Hintergrund/Einleitung: TGF-β1 ist pleiotropes Zytokin mit profibrotischen, immunmodulatorischen sowie antiproliferativen Funktionen. Erhöhte TGF-β1-Plasmaspiegel waren wiederholt bei Patienten im Rahmen von Akutphase und Sepsis gemessen worden.

Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) plays a central role in tumor invasion and development of metastases. Expression of MMP-9 had been shown in human hepatocellular carcinomas (HCCs). However, it remained unclear whether MMP-9 could influence development of HCC. In order to address this issue, we generated transgenic mice overexpressing MMP-9 in the liver. In order to avoid embryonic lethality a Cre-lox system was utilized for conditional overexpression of MMP-9 under control of an albumin enhancer and promoter. Induction of MMP-9 overexpression in transgenic mice was achieved by i.v. injection of an adenovirus coding for the Cre recombinase. Initiation of liver carcinogenesis was achieved by injection of diethylnitrosamine (DEN) followed by Phenobarbital administration in drinking water. Transgene expression was induced at the age of 6?wk. Four and six months later mice were sacrificed and examined macroscopically and microscopically in a blinded manner. Alb/Cre/MMP-9-transgenic mice showed liver specific overexpression of MMP-9-mRNA and protein after induction. At the age of 6 months livers of transgenic mice showed 15.7 +/- 11.6 tumors (mean +/- SD) in contrast to wildtype mice with only 7.9 +/- 11.0 tumors (P?<?0.03). By histopathology examination of the livers HCCs were identified in 42% of the transgenic mouse livers but only 8% in wildtype animals. In summary, we established a novel MMP-9 transgenic mouse model, and report on a significantly increased susceptibility of MMP-9 transgenic mice to chemically induced carcinogenesis. This is the first in vivo proof that MMP-9 overexpression promotes liver tumor development. (C) 2011 Wiley Periodicals, Inc.

Members of the transforming growth factor beta (TGF-beta) superfamily of signaling molecules are involved in the regulation of many developmental processes that involve the interaction between mesenchymal and epithelial tissues. Smad7 is a potent inhibitor of many members of the TGF-beta family, notably TGF-beta and activin. In this study, we show that embryonic overexpression of Smad7 in stratified epithelia using a keratin 5 promoter, results in severe morphogenetic defects in skin and teeth and leads to embryonic and perinatal lethality. To further analyze the functions of Smad7 in epithelial tissues of adult mice, we used an expression system that allowed a controlled overexpression of Smad7 in terms of both space and time. Skin defects in adult mice overexpressing Smad7 were characterized by hyper-proliferation and missing expression of early markers of keratinocyte differentiation. Upon Smad7-mediated blockade of TGF-beta superfamily signaling, ameloblasts failed to produce an enamel layer in incisor teeth. In addition, TGF-beta blockade in adult mice altered the pattern of thymic T cell differentiation and the number of thymic T cells was significantly reduced. This study shows that TGF-beta superfamily signaling is essential for development of hair, tooth and T-cells as well as differentiation and proliferation control in adult tissues.

Hintergrund: Die Matrix-Metalloproteinase–9 (MMP–9) spielt eine zentrale Rolle im Rahmen der Metastasierung. In hepatozellulären Karzinomen konnte eine Überexpression von MMP–9 gezeigt werden. Ziel der vorliegenden Untersuchung war, zu klären, ob eine leberspezifische Überexpression von MMP–9 die Empfindlichkeit der Leber gegenüber chemisch induzierter Karzinogenese verändert.

Background/Aims: In hepatic fibrogenesis, stellate cells are activated leading to production and deposition of extracellular matrix. To clarify the role of PDGF-B in liver fibrogenesis, we overexpressed PDGF-B in the liver of transgenic mice.Methods: Transgenic mice for the conditional overexpression of PDGF-B in the liver under control of an albumin promoter were generated utilising the Cre/IoxP system. Constitutive PDGF-B expression was achieved after breeding with mice expressing Cre-recombinase under actin promoter control. Tamoxifen inducible expression was achieved after breeding with mice expressing Cre under transthyretin receptor promoter control. Levels of fibrosis were assessed and the expression of regulators of matrix remodelling was measured.Results: PDGF-B expression caused hepatic stellate cell and myofibroblast activation marked by alpha-smooth muscle actin and PDGFR-beta expression. Liver fibrosis was verified macroscopically, histologically and by collagen I mRNA quantification in 4-6 week-old animals. MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 were upregulated whereas TGF-beta expression was unchanged.Conclusions: We identified PDGF-B as a proliferative and profibrogenic stimulus and potential inducer of stellate cell transdifferentiation in vivo. PDGF-B overexpression causes liver fibrosis without significantly upregulating TGF-beta 1, suggesting a TGF-beta-independent mechanism. The established model provides a tool for testing anti-PDGF-B therapeutic strategies in liver fibrosis in vivo. (c) 2006 European Association for the Study of the Liver. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.

Einleitung: Umbau extrazellulärer Matrix stellt einen entscheidenden Schritt im Rahmen der Leberfibrogenese und der -karzinogenese dar. Gegenstand zahlreicher Untersuchungen ist die Rolle der Matrix-Metalloproteinase–9 (MMP–9) in diesem Kontext. Ein geeignetes Tiermodell, welches erlaubt, den Einfluss von MMP–9 in vivo näher zu untersuchen, stand bislang noch nicht zur Verfügung. Es wurde daher ein konditionales Mausmodell mit leberspezifischer Überexpression von MMP–9 entwickelt.

Platelet derived growth factor B (PDGF-B) ist das stärkste Mitogen für mesenchymale Zellen. Transgene Mäuse mit Leber-spezifischer Überexpression von PDGF-B unter Kontrolle von Albuminpromoter entwickeln fibrotische Veränderungen in der Leber. Eine konstitutive Überexpression von PDGF-B in act-cre/PDGF-B doppel-transgenen Tieren ab frühen embryonalen Entwicklungsstadien und eine Tamoxifen-induzierte PDGF-B Überexpression in adulten ttr-cre/PDGF-B transgenen Mäusen resultierte in Proliferation/Aktivierung von hepatischen Sternzellen (HSC) und einem fibrotischem Phänotyp der Leber mit unterschiedlicher Ausprägung. Einige Daten aus der Literatur weisen auch auf einen proapoptotischen Effekt von PDGF-B hin. Histologischer Vergleich der HE-Schnitte von PDGF-B überexprimierenden Tieren und Wildtypkontrollen zeigte perizentrale Areale von Zellapoptose/Nekrose. Es wurde auch eine signifikante (p<0.05) Erhöhung von GLDH im Serum als Marker für perizentrale Hepatozyten-Nekrose in act-cre/PDGF-B Mäusen beobachtet im Vergleich zu Kontrolltieren. Ein TUNEL-Apoptose-Assay zeigte einen signifikanten Anstieg der Zahl der apoptotischen Leberzellen in PDGF-B-überexprimierenden Mäusen aber nicht in Wildtypkontrollen. Eine Erhöhung der bcl-xs mRNA- eines der Induktoren der Apoptose wurde ebenfalls in act-cre/PDGF-B Mäusen beobachtet. Eine proapoptotische Aktivität von PDGF-B in vaskulären Glattmuskelzellen wurde bereits beschrieben in vitro. In unserem Mausmodell PDGF-B induzierte Zelltod in vivo. Bcl-xs mRNA Erhöhung gibt ein Hinweis auf den Mechanismus der Apoptose.

04C. Molecular and cellular biology (e) HSCs and fibrosis S131GPO10 on cell functions and its potential to release and activate collagenbound proMMP-2.Methods: Sequential slices of cirrhotic liver tissues were incubated with Cy2-1abelled proMMP-2• pmoles GPO10.Slides were washed and collagen-bound fluorescent proMMP-2 was detected microscopically at 520nm.For control, collagens were stained by SiriusRed without proMMP-2.The ability of GPO10 to activate proMMP-2 was tested by an increased invasion capability after matrix degradation.Cells of the fibrosarcoma cell line HT1080 were cultured in a gradient from 0.25% to 10% fetal calf serum, and in the presence of GPO10 or the gelatinase inhibitor Ilomastat.Effects on cellular proliferation were studied by [3H]-thymidine incorporation using the half-activated hepatic stellate cell line CFSC with MMP-2, GPO10 and GPO10-activated proMMP-2, alone or with Ilomastat.Results: (1) The extent of collagen-rich SiriusRed-stained fibrotic septa corresponded to the areas stained by Cy2-1abelled proMMP-2 in sequential tissue slides.Preincubation of the slides with GPO10 effectively prevented binding of fluorescent proMMP-2.Pre-bound enzyme was released by addition of a 10fold molar excess of GPO10.(2) In vitro, invasiveness of HT1080 cells to Matrigel was enhanced by 20% in the presence GPO10activated proMMP-2.In contrast, it was inhibited to 50% by Ilomastat.(3) Under serum-reduced conditions, the proliferation of CFSC was stimulated by MMP-2.Addition of Ilomastat reduced the [3H]-thymidine incorporation almost to background levels.The increase in CFSC proliferation mediated by GPO10 alone was about 75% of the MMP-2 control.Conclusions: Small peptides like GPO10 that mimic collagenous structural elements effectively modulate the activity of collagen-stored proMMP-2 and enable rapid activation of cells.Thus, GPO10 and related peptides/peptide analogues are promising tools for a specific degradation of extracellular matrix in liver fibrosis.

Einleitung: Die Matrix-Metalloproteinase–9 (MMP–9) spielt unter anderem eine zentrale Rolle für den Umbau extrazellulärer Matrix. Dies legt eine entscheidende Bedeutung von MMP–9 im Kontext von Leberfibrogenese und -karzinogenese nahe. Allerdings bleibt insbesondere die Frage, ob MMP–9 im Rahmen der Leberfibrogenese profibrogen oder fibrolytisch wirkt unklar. Ein geeignetes in vivo-Modell stand bislang nicht zur Verfügung.

Hintergrund: Interleukin–12 (IL–12) ist ein potenter Auslöser entzündlicher Immunantworten. Normalerweise ist die IL–12 Expression in der Leber fehlend oder schwach, bei fulminanter Hepatitis findet sich jedoch eine hohe IL–12 Expression. Um die in vivo-Rolle des IL–12 in einem Modell akuter Hepatitis zu untersuchen, haben wir IL–12 transgene Mäuse generiert.

Transforming growth factor-beta (TGF-beta) is an important suppressor of inflammation. However, TGF-beta has also been found to promote secretion of inflammatory cytokines, and transgenic mice, which constitutively express TGF-beta in liver, have been found to be more susceptible to endotoxemia. To approach this apparent paradox, we investigated the role of hepatic TGF-beta1 in endotoxemia by utilising inducible TGF-beta1-transgenic mice that express TGF-beta1 under control of the C-reactive protein promoter. In contrast to non-transgenic littermates, administration of lipopolysaccharide (LPS) induced strongly increased expression of TGF-beta and acute phase proteins in the TGF-beta1-transgenic mice. Hepatic TGF-beta1-expression in the transgenic mice started an inflammatory cytokine cascade, marked by increased and prolonged secretion of TNF-alpha and IL-6 by hepatocytes. The inflammatory response of the TGF-beta1-transgenic mice to LPS was associated with high rates of mortality due to endotoxemic shock, marked by systemic hypotension and hypothermia. Endotoxemic shock was primarily mediated by TNF-alpha and IL-6, since inhibitory antibody to TNF-alpha or, more effectively, to IL-6 could reduce mortality in these mice. In conclusion, while TGF-beta-signalling to immune cells may suppress inflammatory effector function, TGF-beta-signalling to liver cells seems to promote LPS-stimulated secretion of inflammatory cytokines and to predispose for lethal endotoxemic shock.

Matrix Metalloproteinasen (MMP) spielen bei der Embryonalentwicklung vor allem bei der Implantation eine wichtige Rolle. Auch am Matrixumbau während der Fibrogenese sowie am invasiven und metastatischen Tumorwachstum sind sie beteiligt. Um den Einfluss einer hepatischen Überexpression von MMP–2 auf die Leberfibrogenese und –Karzinogenese zu studieren entwickelten wir ein Cre/LoxP induzierbares Vektorsystem (IAL/MMP–2) zur konditionalen Überexpression von MMP–2 in der Leber transgener Mäuse. Zwei unabhängige MMP–2 transgene Linien wurden untersucht. Nach Kreuzung MMP–2 transgener Mäuse mit act-Cre Deletermäusen, welches ab dem Tag 6 der Embryonalentwicklung zu einer nachweisbaren MMP–2 Überexpression führte (RT-PCR), starben alle doppelt transgenen Embryonen am Tag 7 der Embryonalentwicklung. Um die embryonale Letalität zu umgehen induzierten wir in adulten Tieren die Rekombination der LoxP-Sites mit Hilfe eines für Cre kodierenden adenoviralen Vektors, welches zu einer Überexpression von MMP–2 in der Leber führte. Vier Wochen nach der Induktion der MMP–2 Überexpression zeigte die Histologie MMP–2 transgener Mäuse eine starke pleiomorphe Störung der Leberarchitektur wobei die Hepatozyten sehr unterschiedlich in Größe und Form waren. Es fanden sich vermehrt doppelkernige Hepatozyten, deren Kerne sehr unterschiedlich in ihrer Größe waren. Außerdem traten, von inflammatorischen Zellen umgebene, fokale Nekrosen auf. Zusammenfassend ist eine Überexpression von MMP–2 embryonal Letal und wird sie erst in adulten Mäusen induziert führt sie zu einer starken Schädigung der Leberarchitektur mit fokalen Nekrosen. Somit ist MMP–2 alleine in der Lage in adulten Lebern Nekrosen zu induzieren. Der Einfluss von MMP–2 auf Apoptose, Proliferation und Leberarchitektur wird Gegenstand weiterführender Studien sein.

In verschiedenen Studien waren bei sepischen Patienten erhöhte Plasmaspiegel von Transforming Growth Factor β1 (TGF-β1) gemessen worden. In der Vergangenheit konnten wir eine dramatisch erhöhte Mortalität von transgenen Mäusen mit einer leberspezifischen TGF-β1-Überexpression im Rahmen verschiedener Leberschädigungsmodelle (partielle Hepatektomie, CCl4 und LPS) zeigen. Die erhöhte Mortalität wurde von massiv erhöhten IL–6-Spiegeln im Plasma von TGF-β1-transgenen Mäusen begleitet. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob eine Anti-IL–6-Strategie die erhöhte Mortalität transgener Mäuse vermindern kann. Hierfür wurde das Modell der intraperitonealen LPS-Injektion ausgewählt.

Einleitung: Platelet derived growth factor (PDGF) ist ein zentrales Zytokin im Rahmen von Wundheilungsprozessen. Bislang sind vier verschiedene Isoformen beschrieben (PDGF A-D), wobei PDGF-B als stärkstes Mitogen für mesenchymale Zellen gilt. Ziel der Untersuchung war es, anhand transgener Mäuse mit leberspezifischer überexpression von PDGF-B, seine Rolle in vivo zu untersuchen.

Einleitung: Transforming growth factor β1 (TGF-β) besitzt pleiotrope Eigenschaften im Organismus. Im Plasma von Sepsispatienten konnten erhöhte TGF-β-Spiegel gemessen werden. Ziel der vorliegenden Studien war es, zu untersuchen, wie sich eine leberspezifische TGF-β-Überexpression im Rahmen einer Leberschädigung auswirkt.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine der häufigsten Tumorerkrankungen. Fast alle HCCs treten im Kontext einer Leberzirrhose auf. Für lokales und metastatisches Tumorwachstum ist eine Remodellierung extrazellulärer Matrix (ECM) durch Matrixmetalloproteinasen (MMP) essentiell. Man vermutet, dass MMPs eine zentrale Rolle in der Leberfibrogenese einnehmen. So konnten in zirrhotischen Lebern als auch in HCCs erhöhte Spiegel von MMP-2 und MMP-14 gefunden werden.