Известно, что кратковременные эпизоды гипоксии защищают нейроны от гибели при глобальной гипоксии и ишемии (гипоксическое прекондиционирование). Эти же воздействия вызывают постгипоксическую гипервозбудимость в период реоксигенации, что может привести к гибели отдельных популяций нейронов, отличающихся повышенной чувствительностью к гипоксии. В настоящей работе сравнили действие кратковременной гипоксии на развитие эффектов прекондиционирования и постгипоксической гипервозбудимости в двух популяциях нейронов: тормозных ГАМКергических и возбуждающих глутаматергических. Эффект прекондиционирования оценивали по степени подавления активности NMDA-рецепторов. Постгипоксическую гипервозбудимость регистрировали по появлению спонтанного синхронного Са2+-спайка в нейрональной сети в период реоксигенации после каждого эпизода гипоксии. Показано, что эффект прекондиционирования развивается только в глутаматергических нейронах и отсутствует в ГАМКергических. Активность NMDA-рецепторов в этих нейронах не подавляется, а возрастает после каждого эпизода гипоксии. В момент генерации постгипоксического синхронного Ca2+-спайка в части ГАМКергических нейронов происходит глобальное повышение базального уровня Са2+ с последующей их гибелью. Противовоспалительный цитокин интерлейкин-10 (ИЛ-10) препятствует развитию постгипоксической гипервозбудимости, ингибируя спонтанный синхронный Са2+-спайк, и защищает ГАМКергические нейроны от гибели, восстанавливая в них эффект прекондиционирования. Ингибиторы PI3-киназы – вортманнин и LY294.002 – препятствуют развитию защитного эффекта ИЛ-10, отменяя ингибирующий эффект ИЛ-10 на генерацию спонтанного синхронного Ca2+-спайка. Полученные данные указывают на ведущую роль ГАМКергических нейронов в развитии постгипоксической гипервозбудимости. Предполагается, что возникновение гипервозбудимости в нейрональной сети обусловлено ослаблением тормозного влияния ГАМКергических нейронов. Активация различных сигнальных путей, ведущих к росту фосфорилирования, зависящего от протеинкиназ B и G, в нейронах этого типа является возможной стратегией защиты нервных клеток при гипоксии.

Исследование проведено на культивируемых адипоцитах белой жировой ткани мышей. Преадипоциты были выделены у здоровых животных и животных с ожирением и диабетом 2-го типа. С помощью окрашивания жировых пулов красителем Oil red показано, что в клетках нормальных животных на 3–9 день культивирования в присутствии глюкозы происходит формирование пулов триглицеридов. В адипоцитах из животных с диабетом 2-го типа формирование пулов триглицеридов не наблюдается. Культивирование последних в тех же условиях, но с добавлением 1 мкМ пальмитоил-карнитина приводило к образованию жировых капель в клетках. Амплитуда Са2+-ответа адипоцитов, выделенных из тучных животных, на главный активатор липолиза норадреналин была гораздо ниже по сравнению с контрольными животными. Са2+-ответ на норадреналин адипоцитов из мышей с диабетом 2-го типа практически отсутствовал. Культивирование в присутствии 100 нМ пальмитоил-карнитина приводило к восстановлению Са2+-ответов в адипоцитах, полученных из тучных животных и животных с диабетом 2-го типа.

В экспериментах на культивируемых адипоцитах мышей (9 дней in vitro) с использованием флуоресцентной микроскопии показано, что пептидные гормоны: предсердный натрийуретический пептид (ANP), холецистокинин (ССК) и ангиотензин II (AngII) вызывают периодические высокоамплитудные Са2+-колебания. Колебания, индуцированные ANP, подавлялись конкурентным ингибитором ADP-рибозилциклазы (CD38) – никотинамидом. Колебательные режимы, инициированные холецистокинином, подавлялись ингибиторами фосфолипазы С и протеинкиназы G, но не подавлялись ингибиторами NO-синтазы. Низкие концентрации (1–50 нМ) ангиотензина II вызывали Са2+-колебания в части адипоцитов, тогда как более высокие концентрации AngII (0,1–0,5 мкМ) вызывали транзитное увеличение [Ca2+]i. Преинкубирование адипоцитов с ингибитором фосфатидил-инозитол-3-киназы – вортманнином приводило к уменьшению амплитуды Ca2+-ответа, а ингибирование протеинкиназы G с помощью КТ5823 снижало скорости увеличения и откачки [Ca2+]i.

С использованием методов флуоресцентной микроскопии, иммунохимии и ПЦР-анализа проведено сравнительное исследование особенностей динамического поведения и экспрессии генов IP3 и NO/cGMP зависимых Са2+-сигнальных и метаболических путей адипоцитов здоровых мышей и животных с ожирением и диабетом 2-го типа (D2T). Показано, что культивируемые адипоциты (9DIV), выделенные из эпидидимальных депо белой жировой ткани здоровых мышей при аппликации 1–10 мкМ ацетилхолина (Ach) или норадреналина (NE) способны генерировать разнообразные Са2+-колебания, триггерные переключения и Са2+-спайки. Периоды колебаний растут при увеличении размеров клеток до 150–200 мкм и накоплении в них липидов. Культивируемые адипоциты животных с ожирением способны расти и накапливать липиды только в присутствии жирных кислот в среде. В таких клетках Ach и NE (15–30 мкМ) приводят только к генерации Са2+-спайков с выходом на плато. У животных с Д2Т зрелые гипертрофированные адипоциты имеют малый объем свободной, не занятой липидами цитоплазмы. В таких клетках Ach и NE также могут вызвать только Са2+-импульсы малой амплитуды или монотонный рост [Са2+]i. Утрата клетками способности генерировать разнообразные типы Са2+-ответов при ожирении и Д2Т может быть связана с наблюдаемыми сдвигами и подавлением экспрессии ряда генов, контролирующих Са2+-сигнальные пути (в первую очередь с участием NO/cGMP/cADPr) и метаболические пути синтеза и распада липидов клеток жировой ткани.

Using selective receptor's agonist and antagonists we show that mouse white fat cells express alpha1A-, alpha2-adrenergic receptors, which activation with noradrenaline is capable of causing calcium responses different by formation mechanism. Adipocyte's calcium responses to alpha1-adrenoreceptor agonists are caused by alpha1A-type adrenoreceptor and suppressed by inhibitors of PLC-dependent pathway. Calcium responses to alpha2-adrenoreceptors agonists are realized only in the presence of more than 200 microM of L-arginine and suppressed by inhibitors of NOS-PKG-RyR pathway. The incubation of cells with L-arginine creates conditions for switching on the signal pathway with participation of eNOS --> NO --> sGC --> cGMP --> PKG --> CD38 --> RyR --> Ca2+ and for switching of the PLC - IP3R-dependent pathway. Adipocyte's calcium response to L-arginine represents a sharp impulse of the big amplitude and is mediated by alpha2-adrenoreceptors. L-arginine activating alpha2-adrenoreceptors and being the substrate of eNOS, realizes two functions in this pathway.

В работе показано, что активация NMDA-рецепторов, с последующими кратковременными эпизодами гипоксии, способна приводить к появлению спонтанного транзиторного увеличения концентрации цитозольного кальция (s[Ca2+]i) в период реоксигенации, амплитуда которого может возрастать при последующих эпизодах гипоксии, что является признаком постгипоксической гипервозбудимости нейронов. Генерация s[Ca2+]i никогда не происходит во время кратковременных эпизодов гипоксии без предварительной активации NMDA-рецепторов селективным агонистом, либо в отсутствие эпизодов гипоксии при активации NMDA-рецепторов. Постгипоксический Са2+ импульс наблюдается также в бескальциевой среде, но с меньшей амплитудой, что свидетельствует о минорной роли входа кальция снаружи в механизме генерации s[Ca2+]i. Ингибитор SERCA – тапсигаргин в концентрациях, вызывающих опустошение кальциевых запасов эндоплазматического ретикулума, предотвращает появление s[Ca2+]i во всех нейронах. А использование малых концентраций тапсигаргина (100нМ) приводит к увеличению амплитуды s[Ca2+]i, что является подтверждением ведущей роли внутриклеточных запасов Са2+ в генерации s[Ca2+]i. Ингибиторы фосфолипазы С препятствуют появлению признаков постгипоксической гипервозбудимости. Ингибитор рианодинового рецептора – рианодин ‒ не влияет на появление и нарастание амплитуды s[Ca2+]i. Таким образом, в механизме формирования постгипоксической гипервозбудимости нейронов гиппокампа ведущую роль играет мобилизация кальция при активации IP3-рецептора эндоплазматического ретикулума.

В экспериментах на культивируемых белых адипоцитах мышей с использованием флуоресцентной микроскопии и систем анализа изображений показано, что нейротрансмиттер норадреналин или агонисты β-адренорецепторов – изопротеренол, BRL-37344 в присутствии антагониста α1/2-адренорецепторов фентоламина вызывали увеличение [Ca2+]i в клетках. Селективный антагонист всех трех подтипов β-адренорецепторов – пропраналол подавлял этот Са2+ -ответ. Максимальная амплитуда [Ca2+]i наблюдалась при аппликации активатора β3-адренорецепторов – BRL-37344. Увеличение [Ca22+]i, инициированное активацией β-адренергических рецепторов, осуществляется аденилатциклазной системой трансдукции сигналов. С помощью селективных активаторов аденилатциклазной системы – форсколин, 8-Bromo-cAMP и ингибиторов протеинкиназы А (H-89) и рианодинового рецептора (рианодин) − показано, что сАМР, протеинкиназа А и рианодиновые рецепторы являются участниками пути генерации медленно-развивающегося Са2+ -ответа в культивируемых адипоцитах белого жира мыши.

В невозбудимых клетках известно несколько видов агонист-индуцируемых колебаний концентрации цитозольного Ca2+ ([Ca2+]i), которые различаются по форме и по механизму их генерации. Источником колебаний, как правило, является регуляция мобилизации Са2+ из внутриклеточных запасов через рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3R) и в некоторых случаях – через рианодиновые рецепторы (RyR). В настоящей работе изучены колебания в одиночных зрелых адипоцитах эпидидимального жира мышей на девятый день культивирования. Клетки стимулировались ацетилхолином (ACh) или эмбриональной коровьей сывороткой (FBS). ACh в концентрации 0.1–5 мкМ вызывал рост [Ca2+]i до некоторого пика и последующие колебания, у которых максимумы и минимумы постепенно опускались вместе с ростом амплитуды, а частота уменьшалась. В большинстве клеток колебания длились менее 5 мин. Новый постоянный или межспайковый уровень был выше исходного или равным ему (при 1 мкМ ACh). Удаление ACh сразу прекращало колебания. Ингибитор фосфолипазы C (U73122) и ингибитор IP3R (ксестоспонгин C) не влияли на характер ответов, откуда следует, что генерация колебаний не зависит от IP3. В то же время наблюдалось подавление ответов рианодином, блокирующим RyR. Кроме того, колебательные ответы устранялись ингибиторами ADP-рибозилциклазы, фосфатидилинозитол-3-киназы, NO-синтазы и cGMP-зависимой протеинкиназы. FBS (1%) инициировала колебания, для которых характерны возвращение [Ca2+]i после каждого пика к базальному уровню, существовавшему до стимуляции, а также сохранение примерно одинаковой амплитуды и частоты (порядка 1 мин-1). Колебания продолжались дольше (более 15 мин у 87% клеток), чем с ACh. Повторная стимуляция клеток посредством FBS выявила сильно сниженную чувствительность через 1 ч покоя, тогда как ответы на AСh частично восстанавливались через 3 мин. Исследование участия IP3R и RyR в FBS-индуцируемых колебаниях дало полностью противоположные результаты относительно ACh и продемонстрировало ведущую роль IP3R без существенного вклада RyR и путей его активации. С обоими стимулами вход Са2+ через плазматическую мембрану необходим лишь для поддержания колебаний. Результаты показывают, что в адипоцитах различные агонисты могут задействовать различные подсистемы кальциевой сигнализации, каждая из которых генерирует колебания, имеющие свой специфический временной ход.

В экспериментах на культивируемых адипоцитах мышей (9 дней in vitro) с использованием флуоресцентной микроскопии показано, что активация 1- и 2-адренорецепторов норадреналином (NE) или 2-адренорецепторов L-аргинином приводит к генерации импульсных Са2+-сигналов, а активация m3-холинорецепторов ацетилхолином (AСh) или бетаином вызывает периодические или затухающие Са2+ колебания. Наличие 100–200 мкМ L-аргинина в среде инкубации необходимо для полного проявления описываемых эффектов, по-видимому, за счет перевода протеинкиназы G (PKG) и фосфодиэстеразы (PDE) типа V в активное состояние. На фоне L-аргинина (1–10 мМ) амплитуда Ca2+-импульсов в ответ на NE увеличивается, а длительность сигнала уменьшается. При последовательных добавках AСh и NE происходит потенциирование наблюдаемых режимов. С использованием ингибиторного анализа показано, что наблюдаемые режимы связаны с функционированием сигнального пути с участием фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), протеинкиназы B (PKB), эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), цитозольной гуанилатциклазы (sGC), PKG, ADP-рибозилциклазы (CD38), и рианодинового рецептора (RyR). В системе сигнализации возможно формирование нескольких петель положительных и отрицательных обратных связей (ПОС и ООС соответственно): 1) коротких петель ПОС, возникающих за счет Ca2+-зависимого выброса Ca2+ (CICR) из депо через рецепторы IP3R и RyR и участвующих в формировании импульсных сигналов; 2) длинной петли ПОС с участием Ca2+ eNOS sGC PKG CD38 RyR Ca2+, функционирование которой может обеспечить необходимые условия для генерации кальциевых колебаний с участием короткой петли ПОС (CICR); 3) нескольких петель ООС, основанных на ингибировании IP3R и на активации Са2+-АТP-аз сарко(эндо)плазматического ретикулума и плазматической мембраны посредством PKG, обеспечивающих выключение сигнализации в цепочке фосфолипаза C IP3R Ca2+ и ограничивающих рост [Ca2+]i при активации сигнального пути PI3K PKB eNOS sGC PKG CD38 RyR Ca2+. Конвергенция сигнальных путей с участием 1-, 2- и m3-рецепторов через G