Aim. Evaluate antibacterial activity of an experimental mixture of phages, belonging to several well-studied species. Materials and methods. The study was carried out using a group of 55 clinical Pseudomonas aeruginosa strains of various origins, 4 mono-species mixtures of 32 virulent bacteriophages (species phiKZ-, phiKMV-, phiPBl-, РаРЗ-like phages) and 2 novel phages, phiMK (species PaK-P2) and phiPerm5. Activity of preparations from mono-species mixtures of bacteriophages of various species were compared with activity of 3 commercial mixtures. Standard methods of study of bacteriophages were used: determination of lytic activity by seeding onto bacterial lawns of P. aeruginosa, restriction analysis of phage DNA for confirmation of their belonging to certain species. Results. Cumulative activity of 6 mono-species mixtures of virulent phages was shown to be similar to lytic activity of commercial therapeutic mixtures used against P. aeruginosa infections. 54 of 55 strains of clinical isolates of P. aeruginosa showed sensitivity to experimental mixtures composed of mono-species mixtures of bacteriophages. 53 strains were lysed by commercial preparations. Wherein the possibility of accidental inclusion of moderate bacteriophages in the experimental mixture is excluded. Conclusion. A possibility of creation of highly active therapeutic antibacterial preparations against P. aeruginosa using mono-species mixtures of 6 species of lytic bacteriophages is shown. Use of such a mixture in therapy of lung infections reduces the risk of emergence of bacterial strains with increased virulence and pathogenicity during prolonged administration.

Приведены результаты изучения нового вирулентного фага phiPMG1, активного на бактериях вида Pseudomonas aeruginosa. Показано, что phiPMG1 проявляет значительную гомологию и сходство в общей структуре генома с умеренным конвертирующим фагом D3. Фаг phiPMG1 отличается от D3 тем, что не способен осуществлять стабильную лизогенизацию и растет на штаммах с плазмидами, подавляющими развитие фага D3 и некоторых других фагов. Это понижает вероятность горизонтального генетического переноса фагом phiPMG и делает возможным его использование в фаготерапии. Сравнение структуры геномов фагов phiPMG1 и D3 выявило не только значительную гомологию 65 генов, но и присутствие в геноме phiPMG1 16 генов, не представленных в базе данных NCBI. Мы предполагаем, что эволюция геномов фагов этого вида в значительной степени связана с миграциями в другие виды бактерий и рекомбинациями с фагами других видов (например, F116). Подробный анализ структуры одной из областей геномов, в которой проявляется существенная негомология у трех D3-подобных фагов (D3, phiPMG1 и PAJU2), показал, что возможно геном phiPMG1 ближе других к геному гипотетического предкового фага этого вида.

Results of studying the novel virulent phage phiPMG1 active on Pseudomonas aeruginosa are presented. It is shown that phiPMG1 exhibits significant homology and the similarity in the overall structure with the genome of a temperate phage converts D3. Phage phiPMG1 differs from D3 in that it fails to stably lysogenize bacteria and can grow on strains carrying plasmids that cause growth inhibition of phage D3 and some other phages. This significantly diminishes the probability of horizontal gene transfer with phage phiPMG1 and suggests the possible employment of this phage in phage therapy. A comparison of phages phiPMG1 and D3 structures of genomes in demonstrated not only high homology of 65 genes, but also the presence of 16 genes in the phiPMG1 genome that were not included in the in NCBI database. Apparently, the evolution of genomes in phages of this species is mostly associated with migrations into other species of bacteria, and recombinations with phages of other species (for example, F116). A detailed analysis of structure of one region genomes, which significant nonhomology for the three D3-like phages (D3, phiPMG1 and PAJU2), revealed that the phiPMG1 genome possible closest to a hypothetical genome of ancestral phage of this species.

Продолжено изучение явления псевдолизогении у бактерий Pseudomonas aeruginosa, инфицированных phiKZ-подобными фагами вида EL. Проведен анализ группы вновь изолированных vir-мутантов фагов вида EL (EL и RU), проявляющих вирулентность (способность лизировать бактерии, зараженные фагом дикого типа) и пониженный уровень опалесценции негативных колоний (НК). Выявление рекомбинантов дикого типа в скрещиваниях vir-мутантов фагов EL и RU подтверждает полигенный контроль этого признака. Делеционный характер мутации у одного из vir-мутантов фага EL, а также высокий уровень генетической нестабильности другого мутанта предполагают возможное участие в мутагенезе мобильного генетического элемента. Возникновение в бактерии псевдолизогенного состояния создает условия для горизонтального переноса генов между разными штаммами бактерий. Таким образом, только секвенирования геномов фагов и доказательства отсутствия у них генопродуктов с токсическим эффектом оказывается недостаточным для включения фагов в лечебные смеси. Обязательным условием использования живых фагов является детальное изучение возможных результатов их взаимодействия с бактериальным хозяином.

Приведены результаты исследования генома умеренного ореолобразующего бактериофага Pseudomonas aeruginosa phi297 и литической активности его вирулентного мутанта. Определение полной последовательности генома этого бактериофага обнаружило его мозаичную структуру. Часть последовательности генома phi297 гомологична последовательности генома фагов D3 и F116. Особенности морфологии негативных колоний (НК) умеренного бактериофага P. aeruginosa phi297 позволили предположить, что он обладает высокой литической активностью. Был выделен вирулентный мутант фага phi297vir, способный лизировать бактерии, лизогенные по фагу дикого типа. Сравнение литической активности phi297vir с литической активностью фагов из коммерческих смесей двух производителей (предприятий Нижнего Новгорода и Перми) показало, что phi297vir способен лизировать мутанты бактерий РАО1, устойчивые к фагам из коммерческих препаратов, но спектр литической активности phi297vir уже, чем у фагов коммерческих препаратов. Проведенное исследование показало, что применение неревертирующих вирулентных мутантов некоторых умеренных бактериофагов может быть целесообразно в лечении инфекций, вызванных P. aeruginosa.

В настоящей работе впервые получено окончательное доказательство возможности перехода бактерий P. aeruginosa в псевдолизогенное состояние после инфекции phiKZ-подобными фагами. Показано, что решающим фактором в этом процессе является множественное заражение бактерий бактериофагами этого рода. В ходе работы были обнаружены стабильные клинические изоляты бактерий, выделяющие новые бактериофаги этого рода (Che2/2 и Che21/5), отнесенные по фенотипическим признакам и результатам анализа ДНК к видам phiKZ и EL, соответственно. Для трех бактериофагов вида EL – EL, RU и Che21/5 удалось выделить мутанты с нарушенной способностью к псевдолизогенизации. Один из мутантов фага EL имеет свойства вирулентных мутантов типичных умеренных фагов (“vir” – мутант). Он не образует псевдолизогенов и, более того, проявляет эффект доминантности при коинфекции бактерий с фагом дикого типа EL и не проявляет его при совместной инфекции бактерий с фагами дикого типа видов phiKZ и Lin68. Предполагается, что эффект псевдолизогении может быть связан с функционированием генов фагов phiKZ и EL, контролирующих продукты, сходные с репрессорами других фагов. Учитывая обнаруженное нами ранее присутствие в коммерческих фаготерапевтических препаратах phiKZ-подобных фагов дикого типа, что может создавать определенные проблемы, представляется целесообразным использовать вместо фагов дикого типа этого рода их вирулентные мутанты.

Проведено сравнение группы фагов Pseudomonas putida, отнесенных к пяти видам (af, phi15, phi27, phi2F и pf16), общим признаком которых является образование ореолов (зон просветления) вокруг негативных колоний (НК) фага. Ореол вокруг НК фагов возникает как результат уменьшения или исчезновения полисахаридных капсул бактерий. Концентрация жизнеспособных бактерий в ореоле не понижается. С помощью простого метода проведено сравнение специфичности продуктов разных фагов, вызывающих образование ореолов. Показано, что они являются высокоспецифичными и не проявляют активности в отношении других видов псевдомонад. Фагоустойчивые мутанты P. putida, отобранные к разным фагам и утратившие адсорбцию, в большинстве случаев устойчивы к действию ореол-образующих продуктов. По-видимому, при этом происходит утрата капсульных полисахаридов, являющихся и субстратом для деполимераз, и первичными рецепторами для фагов. Частичное секвенирование генома фага af обнаружило открытую рамку считывания, кодирующую фермент трансгликозилазу, сходную не с лизоцимами других фагов, а с трансгликозилазами олиготрофных бактерий разных видов. Возможно, это полифункциональный фермент, совмещающий функции лизоцима и фермента, осуществляющего проникновение фаговой частицы через внеклеточную слизь и капсулу.

Comparison of Pseudomonas putida group of phages attributed to five species (af, ϕ15, ϕ27, ϕ2F, and pf16) with their common property of halo-formation (formation of lightening zones) around phage plaques was conducted. The halo around phage plaques appears as a result of reduction or disappearance of bacterial polysaccharide capsules. The concentration of viable bacteria remains unchanged within the halo. A comparison of specificities of halo-formation products from various phages was conducted by a simple method. These products were shown to be highly specific and inactive on other species of pseudomonads. Phage-resistant P. putida mutants scored with respect to various phages, which lost phage adsorption ability, were tolerant to the effect of halo-formation products in most cases. Apparently, the capsular polysaccharides, which serve as a substrate for depolymerases and are the primary phage receptors, may be often lost. Results of partial sequencing of the af phage genome revealed an open reading frame that encodes the enzyme transglycosylase similar rather to transglycosylases of oligotrophic bacteria belonging to different species than to lysozymes of other phages. Possibly, it is a polyfunctional enzyme combining functions of lysozyme and an enzyme that executes the penetration of phage particle across extracellular slime and capsule.

The T7-like phiKMV bacteriophage active on Pseudomonas aeruginosa was previously isolated by us and shown to have DNA resistant to many endonucleases. A loss of sensitive sites might be a consequence of a long phiKMV evolution on different hosts. To elucidate, whether this trait is shared by other similar phages, several new phiKMV-like phages were isolated from different sources and compared. All studied phiKMV-like phages formed three groups, insignificantly differing in the number and localization of endonuclease-sensitive DNA sites. This confirms that the present-day phages of this species have highly conserved genomes. Mutational "restoration" of the lost sites may be restricted by a lethal effect. The phiKMV-like phages were shown for the first time to increase the rate of in vitro accumulation of giant phiKZ-like phages of P. aeruginosa. This effect is characteristic only of phiKMV-like phages.

To study the genome diversity of bacteriophages from geographically distant natural populations, new giant phi KZ-like Pseudomonas aeruginosa phages isolated in two different regions were compared with earlier known phages of three species (phi KZ, Lin68, EL). A broad spectrum of lytic activity was demonstrated for all phi KZ-like phages. Phages of the phi KZ species proved to be common in natural populations of various regions, while IL- and Lin68-related phages were extremely rare. Most phi KZ-related phages had unique DNA restriction patterns, but the differences between these were only minor, and the genomes did not contain nonhomologous fragments. The spectrum of capsid polypeptides proved to be conserved in each species, and was proposed as a character necessary and sufficient for express classification of phages with an accuracy of species. Phages isolated in different geographical regions showed no substantial difference. Some phages only slightly differing in DNA restriction pattern from phi KZ may be used to study the origin of phi KZ genes coding for orthologs of proteins of unrelated species (other phages, pathogenic bacteria, eukaryotes).

The complete DNA sequence of a new lytic T7-like bacteriophage φKMV is presented. It is the first genome sequence of a member of the Podoviridae that infects Pseudomonas aeruginosa. The linear G + C-rich (62.3%) double-stranded DNA genome of 42,519 bp has direct terminal repeats of 414 bp and contains 48 open reading frames that are all transcribed from the same strand. Despite absence of homology at the DNA level, 11 of the 48 φKMV-encoded putative proteins show sequence similarity to known T7-type phage proteins. Eighteen open reading frame products have been assigned, including an RNA polymerase, proteins involved in DNA replication, as well as structural, phage maturation, and lysis proteins. Surprisingly, the major capsid protein completely lacks sequence homology to any known protein. Also, the strong virulence toward many clinical P. aeruginosa isolates and a short replication time make φKMV attractive for phage therapy or a potential source for antimicrobial proteins.

A comparative study was made of a group of Pseudomonas aeruginosa virulent giant DNA bacteriophages similar to phage φKZ in several genetic and phenotypic properties (particle size, particle morphology, genome size, appearance of negative colonies, high productivity, broad spectrum of lytic activity, ability to overcome the suppressing effect of plasmids, absence of several DNA restriction sites, capability of general transduction, pseudolysogeny). We have recently sequenced the phage φKZ genome (288 334 bp) [ J. Mol. Biol. , 2002, vol. 317, pp. 1–19]. By DNA homology, the phages were assigned to three species (represented by phages φKZ, Lin68, and EL, respectively) and two new genera (φKZ and EL). Restriction enzyme analysis revealed the mosaic genome structure in four phages of the φKZ species (φKZ, Lin21, NN, and PTB80) and two phages of the EL species (EL and RU). Comparisons with respect to phage particle size, number of structural proteins, and the N-terminal sequences of the major capsid protein confirmed the phylogenetic relatedness of the phages belonging to the φKZ genus. The origin and evolution of the φKZ-like phages are discussed. Analysis of protein sequences encoded by the phage φKZ genome made it possible to assume wide migration of the φKZ-like phages (wandering phages) among various prokaryotes and possibly eukaryotes. Since the phage φKZ genome codes for potentially toxic proteins, caution must be exercised in the employment of large bacteriophages in phage therapy.

We have isolated several new temperate bacteriophages for rhizosphere pseudomonads Pseudomonas putida. Examination of these phages, along with two previously isolated temperate phages PP56 and PP71 of P. putida PpG1 (biovar A), allowed us to classify them into four species on the basis of DNA cross-homology; relative genomic size; and, to a certain extent, the morphology of phage particles. Two of these species are represented by nonidentical variants. No transposable phages were found among these two new species. Three phage species cause various-types of lysogenic conversion manifested in growth suppression of other phage species. This seems to account for the fact that the temperate phage of rhizosphere pseudomonads are seldom encountered. The new phages described can be used for selection of phage-resistant bacterial forms exhibiting antifungal activity that are commercially produced and used for treatment of seeds of cultivated plants.