将Ca2+响应实时荧光报告系统引入雌二醇诱导生长素结合蛋白(ABP1)调控表达的BY2细胞中,获得了 ABP1过表达(ABP1-ox)、抑制表达(ABP1-anti)同时对Ca2+标记的几个BY2细胞株.对这些细胞株进行雌二醇诱导调控其ABP1过表达或抑制表达后,分析ABP1的表达量,并通过在细胞外添加IAA处理,实时观察ABP1调控表达后细胞的Ca2+信号变化.结果表明:ABP1-ox细胞在雌二醇诱导后细胞内ABP1表达量显著提高,细胞经IAA处理后,细胞膜内、核膜周围均有迅速而强烈的荧光信号,说明ABP1过表达后细胞能快速响应胞外的IAA作用,将信号转导到细胞内,使细胞质内Ca2+信号迅速增强;而ABP1-anti细胞经雌二醇诱导后,细胞内ABP1表达显著下调,细胞经IAA处理后,相对于对照,细胞内的荧光信号微弱且呈点状,细胞核附近的荧光不明显,说明细胞内Ca2+信号的转导受到抑制.这证明BY2细胞中ABP1参与生长素信号与细胞内Ca2+响应的信号转导过程.

钙离子作为第二信使是细胞信号转导的重要成员,也是细胞信号转导研究的重要对象.为了更有效地实时观察植物细胞中的钙离子信号,将响应钙离子的水母素(aequorin,AEQ)基因转化到已由绿色荧光蛋白(GFP)标记的分泌载体膜蛋白SCMP2(secretive carrier membrane proteins 2)的烟草BY2细胞(SCAMP2-GFP).经过对转化细胞的筛选和分子检测,获得了双价转化的BY2细胞株.转化细胞经腔肠素处理并实时显微观察,能较清晰地观察到细胞中钙离子响应的荧光信号,水母素单价转化细胞则几乎观察不到荧光信号,说明水母素响应钙离子并作用于腔肠素所发弱荧光能进一步激发GFP荧光,使弱荧光有效增强.尽管响应钙离子的双价自激发荧光较利用外施激发光对GFP的激发荧光稍弱,但已能满足在显微镜下直接观察和采集信号的荧光强度,实现对细胞内钙离子的实时观察.通过拍照采集钙离子响应的荧光图像,在3倍于外激发的曝光时间条件下获得清晰的荧光图片.以上结果证明了双价标记法能有效地实时观察细胞的钙离子信号.对应于Aequorin与GFP融合表达的体系,双价转化法还能利用GFP不同亚细胞内定位的特定蛋白标记,对亚细胞水平的不同部位开展钙离子信号研究,体现出其优势.