Установлено, что Jedi2, активатор механочувствительных каналов Piezo1, влияет на рост эксплантатов сердца эмбриональной ткани. Зависимость изменения индекса площади от концентрации действующего агента описывается уравнением Хилла (Кd ≈ 20 мкМ, коэффициент Хилла — 1,6). Концентрация Jedi2, равная 10 мкМ, была выбрана для химической активации механочувствительных каналов Piezo1 в исследовании с помощью метода атомно-силовой микроскопии, поскольку она не влияла на рост эксплантатов сердца. На основании полученной зависимости стимул–ответ для механического воздействия со стороны зонда атомно-силового микроскопа при исследовании влияния Jedi2 на фибробласты была выбрана сила 3 нН, не приводящая к изменению жесткости клеток в ответ на механическую стимуляцию. В отличие от малых сил (1–5 нН), при больших силах стимуляции (6–7 нН) наблюдалось резкое увеличение модуля Юнга фибробластов. Исследование с помощью атомно-силовой микроскопии показало, что Jedi2 вызывает увеличение жесткости фибробластов — модуль Юнга клеток после воздействия исследуемого вещества (68 ± 7 кПа, n = 33) растет по сравнению с контролем (37 ± 4 кПа, n = 29). Эффект воздействия Jedi2 усиливается со временем: в рамках рассмотренного периода максимальное влияние на механические характеристики фибробластов достигается спустя более двух часов воздействия вещества. Мы предполагаем, что наблюдаемый при воздействии Jedi2 и силе стимуляции 3 нН рост жесткости фибробластов связан с вызванным модуляцией работы каналов Piezo1 сдвигом порога запуска ответа клеток в сторону меньших сил.

В мембране ноцицептивного нейрона нами был обнаружен новый сигнальный каскад опиоидоподобный рецептор → Na,K-ATФаза/ Src → канал NaV1.8. Запуск этого каскада приводит к модуляции его эффекторного звена — активационного воротного устройства канала NaV1.8, причем функцию трансдуктора сигнала выполняет комплекс Na,K-ATФаза/Src. В данном каскаде имеются три мишени, модуляция которых атакующими молекулами может вызывать антиноцицептивный ответ на уровне периферической нервной системы. Первой из них является опиоидоподобный рецептор, активируемый рядом производных гамма-пирона. Второй мишенью служит сигнальный комплекс Na,K-ATФаза/Src, трансдукторная функция которого контролируется уабаином в наномолярном (эндогенном) концентрационном диапазоне. Третья мишень представляет собой непосредственно молекулу медленного натриевого канала NaV1.8, точнее, его активационное воротное устройство, которое модулируется аргининсодержащими короткими пептидами. Исследован возможный механизм лиганд-рецепторного связывания аргининсодержащего трипептида Ac-RRR-NH2 с каналами NaV1.8 мембраны первичного сенсорного нейрона. Методом локальной фиксации потенциала установлено, что трипептид, действующий с наружной стороны нейрональной мембраны, снижает потенциалочувствительность исследуемых каналов. Выдвинуто предположение о том, что ключевую роль в образовании лиганд-рецепторного комплекса играют положительно заряженные гуанидиновые группы боковых цепей двух аргинильных остатков. Согласно результатам конформационного анализа, расстояния между гуанидиновыми группами в молекуле трипептида превышают 10 Å. Полученные данные позволяют заключить, что исследованный трипептид способен к связыванию с каналом NaV1.8 по механизму, предложенному ранее для ряда других аргининсодержащих коротких пептидов. Как следствие, трипептид Ac-RRR-NH2 может претендовать на роль анальгетической лекарственной субстанции.

Известно, что применение опиатов для лечения хронической боли связано с возникновением негативных побочных эффектов. В связи с этим разработка новых безопасных и эффективных неопиоидных анальгетиков — актуальная задача современной науки. Ранее мы обнаружили, что на роль анальгетической лекарственной субстанции может претендовать тетрапептид Ac-RERR-NH2, поскольку он способен снижать возбудимость ноцицептивных нейронов, ответственных за кодирование ноцицептивных сигналов. В настоящей работе приведены данные о действии субнаномолярной концентрации тетрапептида Ac-RERR-NH2 на эмбриональные сенсорные нейроны, полученные методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и органотипической культуры ткани. Применяли квазистатический режим АСМ PeakForce QNM, позволяющий проводить картирование локальных механических свойств клеток. Под действием исследуемого агента сенсорные нейроны демонстрировали тенденцию к уменьшению своей жесткости. Этот результат основывается на анализе данных о величинах кажущегося модуля Юнга сенсорных нейронов и их деформации, определенной с учетом проскальзывания острия зонда по изучаемой поверхности. Использование критерия индекса площади (ИП) показало, что исследуемый тетрапептид обладает выраженными нейрит-стимулирующими свойствами. Полученные данные позволяют предположить, что Ac-RERR-NH2, действующий в очень низких концентрациях, способен запускать пока не идентифицированный внутриклеточный каскад, регулирующий рост нейритов сенсорных нейронов.

Наши результаты свидетельствуют о том, что эндогенный уабаин запускает два разных сигнальных процесса. Первый, быстрый процесс, приводит к модуляции активационного воротного устройства каналов NaV1.8, что снижает их функциональную активность. Второй, медленный процесс, ведет к снижению плотности каналов NaV1.8 в мембране первичного сенсорного нейрона. Мы предполагаем, что в этом случае эндогенный уабаин запускает внутриклеточный каскад, ведущий к снижению экспрессии гена SCN10A, продуцирующего каналы NaV1.8. Можно заключить, что эндогенный уабаин выполняет важнейшую функцию модуляции функциональной активности каналов NaV1.8 при взаимодействии с первичным сенсорным нейроном. В соответствии с нашими данными, эндогенный уабаин может являться эндогенным анальгетиком. Практическим результатом проведенного исследования стало предположение, согласно которому доставка уабаина в качестве лекарственной субстанции к мембране ноцицептивного нейрона в наномолярной концентрации должна приводить к безопасному и эффективному антиноцицептивному действию этого агента на уровне организма.

Исследовано действие колхицина на примере первичной культуры фибробластов сердца новорожденных крысят методами атомно- силовой и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Хорошо известно, что действие колхицина приводит к разрушению микротрубочек клеток. С другой стороны, этот агент используется в качестве лекарственной субстанции в терапии ряда патологий. Однако молекулярные механизмы его действия остаются малоизученными. Данные атомно-силовой микроскопии показали, что колхицин в концентрации 1 мкг/мл приводит к увеличению жесткости фибробластов, причем более выраженная реакция наблюдается у фибробластов со стресс-фибриллами: их средний модуль Юнга был на 60 % выше, чем у контрольных клеток. Применение конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показало, что колхицин вызывает у фибробластов увеличение интенсивности флуоресценции F-актина в среднем на 40 % относительно контрольного уровня. Полученные результаты позволяют заключить, что колхицин, ингибирующий полимеризацию тубулиновых микротрубочек, запускает компенсаторную реакцию клетки, увеличивающую жесткость фибробластов благодаря запуску полимеризации актина. Подход, использованный в настоящей работе, может быть применим для количественного анализа молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов на этапе их доклинических исследований.