The nuclear positioning of mammalian genes often correlates with their functional state. For instance, the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene associates with the nuclear periphery in its inactive state, but occupies interior positions when active. It is not understood how nuclear gene positioning is determined. Here, we investigated trichostatin A (TSA)-induced repositioning of CFTR in order to address molecular mechanisms controlling gene positioning. Treatment with the histone deacetylase (HDAC) inhibitor TSA induced increased histone acetylation and CFTR repositioning towards the interior within 20?min. When CFTR localized in the nuclear interior (either after TSA treatment or when the gene was active) consistent histone H3 hyperacetylation was observed at a CTCF site close to the CFTR promoter. Knockdown experiments revealed that CTCF was essential for perinuclear CFTR positioning and both, CTCF knockdown as well as TSA treatment had similar and CFTR-specific effects on radial positioning. Furthermore, knockdown experiments revealed that also A-type lamins were required for the perinuclear positioning of CFTR. Together, the results showed that CTCF, A-type lamins and an active HDAC were essential for perinuclear positioning of CFTR and these components acted on a CTCF site adjacent to the CFTR promoter. The results are consistent with the idea that CTCF bound close to the CFTR promoter, A-type lamins and an active HDAC form a complex at the nuclear periphery, which becomes disrupted upon inhibition of the HDAC, leading to the observed release of CFTR. J. Cell. Biochem. 113: 26072621, 2012. (c) 2012 Wiley Periodicals, Inc.

The human genes CFTR, ASZ1/GASZ, and CTTNBP2/CORTBP2 map to adjacent loci on chromosome 7q31 and display characteristic patterns of nuclear positioning, which strictly correlate with the state of activity. To address the evolutionary conservation of gene positioning, we investigated transcriptional activity and nuclear positioning of the highly conserved murine orthologs and of additional murine genes mapping to the region of conserved synteny on mouse chromosome 6. The results showed that all murine loci investigated constitutively localized in the nuclear interior irrespective of their functional state. Silenced loci did not display preferential association with the nuclear periphery or with chromocenters, respectively, and no differential positioning with respect to the chromosome 6 territory could be observed. This positional behavior of the murine loci was in striking contrast to the positioning of the human orthologs, and the results show that the transcription-dependent positioning of CFTR and adjacent loci has not been conserved. The findings reveal that the nuclear organization of conserved chromosomal regions can change rapidly during evolution and is not always as highly conserved as other features of chromosome organization. Furthermore, the results suggest that the way how nuclear positioning contributes to the regulation of conserved loci can be different in different vertebrate species.

Correlations between transcriptional activity and replication timing have been observed for the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, as well as for other tissue-specific genes. In addition, the patterns of histone modifications and the nuclear positioning of chromosomal loci appear to be related to their replication timing. It is not understood why and how these different features are functionally linked. To address this problem, we investigated the replication timing of the human CFTR gene and of adjacent genes. Recently, we could show that CFTR and adjacent genes associate independently from each other with different nuclear regions and chromatin fractions, in accordance with their individual transcriptional regulation. Together, the results show that not the transcriptional activity, but rather the nuclear position of CFTR and adjacent genes appears to be a major determinant of their replication timing. Furthermore, the results imply a specific functional order of nuclear changes related to switches in replication timing.

We investigated in different human cell types nuclear positioning and transcriptional regulation of the functionally unrelated genes GASZ, CFTR, and CORTBP2, mapping to adjacent loci on human chromosome 7q31. When inactive, GASZ, CFTR, and CORTBP2 preferentially associated with the nuclear periphery and with perinuclear heterochromatin, whereas in their actively transcribed states the gene loci preferentially associated with euchromatin in the nuclear interior. Adjacent genes associated simultaneously with these distinct chromatin fractions localizing at different nuclear regions, in accordance with their individual transcriptional regulation. Although the nuclear localization of CFTR changed after altering its transcription levels, the transcriptional status of CFTR was not changed by driving this gene into a different nuclear environment. This implied that the transcriptional activity affected the nuclear positioning, and not vice versa. Together, the results show that small chromosomal subregions can display highly flexible nuclear organizations that are regulated at the level of individual genes in a transcription-dependent manner.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die komplexen Zusammenhange zwischen der Kernlokalisation, der transkriptionellen Aktivitat und dem Replikationsverhalten von Zelltyp-spezifisch regulierten Genen in menschlichen Zellen besser zu verstehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kernlokalisation der drei benachbarten, jedoch funktionell unabhangigen Gene GASZ, CFTR und CORTBP2 der humanen CFTR-Region auf Chromosom 7q31 ermittelt und mit dem Expressionsverhalten verglichen. Durch eine 2D-Erosionsanalyse wurde die radiale Positionierung dieser Gene in einer Reihe von Zelllinien und primaren Zelltypen untersucht. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass transkriptionell aktive Gene der CFTR-Region bevorzugt im Zellkerninneren lokalisierten, nicht exprimierte Gene waren dagegen eng mit der Kernperipherie assoziiert. Die benachbarten Genloci wiesen dabei eine voneinander weitgehend unabhangige Lokalisation auf. Unter Verwendung hoch auflosender konfokaler Mikroskopie und dreidimensionaler Bildrekonstruktion konnte diese Korrelation durch eine 3D-Erosionsanalyse im Wesentlichen bestatigt werden. Um zu ermitteln, ob die unterschiedlich positionierten Genloci mit verschiedenen Chromatin-Fraktionen assoziiert sind, wurde eine Kolokalisationsanalyse vorgenommen. Die Daten haben gezeigt, dass inaktive Genloci der CFTR-Region zu einem hohen Anteil mit dem perinuklearen Heterochromatin assoziiert sind, aktive Genloci lokalisierten dagegen bevorzugt in dem hyperazetylierten Euchromatin im Kerninneren. Mehrfarben-FISH Experimente haben gezeigt, dass die eng benachbarten Genloci entsprechend ihrer transkriptionellen Aktivitat simultan mit unterschiedlichen Bereichen im Zellkern assoziiert sein konnen und vermutlich die intergenischen Bereiche zwischen den Genen als flexible Linker dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen im Gegensatz zu fruheren Studien (Sadoni et al., 1999; Volpi et al., 2000; Williams et al., 2002; Mahy et al., 2002) die Vermutung nahe, dass die Positionierung subchromosomaler Regionen auf der Ebene einzelner Gene reguliert wird. Durch die Behandlung der Zellen mit TSA wurde auserdem gezeigt, dass eine erhohte Histonazetylierung zu der Dissoziation eines inaktiven Genlokus von heterochromatischen Bereichen fuhrt, die transkriptionelle Aktivitat davon jedoch nicht beeinflusst wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welcher funktionelle Zusammenhang zwischen dem Replikationsverhalten von GASZ, CFTR und CORTBP2 und der transkriptionellen Aktivitat und Kernlokalisation dieser Gene besteht. Die Bestimmung der Replikationszeitpunkte wurde durch die Untersuchung des Auftretens von FISH-Dubletten wahrend definierter S-Phase Stadien vorgenommen. Da bei dieser Analyse die Moglichkeit besteht, den Anteil an Dubletten durch eine verlangerte Schwester-Chromatid Kohasion zu unterschatzen (Azuara et al., 2003), wurden die ermittelten Zeitpunkte daruber hinaus durch verschiedene Fixierungsmethoden uberpruft. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass transkriptionell aktive Genloci, die in dem hyperazetylierten Euchromatin lokalisierten, zu einem fruheren Zeitpunkt replizierten als nicht exprimierte Genloci, die eng mit dem perinuklearen Heterochromatin assoziiert waren. Durch eine TSA-Behandlung der Zellen wurde nachgewiesen, dass vor allem die Assoziation mit definierten Chromatin-Fraktionen einen Einfluss auf das Replikationsverhalten ausubt, die transkriptionelle Aktivitat und das Replikationsverhalten jedoch nur indirekt miteinander in Zusammenhang stehen. Auf der Basis dieser Daten und fruherer Studien wurde ein Modell erstellt, das die epigenetischen Mechanismen zueinander in Beziehung setzt, die an der Aktivierung Zelltyp-spezifisch regulierter Gene beteiligt sind. Der letzte Teil dieser Arbeit war der Frage gewidmet, ob Komponenten der Zellkernlamina an der perinuklearen Positionierung des reprimierten CFTR-Lokus beteiligt sind. Dazu wurden HeLa S6 Zellen mit Lamin A/C-, Lap2- oder Emerin-siRNAs transfiziert. Nach erfolgreichem Knockdown wurde die Kernlokalisation des CFTR-Lokus durch Erosionsanalysen und Abstandsmessungen zu der Kernperipherie ermittelt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass nach dem Knockdown von Lamin A/C, Lap2 oder Emerin der CFTR-Lokus signifikant weiter im Kerninneren lokalisierte. Dabei schienen Lamin A/C und Lap2 einen starkeren Einfluss auf die Lokalisation von CFTR auszuuben als Emerin. Auch wenn in fruheren Arbeiten bereits gezeigt wurde, dass die Kernlamina fur die Positionierung peripheren Chromatins von Bedeutung ist (Sullivan et al., 1999; Goldman et al., 2004; Zastrow et al., 2004), konnte hier zum ersten Mal ein direkter Einfluss auf die Lokalisation eines einzelnen Genlokus demonstriert werden. In einem erganzenden Ansatz wurde die Kernlokalisation von CFTR in Fibroblasten von HGPS-Patienten untersucht, die auf Grund der Akkumulation von mutiertem Lamin A/C Deformationen der Zellkernlamina und Zellzyklus-Defekte aufwiesen (Eriksson et al., 2003; Goldman et al., 2004). Durch Abstandsmessungen zu der Kernperipherie und durch Kolokalisationsanalysen wurde gezeigt, dass der CFTR-Lokus in HGPS-Zellen einen groseren Abstand zur Kernperipherie aufwies und haufiger im hyperazetylierten Euchromatin lokalisierte als in Fibroblasten eines gesunden Probanden. Insgesamt unterstutzen diese Daten die Vermutung, dass die Misslokalisation von reprimierten Genen in ein verandertes Chromatin-Umfeld an dem Krankheitsbild dieser und anderer Laminopathien beteiligt sein konnte.