表达,利用靶向线粒体抗氧化剂MitoEMPO及siRNA降低HSP60稳定干涉膀胱癌细胞中线粒体ROS及HIF-1α水平,探索HSP6O表达降低促进LDHA表达的具体机制.结果 膀胱癌组织HSP60蛋白的表达水平较癌旁组织显著降低,且HSP60表达越低的膀胱癌患者其预后越差;敲低HSP60蛋白表达可显著上调膀胱癌细胞LDHA的表达及乳酸的分泌,反之,过表达HSP60可显著抑制膀胱癌细胞LDHA的表达及乳酸的分泌;siRNA LDHA可显著增强HSP60敲低导致NKL细胞的杀伤抑制,同时过表达LDHA可显著抑制HSP60过表达导致NKL杀伤增强.此外,敲低膀胱癌细胞HSP60表达可通过激活ROS/HIF-1α通路促进LDHA的表达.结论 敲低膀胱癌细胞HSP60表达通过激活ROS/HIF-1α通路促进LDHA的表达,抑制NK细胞的杀伤作用.

目的 探索线粒体转录因子A(TFAM)表达下调促进膀胱癌细胞逃避NK细胞杀伤的作用及机制.方法 免疫组化检测膀胱癌及癌旁组织中TFAM的表达,统计学分析其表达差异及膀胱癌组织中TFAM表达水平与膀胱癌患者预后的相关性.利用慢病毒载体构建TFAM稳定干涉及过表达的膀胱癌细胞株并与NK细胞共培养,ELISA及LDH释放实验检测TFAM表达对NK细胞活化及杀伤的影响.qPCR、Western-blot及流式细胞术检测膀胱癌细胞中TFAM表达对人类的细胞抗原-G(HLA-G)表达的影响.同时,利用HLA-G中和抗体阻断TFAM干涉细胞与NK共培养体系中HLA-G功能,或者利用重组rHLA-G增强TFAM过表达膀胱癌细胞与NK细胞共培养体系中HLA-G功能后,检测膀胱癌细胞TFAM表达是否是通过HLA-G影响NK细胞的活化及杀伤.qPCR、Picogreen与Mitotracker共染膀胱癌细胞检测TFAM表达对线粒体DNA(mtDNA)应激发生的影响.利用DNA酶Ⅰ去除TFAM稳定干涉膀胱癌胞质mtDNA或者鱼藤酮阻断TFAM过表达膀胱癌细胞线粒体功能后,检测TFAM是否是通过mtDNA应激影响HLA-G的表达.结果 与癌旁组织相比,TFAM在膀胱癌组织中的表达显著减少,且TFAM表达越低的膀胱癌患者其预后越差.在膀胱细胞中干涉TFAM表达可通过上调HLA-G表达来抑制NK细胞的活化及杀伤.反之,在膀胱癌细胞中过表达TFAM可通过抑制HLA-G的表达来促进NK细胞的活化及杀伤.在TFAM干涉的膀胱癌细胞中加入DNA酶Ⅰ可显著抑制TFAM干涉诱导的HLA-G表达,在TFAM过表达的膀胱癌细胞中加入鱼藤酮可恢复TFAM过表达导致HLA-G表达下调.结论 TFAM表达下调诱导mtDNA应激促进HLA-G表达来抑制NK细胞的活化及杀伤.