Штамм Rhodococcus ruber Р25 использует 4-хлорбифенил (4ХБ) и 4-хлорбензойную кислоту (4ХБК) в качестве единственного источника углерода и энергии. Разложение 4ХБ отмытыми клетками штамма Р25 сопровождается кратковременным образованием 4ХБК с последующей ее утилизацией и выделением эквимолярных количеств ионов хлора в среду. Штамм R. ruber P25 обладает активными ферментными системами, обеспечивающими разложение 4ХБК через стадии образования интермедиатов – пара-гидроксибензоата (ПГБК) и протокатеховой кислоты (ПКК), до соединений основного обмена. Впервые показано участие протокатехоат 4,5-диоксигеназы в процессе деструкции 4ХБК родококками. Установлено, что начальный этап разложения 4ХБК, дегалогенирование, у штамма R. ruber P25 контролируется fcbA и fcbB генами, кодирующими 4ХБК-СоА-лигазу и 4ХБК-СоА-дегалогеназу, соответственно. Гены, кодирующие компоненты 4ХБК дегалогеназы, у бактерий рода Rhodococcus обнаружены и охарактеризованы впервые.

Показана способность штаммов-деструкторов различных ароматических соединений утилизировать тринитротолуол (ТНТ) в концентрации до 70 мг/л. Увеличение концентрации ТНТ от 100 до 150 мг/л не ингибировало скорость конверсии этого соединения штаммом Kocuria palustris RS32. Штамм Acinetobacter sp. VT11 использовал ТНТ в качестве единственного субстрата для роста. Среди интермедиатов деградации ТНТ активными штаммами Pseudomonas sp. VT-7W и Kocuria rosea RS51 идентифицированы 3,5-динитро-4-метил-анилид уксусной кислоты и 2,6-динитро-4-аминотолуол. При деструкции ТНТ штаммами бактерий Rhodococcus opacus 1G и Rhodococcus sp. VT-7 впервые обнаружен 4-метил-3,5-динитроформамид. Активные бактериальные штаммы при интродукции в почву осуществляли разложение ТНТ на 82–90%.

При культивировании в жидкой среде бактерия Rhodococcus opacus 1G была способна к росту на феноле в концентрации до 0.75 г/л. Иммобилизация R. opacus 1G оказывала положительное влияние на способность клеток расти при высоких концентрациях фенола – полная утилизация субстрата в количестве 1.0 и 1.5 г/л происходила за 24 и 48 ч соответственно. Выделены ключевые ферменты деструкции фенола – две пирокатехин-1,2-диоксигеназы и муконатциклоизомераза. Показано, что одна из диоксигеназ была крайне нестабильной. Второй фермент по субстратной специфичности относится к пирокатехин-1,2-диоксигеназам обычного орто-пути. Ингибиторами конкурентного типа пирокатехин-1,2-диоксигеназы являлись хлорпирокатехины и хлорфенолы, ингибирующий эффект других ароматических соединений был выражен значительно слабее. Обсуждается возможность использования данного штамма для очистки стоков фенольных производств.

Установлено, что штаммы Rhodococcus sp. 400, R. rhodochrous 172, R. opacus 6а используют 4-метилбензоат в качестве единственного источника углерода и энергии. Отмечено, что ключевым интермедиатом деструкции является 4-метилпирокатехин; его дальнейшее расщепление всеми штаммами происходит в орто-положении. Обнаружено, что удельная активность пирокатехин-1,2-диоксигеназ в бесклеточном экстракте штаммов Rhodococcus sp. 400 и R. rhodochrous 172 с 3- и 4-метилпирокатехинами не превышает активности с пирокатехином. Из биомассы штамма R. opacus 6a, выращенной на пара-толуате, выделены две пирокатехин-1,2-диоксигеназы, различающиеся по молекулярной массе, физико-химическим и каталитическим характеристикам. Одна из них относится к типу ферментов, раскрывающих кольцо пирокатехинов, - метилпирокатехин-1,2-диоксигеназам - и впервые найдена у бактерий рода Rhodococcus.

Работа посвящена изучению разложения napa-толуиловой кислоты штаммом Rhodococcus opacus l cp. Определена активность ключевых ферментов этого процесса - пирокатехин- 1,2-диоксигеказ и муконатциклои-зомеразы. Обнаружено, что рост на n-толуате сопровождается индукцией двух пирокатехин-1,2-диоксиге-наз. Один из ферментов по субстратной специфичности и физико-химическим характеристикам идентичен хлорпирокатехин-1,2-диоксигеназе, индуцируемой при росте R. opacus lcp на 4-хлорфеноле. Вторая из диоксигеназ, выделенная из n-толуатной биомассы, расщепляет хлорированные субстраты с незначительной, по сравнению с пирокатехином, скоростью. Однако этот фермент не идентичен пирокатехин-1,2-диокси-геназе, клонированной в составе оперона катаболизма бензоата у данного штамма, что служит подтверждением гипотезы о множественных формах диоксигеназ как адаптивной реакции микроорганизмов в ответ на стрессовое воздействие окружающей среды.

Dienelactone hydrolase (DLH) was purified to electrophoretic homogeneity from the biomass of the Pseudomonas putida strain 87 grown on 3-chlorobenzoate. The specific activity of the purified enzyme is 50.5 U./mg of protein. The enzyme is a monomer with a molecular mass of 22 kDa, has a pH optimum at 7.6 and is active within a broad temperature range (20-45 degrees C). The enzyme activity is inhibited by pCMB (which requires up to two equivalents of the reagent) but not by EDTA. The Vmax values of DLH for trans-dienelactone and 2-chlorodienelactone are practically identical (247.9 and 247 u./mg, respectively) and exceeded two fold that for cis-dienelactone. However, the Km for 2-chlorodienelactone is two times as high as that for trans-dienelactone (6.9 and 14.2 microM, respectively). A comparison of physico-chemical and kinetic properties of P. putida 87 DLH with those of the enzymes responsible for the decomposition of chlorinated and fluorinated compounds revealed that the enzyme can be assigned to the third group, i.e., the DLH-modified ortho-cleavage path way characteristic of gram-negative bacteria.

Induction of modified ortho-pathway enzymes (catechol 1.2-dioxygenase II, muconate cycloisomerase II, dienelactone hydrolase, and maleylacetate reductase) was found in Pseudomonas putida 87, when 3-chlorobenzoic acid was used as a sole carbon and energy source. Catechol 1.2-dioxygenase II, the key chlorocatechol cleaving enzyme, was purified and characterized. The enzyme molecular mass as determined by gel filtration was 65,000 Da; the minimum molecular mass upon SDS electrophoresis was 33,000 Da. The pH and temperature optima for the enzyme were 7.2-7.8 and 35 degrees C, respectively. The highest stability of catechol 1.2-dioxygenase II upon storage was observed in 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.8 at 4 degrees C. The relative values of Vmax for catechol 1.2-dioxygenase II with 3-chloro-, 4-chloro-, and 3.5-dichlorocatechols were 28%, 50%, and 41% of those for catechol. The enzyme affinity for chlorocatechols was 3-9 times higher than for methylcatechols and 10-20 times higher than for unsubstituted catechol.