Uma técnica de soro-neutralização rápida (SNR), anteriormente adaptada para a detecção de anticorpos contra o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) no leite foi utilizada para a pesquisa de anticorpos anti-BVDV em amostras de recipientes coletivos de leite de propriedades leiteiras no Rio Grande do Sul.Inicialmente, a SNR foi comparada com um teste comercial do tipo ELISA, na pesquisa de anticorpos em amostras de leite de 430 vacas de status sorológico conhecido.Das 430 amostras testadas, as duas técnicas concordaram em 368 (85,6%), sendo 266 positivas (61,9%) e 102 negativas (23,8%).Comparando-se com os resultados do ELISA, a SNR apresentou uma sensibilidade de 90,8%, especificidade de 74,4% e precisão de 85,5%.O grau de concordância (k) foi de 0,65, que significa uma boa associação entre as técnicas.A técnica de SNR foi então utilizada para testar amostras de recipientes coletivos de leite de 11.711 rebanhos do estado do Rio Grande do Sul.Anticorpos contra o BVDV foram detectados no leite de 1.028 rebanhos (8,8%), sendo que 180 propriedades (1,5% do total) apresentaram títulos altos (³80) de anticorpos no leite, sugerindo possuírem infecção ativa.Esses resultados demonstraram que a técnica de SNR é adequada para a detecção de anticorpos anti-BVDV no leite e pode ser utilizada em triagens para a identificação de rebanhos positivos para o BVDV.

Trabalho realizado com suporte financeiro do MCT, CNPq, CAPES e FINEP (Pronex em Virologia Veterinaria, 215/96). Medico Veterinario, Academico do Programa de Pos-graduacao em Medicina Veterinaria, Departamento de Medicina Veterinaria e Preventiva (DMVP), Centro de Ciencias Rurais (CCR), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Medico Veterinario, MSc., Professor substituto no Departamento de Microbiologia e Parasitologia (DMP), Centro de Ciencias da Saude (CCS), UFSM. Medico Veterinario, MSc., PhD., Professor Adjunto do DMVP, CCR e do DMP, UFSM. Bolsista do CNPq (520758/96-0). DMVP/CCR/UFSM, 97105-900, Santa Maria, RS. Fone/fax: 55-220-8034. E mail: flores@ccr.ufsm.br. Autor para correspondencia. Medico Veterinario, MSc., PhD., Professor Titular do DMVP, e do DMP, UFSM. Bolsista do CNPq (520161/97-1). Medico Veterinario, Setor de Patologia Veterinaria, Departamento de Patologia, CCS, UFSM. RESUMO

The identification of bovine viral diarrhea virus (BVDV) positive herds through detection of antibodies in milk may viabilize large scale control/eradication programs. With this objective, the virus neutralization test (VN) was adapted to detect BVDV antibodies in milk. The adaptation consisted of a reduction in the time of incubation followed by detection of viral antigens in the indicator cells by immunofluorescence (IFA) and allowed readings at 24 hours. The rapid virus neutralization test (RVN) was initially tested in 1,335 serum samples, showing a 93.7% sensitivity and 91.1.% agreement with the traditional VN. The RVN was also used to test 423 bovine sera that were toxic for cell culture in the traditional VN test, detecting 316 (74.7%) positive samples. Testing of matched serum and milk samples from BVDV seropositive cows showed that the VNR can detect antibodies in the milk of cows with serum neutralizing titers as low as 10. Anti-BVDV neutralizing activity was detected in milk of 97.4% (191/196) of cows with serum titers (3)320; in 92.9% (79/85) of cows with titers of 160; in 88% (59/67) of cows with serum titers of 80. The frequency of BVDV antibodies in milk was 76.9% (40/52) for cows with serum titers of 40; 61.3% (19/31) for cows with titers of 20 and 33.3% (10/30) for cows with serum titers of 20. These results demonstrate that the RVN test is adequate for detecting BVDV antibodies in milk, mainly in cows having moderate to high serum titers, and therefore may be used for testing bulk milk samples to identify herds with viral activity. The use of this test may viabilize large scale programs for control/eradication of BVDV infection. It allows to assay a large number of samples and identify positive herds through testing milk routinely submitted for somatic cell counts (SCC), reducing costs with, individual sample collection, shipping and testing.

A identificação de rebanhos positivos para o vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) através de detecção de anticorpos no leite pode viabilizar programas de controle em larga escala. Com esse objetivo, a técnica de soro-neutralização (SN) foi adaptada para a pesquisa de anticorpos em amostras de leite. A adaptação consistiu na redução do tempo de incubação do teste, seguida da detecção de antígenos virais por imunofluorescência. A redução do tempo de incubação minimizou os efeitos tóxicos do leite sobre as células de cultivo, além de permitir a obtenção dos resultados em 24 horas. A técnica rápida (SNR) foi inicialmente testada em 1.335 amostras de soro bovino, apresentando sensibilidade de 93,7% e concordância de 91,1% em relação à SN tradicional. A SNR foi também utilizada para testar 423 amostras de soro bovino que apresentaram toxicidade para as células na SN tradicional, detectando 316 (74,7%) amostras positivas. O teste de amostras de soro e leite de 520 vacas em lactação demonstrou que a SNR pode detectar anticorpos no leite de vacas com títulos séricos a partir de 10. Atividade neutralizante anti-BVDV no leite foi detectada em 97,4% (191/196) de vacas com títulos séricos ³ 320; em 92,9% (79/85) de vacas com títulos de 160; em 88% (59/67) de vacas títulos de 80. A freqüência de animais positivos na SNR foi de 76,9% (40/52) para animais com títulos séricos de 40; 61,3% (19/31) com títulos de 20 e de 33,3% (10/30) para vacas com títulos de 10. Esses resultados demonstram que a técnica de SNR é adequada para a pesquisa de anticorpos anti-BVDV no leite, principalmente em animais com títulos moderados e altos de anticorpos. Essa técnica pode ser utilizada para testar amostras coletivas de leite e identificar rebanhos com atividade viral. A utilização dessa técnica pode viabilizar programas regionais de combate à infecção, pois permite testar um grande número de amostras e identificar rebanhos positivos através do leite enviado rotineiramente para contagem de células somáticas (CCS), reduzindo significativamente os custos com a coleta individual, transporte e teste de amostras.

Duas amostras brasileiras do vírus da Diarréia Viral Bovina tipo 2 (BVDV-2) foram inoculadas em bezerros com o objetivo de avaliar a sua virulência e estudar a patogenia da infecção. Previamente à inoculação, os animais foram imunodeprimidos com dexametasona. Quatro bezerros com idades entre 45 e 90 dias (grupo A) foram inoculados com a amostra SV-260 (n=2) ou LV-96 (n=2) e quatro bezerros com 6 a 8 meses de idade foram inoculados com a amostra SV-260 (grupo B). Após a inoculação, os bezerros do grupo A apresentaram anorexia, depressão, hipertermia, sinais de infecção respiratória e diarréia profusa, acompanhada de melena em dois animais. Os sinais respiratórios e digestivos progrediram, e os animais morreram ou foram sacrificados in extremis entre os dias 7 e 12 pós-inoculação. Úlceras e erosões no trato digestivo (língua, n=4; esôfago, n=1; rúmen, n=1 e abomaso, n=3), edema pulmonar (n=4) e na mucosa do abomaso (n=3); equimoses e sufusões na serosa do baço (n=2), no rúmen, no intestino delgado e no ceco (n=1), no coração (n=1) e na mucosa da bexiga (n=1) e intussuscepção intestinal (n=1) foram os achados macroscópicos mais marcantes. Úlceras e erosões, acompanhadas de infiltrado mononuclear na mucosa e submucosa do trato digestivo e depleção linfóide nos linfonodos e placas de Peyer, foram as alterações microscópicas mais freqüentes. O vírus foi detectado em vários tecidos e órgãos. Antígenos virais foram demonstrados por imuno-histoquímica, principalmente em células epiteliais do trato digestivo; em células mononucleares nos espaços perivasculares e peribronquiais; na cápsula e septos de linfonodos; e em linfócitos e células mononucleares das placas de Peyer e baço. Os animais do grupo B apresentaram depressão, hipertermia, sinais moderados de infecção respiratória e digestiva, ulcerações na língua e bochecha, mas recuperaram-se após alguns dias. Esses resultados demonstram que as amostras de BVDV-2 foram capazes de reproduzir a enfermidade aguda quando inoculadas em bezerros e que as conseqüências clínico-patológicas da infecção foram mais severas nos animais mais jovens.

Latent infection with bovine herpesvirus type-5 (BHV-5) was established in rabbits inoculated with two South American isolates (EVI-88 and 613) by intranasal or conjunctival routes. Nine rabbits (613, 8/27; EVI-88, 1/34) developed neurological disease and died during acute infection and other three (613, n=2; EVI-88, n=1) developed a delayed neurological disease, at days 34, 41 and 56 post-inoculation (p.i.). Between days 56 and 62 p.i., the remaining rabbits were submitted to five daily administrations of dexamethasone (Dx) to reactivate the infection. Twenty-five out of 44 rabbits (56.8%) shed virus in nasal or ocular secretions after Dx treatment. Virus shedding was first detected at day two post-Dx and lasted from one to 11 days. The highest frequencies of virus reactivation were observed in rabbits inoculated conjunctivally (10/15 versus 15/29); and among rabbits infected with isolate 613 (12/16 versus 13/28). Virus reactivation upon Dx treatment was accompanied by neurological disease in nine rabbits (20.4%), resulting in six deaths (13.6%). Virus in moderate titers and mild to moderate non-suppurative inflammatory changes in the brain characterized the neurological infection. Three other rabbits showed severe neurological signs followed by death after 31 to 54 days of Dx treatment. Virus, viral nucleic acids and inflammatory changes were detected in their brains. The late-onset neurological disease, after acute infection or Dx treatment, was probably a consequence of spontaneous virus reactivation. These results demonstrate that BHV-5 does establish a latent infection in rabbits and that clinical recrudescence may occur upon reactivation.

The reproduction effects of bovine viral diarrhea virus type-2 (BVDV-2) infection were investigated in ewes inoculated with a non-cytopathic BVDV-2 isolate at three stages of gestation. Virus inoculation was followed by a transient viremia, accompanied by a transient and mild hyperthermia and nasal discharge in a few animals. Some ewes were sacrificed at different time-points after virus inoculation to study the kinetics of fetal infection. Infectivity and viral antigens were detected in placentomes from day 7 to 36 post-inoculation (pi) and in fetal fluids and tissues between days 10 and 28 pi. Cardiac petechial hemorrhages and hemoperitonium accompanied by a severe fibrinous ulcerative placentitis were observed in fetuses examined at days 21, 28 and 36 pi. Inoculation of ewes at days 55–60 of gestation resulted in a prolonged virus replication in placentomes and fetal tissues; ewes that were allowed to proceed with pregnancy had 77% of abortions or fetal and perinatal deaths. Seven stillbirths, unviable and viable lambs born to these ewes were virus-positive at birth. Infectious virus was repeatedly isolated from leukocytes of two lambs up to 2 and 6 months of age, indicating they were persistently infected. Ewes inoculated at days 65–70 of gestation had 66.6% of fetal and perinatal losses. Three viable lambs born to these ewes were healthy, BVDV antibody-positive and virus-negative. A transient viral replication in placentomes and in a few fetal tissues, followed by the rise of fetal neutralizing antibodies and virus clearance was the result of inoculating ewes at days 120–125 of gestation. Lambs born to these ewes were healthy, antibody-positive and virus-negative. These results demonstrate that the biology of BVDV-2 infection in pregnant sheep is essentially similar to that of BVDV-1 in pregnant cattle and sheep. These features make this species an attractive animal model for studying the pathogenesis of congenital BVDV-2 infection.

A resposta sorológica e proteção fetal conferida por três vacinas inativadas contra o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) (vacinas A, B e C) foram avaliadas através de vacinação e posterior desafio de ovelhas prenhes com amostras brasileiras de BVDV-1 e BVDV-2. Níveis baixos a moderados de anticorpos neutralizantes anti-BVDV-1 foram detectados na maioria dos animais (45/47) aos 30 dias após a segunda dose vacinal (títulos médios geométricos [GMT] de 124,7; 74,6 e 26,7 para as vacinas A, B e C, respectivamente). Em contraste, atividade neutralizante anti-BVDV-2 não foi detectada em vários animais (12/47) e foi de magnitude inferior nos três grupos vacinais (GMTs 19,1; 14,1 e 15,1). Os títulos médios de anticorpos reduziram-se significativamente no dia 180, sendo que vários animais já não apresentavam atividade neutralizante detectável frente ao BVDV-1 (grupo B=1/19; C=8/14) e principalmente frente ao BVDV-2 (A=7/14; B=13/19; C=13/14). Nessa data, os títulos médios de anticorpos contra as amostras utilizadas no desafio eram de 91,9; 15,1 e 60,6 (SV-126.8, BVDV-1) e de 10; <10 e 28,3 (SV-260, BVDV-2) nos grupos A, B e C, respectivamente. Nos três grupos vacinais, os níveis de anticorpos neutralizantes contra essas amostras não foram suficientes para prevenir a replicação, disseminação virêmica e transmissão transplacentária dos vírus aos fetos. O vírus foi detectado no sangue e nos fetos de todas as ovelhas vacinadas com as vacinas A (10/10), B (9/9) e C (8/8). Esses resultados demonstram que as vacinas testadas induziram níveis moderados a baixos de anticorpos neutralizantes contra o BVDV-1 e, principalmente contra o BVDV-2 na maioria dos animais; e que esses níveis não foram suficientes para prevenir a infecção fetal frente ao desafio com amostras de BVDV-1 e BVDV-2. Adicionalmente, os resultados confirmam a adequação de ovelhas prenhes para estudos de proteção fetal por vacinas contra o BVDV.

Amostras do vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV), denominadas de BVDV tipo 2 (BVDV-2), foram inicialmente identificadas em surtos de BVD aguda e enfermidade hemorrágica e têm sido isoladas predominantemente na América do Norte. O presente artigo descreve dois casos de enfermidade gastroentérica/respiratória seguidos de isolamento e identificação de amostras de BVDV tipo 2 no sul do Brasil. Os vírus foram isolados de duas novilhas de diferentes rebanhos. Um dos animais apresentou enfermidade aguda, cursando com anorexia, atonia ruminal, diarréia escura ou muco-sanguinolenta, tenesmo e descarga nasal muco-purulenta. O outro animal desenvolveu enfermidade de longa duração (7 meses), caracterizada por crescimento retardado, anorexia, quadros recorrentes de diarréia, dermatite interdigital, hemorragias digestivas e genitais ocasionais, conjuntivite, artrite e pneumonia crônica. Congestão disseminada das mucosas, ulcerações extensivas e profundas na língua, palato e esôfago, áreas necróticas na mucosa do rúmen, áreas de congestão e ulcerações cobertas com fibrina no intestino delgado foram os achados mais proeminentes. Antígenos do BVDV foram demonstrados por imunohistoquí-mica no epitélio da língua, nos pulmões e em linfonodos mesentéricos. Amostras não-citopáticas do BVDV foram isoladas em cultivo celular a partir de leucócitos e do baço dos animais afetados e identificadas por imunofluorescência. Caracterização antigênica e análise filogenética desses isolados, e de outras duas amostras de BVDV isoladas de fetos coletados em matadouros, revelou tratar-se de BVDV tipo 2. A presença do BVDV tipo 2 na população bovina do Brasil possui um significado epidemiológico importante e pode ter conseqüências para o diagnóstico, estratégias de imunização e produção de vacinas.