目的 构建带Flag标签的RING结构泛素连接酶26(Ring finger protein 26,RNF26)真核表达载体,表达Flag-RNF26的融合蛋白,通过细胞免疫荧光实验,观察其在人肝癌细胞HepG2中的定位及与带绿色荧光蛋白标签的死骨片1(sequestosome 1,SQSTM1)是否存在共定位.方法 以人乳腺文库为模板,应用PCR技术扩增出RNF26的编码区序列,双酶切后插入带Flag标签的pCMV-Tag2B载体中,构建pCMV-Tag2B-RNF26重组质粒;将测序正确的重组质粒和pCMV-Tag2B空载体分别转染人胚肾293T细胞中,Western印迹检测融合蛋白表达情况,将成功表达的质粒pCMV-Tag2B-RNF26与pEGFP-SQSTM1质粒转染至人肝癌细胞HepG2中,进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察SQSTM1和RNF26的共定位情况.结果 插入片段的DNA序列测序结果与目的基因序列相同,Western印迹检测提示,融合蛋白成功表达;免疫荧光结果表明,RNF26与SQSTM1蛋白在细胞质中存在共定位.结论 pCMV-Tag2B-RNF26真核表达载体构建成功.带Flag标签的人RNF26蛋白在HepG2细胞内成功表达,且与SQSTM1蛋白存在共定位,为进一步研究RNF26和SQSTM1的相互作用关系建立了实验基础.

目的 构建带Flag标签的肾小管间质性肾炎抗原样蛋白1(Tinagl1)基因真核表达载体,检测其对肝癌细胞HepG2 ERK/AKT磷酸化、生长和迁移的影响.方法 以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增Tinagl1基因片段,将其插入pcDNA3.0载体,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染到肝癌HepG2细胞中,采用Western印迹检测重组蛋白对ERK和AKT磷酸化水平的影响,生长曲线和划痕实验检测其对肝癌细胞HepG2生长和迁移的影响.结果 双酶切和Western印迹结果表明,pcDNA3.0-Flag-Tinagl1真核表达质粒构建成功,Tinagl1可降低ERK和AKT的磷酸化水平;生长曲线和划痕实验表明Tinagl1抑制肝癌细胞HepG2生长和迁移.结论 构建了带Flag标签的Tinagl1真核表达载体,并能抑制肝癌细胞HepG2中ERK/AKT磷酸化、生长和迁移,为进一步研究Tinagl1在肝癌细胞中的功能奠定了基础.

目的 构建带pXJ-40-Myc标签的人肾小管间质性肾炎抗原样蛋白1(Tinagl1)真核表达载体,表达pXJ-40-Myc-Tinagl1融合蛋白,检测其对人宫颈癌细胞生长的影响.方法 以人卵巢文库为模板,采用PCR技术扩增Tinagl1编码区序列,双酶切后将其插入pXJ-40-Myc载体中,构建pXJ-40-Myc重组质粒;将重组质粒与空载体分别转染人宫颈癌HeLa细胞,Western印迹鉴定目的基因表达,CCK-8法、克隆形成实验测定其对宫颈癌HeLa细胞生长的影响,划痕实验检测Tinagl1对HeLa细胞运动迁移能力的影响.结果 双酶切鉴定表明,pXJ-40-Myc-Tinagl1真核表达质粒构建成功;转染HeLa细胞后融合蛋白表达,生长曲线、克隆形成及划痕实验结果表明,Tinagl1可抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移.结论 携带pXJ-40-Myc标签的人Tinagl1基因真核表达载体能在人宫颈癌HeLa细胞中表达,且能抑制该细胞的生长.该实验为进一步研究Tinagl1在肿瘤,尤其是妇科恶性肿瘤中的功能奠定了基础.

目的 构建SLC25A5基因的真核表达载体,同时验证该基因与肝癌细胞生长之间的关系.方法 以人乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出SLC25A5的CDS区编码序列,应用双酶切将PCR产物插入到带Flag标签的pCMV?Tag2B载体上,酶切和测序验证后转染到人肝癌HepG2细胞中,通过Western印迹检测其表达情况,CCK?8法、克隆形成实验测定其对肝癌HepG2细胞生长的影响.结果 双酶切结果显示,pCMV?Tag2B?Flag?SLC25A5真核表达载体构建成功;提取质粒转染人肝癌HepG2细胞;Western印迹技术验证该基因蛋白成功表达;CCK?8法和克隆形成实验证明过表达pCMV?Tag2B?Flag?SLC25A5促进肝癌HepG2细胞增殖.结论 pCMV?Tag2B?Flag?SLC25A5真核表达载体构建成功,并证明其可促进肝癌细胞增殖,为进一步研究SLC25A5在肝癌中的发生发展作用奠定了基础.

目的 构建人AP2β基因慢病毒(lentivirus)表达载体,并检测其过表达对肝癌细胞HepG2生长的影响.方法 从人乳腺文库中采用PCR技术扩增出人AP2β基因编码序列,并将其插入pCDH载体,获得pCDH-AP2β真核表达载体;将其与包装载体转染293T,包装成Lenti-AP2β慢病毒并测定病毒滴度,感染肝癌HepG2细胞,Western印迹检测病毒载体介导的AP2β蛋白的表达情况,并进行生长曲线实验研究过量表达AP2β对HepG2细胞生长的影响.结果 双酶切和Western印迹表明,pCDH-AP2β真核表达质粒构建成功,包装成滴度为2.5×107 PFU/ml的Lenti-AP2β慢病毒载体;将此慢病毒载体感染HepG2细胞,Western印迹显示,慢病毒载体成功表达AP2β,生长曲线和克隆形成实验结果 表明,AP2β过表达可抑制肝癌细胞HepG2的生长.结论 构建了AP2β的慢病毒表达载体Lenti-AP2β,在HepG2细胞中过量表达AP2β可抑制细胞的生长,该实验为进一步研究AP2β在肝癌中的功能奠定了基础.

目的 通过构建慢病毒介导的靶向AP2β基因短发夹RNA(shRNA)重组质粒,观察AP2β低表达对肝细胞癌(HCC)细胞生物学功能的影响.方法 构建人AP2β慢病毒shRNA质粒,将重组质粒转染至人胚肾293T细胞.AP2βshRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞包装成慢病毒后感染HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞,通过实时定量PCR(qRT-PCR)及Western印迹检测AP2βshRNA干扰效果;利用CCK-8法和细胞划痕实验检测沉默AP2β对HepG2细胞生长、增殖及侵袭迁移的影响.结果 AP2βshRNA能有效沉默AP2β基因;CCK-8法、细胞划痕实验提示,沉默AP2β可促进HepG2细胞生长、增殖及侵袭迁移.结论 慢病毒介导的AP2β敲减重组质粒构建成功,且沉默AP2β可促进HepG2细胞生长、增殖及侵袭迁移,因此AP2β可能是HCC治疗的一个潜在新靶点.

目的 构建带Flag标签pcDNA3.0载体的沉默信息调节因子2(Sirt2)真核表达载体,验证其表达蛋白与M2型丙酮酸激酶(PKM2)的相互结合.方法 利用聚合酶链反应(PCR)从人乳腺文库中扩增出人Sirt2的CDS编码序列,将扩增出的Sirt2基因片段插入双酶切后pcDNA3.0-Flag载体上,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后提取质粒,验证表达,测序正确后,分别转染pcDNA3.0-Flag/myc-PKM2和Flag-Sirt2/myc-PKM2共转染至人胚肾细胞(293T),通过免疫共沉淀实验证明Sirt2蛋白表与PKM2蛋白有相互结合.结果 重组质粒Flag-Sirt2的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;免疫共沉淀实验证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合.结论 成功构建了Flag-Sirt2真核表达载体,证实Sirt2蛋白与PKM2蛋白有相互结合,为进一步研究Sirt2在糖酵解中发挥的功能提供了基础.