Given the great biological importance and high diversity of temperate Staphylococcus aureus bacteriophages, a method is needed for the description of their genomic structure. Here we have updated a multiplex PCR strategy for the complex characterization of S. aureus phages of the family Siphoviridae. Based on the comparative genomic analysis of the available phage sequences, a multilocus PCR strategy for typing the major modules of the phage genome was designed. The genomic modules were classified on the basis of the genes for integrase (10 types), anti-repressor (five types), replication proteins polA, dnaC and dnaD (four types), dUTPase (four types), portal protein (eight types), tail appendices (four types) and endolysin (four types) corresponding to the integrase locus, lysogeny control region, and modules for DNA replication, transcription regulation, packaging, tail appendices and lysis respectively. The nine PCR assays designed for the above sequences were shown to be capable to identify the bacteriophage gene pool present both in the phage and bacterial genomes and their extensive mosaic structure. The established multiplex PCR-based multilocus diagnostic scheme is convenient for rapid and reliable phage and prophage classification and for the study of bacteriophage evolution.

Given the great biological and clinical importance of staphylococcal siphoviruses, the staphylococcal bacteriophage collection was established in 2010 by extending the CCM in the Czech Republic. About forty S. aureus siphophage strains coding for ETA or PVL, phages exhibiting transducing properties or applicable for phage typing were characterized in detail up to now and being maintained. A database for computer storage and handling bacteriophage strain data has been developed on the basis of standardized format for plasmids, viruses and transposons (PVT) published previously (Vincente et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 8:519-526) and extended by fields concerning phage genome module properties. The database is designed to allow storage a variety of data and cross-reference with that concerning propagating, selection, host and lysogenic bacterial strains records in MINE (Microbial Information Network Europe). The database will be available to the public on the Web from January 2011.

Byla provedena fenotypova a genotypova charakterizace kmenů S. aureus produkujicich Pantonův-Valentinův leukocidin (PVL), ktere byly původci osmi připadů abscedujici nekrotizujici pneumonie. Pět z těchto připadů bylo smrtelných.

Description of phenotypic and genotypic characteristics of Panton-Valentine leukocidin (PVL) positive strains isolated from eight abscessing pneumonias in the Czech Republic between December 2007 and May 2009. Short case reports are described too. Five of them were lethal.

Magnetic microspheres P(HEMA-co-EDMA) were used for PCR-ready phage DNA isolation from lysogenic strains of Staphylococcus aureus, including two new clinical isolates. The conditions of phage particle lysis were optimized. The quality of eluted phage DNA was evaluated by PCR. It was demonstrated that PCR-ready phage DNA can be isolated from small volumes of phage lysates (150 microl) by magnetic microspheres. The reported method is very expeditious without using toxic compounds such as phenol or chloroform. It can be used for phage identification and phage gene detection.

Druh Staphylococcus aureus je původce zavažných komunitnich a nosokomialnich onemocněni. Patogenita stafylokokových kmenů uzce souvisi s přitomnosti faktorů virulence. V poslednich 10 letech je věnovana pozornost kmenům s produkci Pantonova - Valentinova leukocidinu (PVL), což je dvousložkový protein kodovaný geny lukS-PV a lukF-PV lokalizovanými na profagovem genomu. Tyto velice virulentni kmeny komunitniho původu vyvolavaji hlavně infekce kůže a podkoži, casto s těžkým průběhem, dale osteomyelitidy a endokarditidy. Nejzavažnějsim onemocněnim vyvolaným těmito kmeny jsou nekrotizujici, abscedujici pneumonie, ktere jsou casto bakterialni komplikaci virove respiracni infekce. Tyto pneumonie jsou charakteristicke výskytem u mladých jedinců, rychlým průběhem infekce, spatnou nebo žadnou reakci na terapii a vysokou umrtnosti. V praci byl charakterizovan soubor 8 PVL-pozitivnich kmenů S. aureus izolovaných od roku 2007 do května 2009, ktere byly původci abscedujicich pneumonii. Pět pacientů tomuto onemocněni podlehlo, 3 přežili. Jednalo se o 4 muže a 4 ženy ve věku 10 měsiců až 65 let. U přeživsich pacientů byl k terapii použit linezolid. Pro genotypovou charakterizaci kmenů byly použity metody PFGE, sekvencni typizace (MLST a spa) a PCR-typizace pro stanoveni obsahu toxinů. U meticilin rezistentnich kmenů byl stanoven typ SCCmec kazety. Dale byl stanoven obsah profagů a plazmidů. Tři MRSA kmeny patřily do epidemickeho klonu USA300 z klonalniho komplexu CC8, z toho byly dva kmeny genotypově uplně shodne a připady měly epidemiologickou souvislost. Ctvrtý MRSA obsahoval složený typ SCCmec kazety, který byl podroben detailnějsi analýze. Meticilin citlive kmeny patřily ke sporadicky se vyskytujicim spa-typům a byly zařazeny do různých klonalnich komplexů (CC30, CC80 a CC121). Jedna se pravděpodobně o nově vznikle klony, u kterých se horizontalnim přenosem genů akumulovalo vice faktorů virulence.

Staphylococcus aureus je zavažný lidský patogen, způsobujici řadu onemocněni od zanětlivých procesů kůže a měkkých tkani, přes toxikozy způsobujici otravy z jidla až po život ohrožujici bakteremie. Vedle nozokomialnich kmenů dochazi v posledni době k prudkemu narůstu zachytu komunitnich kmenů. Jednim z typických znaků komunitnich kmenů způsobujicich zavažna onemocněni je produkce Pantonova-Valentinova leukocidinu (PVL), který je považovan za silný stimulant zanětu a nekrozy tkani, jehož nejzavažnějsim důsledkem je nekrotizujici pneumonie. Lecbu komplikuje multirezistence kmenů k antibiotikům. Geny zodpovědne za rezistenci k antimikrobialnim latkam jsou zpravidla neseny na mobilnich genetických elementech (MGE), zejmena plazmidech, chromozomových kazetach a transpozonech, ktere jsou zaroveň zodpovědne za přenos těchto genů mezi stafylokokovými kmeny. MGE tak umožňuji svým hostitelským kmenům dynamicky se přizpůsobovat prostředi. Hlavnim cilem prace bylo objasnit, jakou ulohu maji plazmidy v rezistenci a virulenci PVL-pozitivnich kmenů S. aureus.

The aim of this contribution was focused on the isolation of PCR-ready DNA from Trichophyton lyophilised cells (spores) and from the small volumes of Staphylococcus aureus phage lysates. Extraction of PCR-ready DNA from microscopic fungi is crucial in dermatophytes due to the presence of fungal polysaccharides and the chitinous cell wall. PCR-ready DNA isolated from crude cell lysates was repurified by magnetic carriers containing carboxyl groups on the surface. The adsorbed DNA was eluted by TE buffer. The DNA in the eluate was used as a matrix in PCR amplification. ITS4 and ITS5 primers were used for the amplification of Trichophyton DNA. The PCR-ready DNA can be isolated from lyophilisates without cultivation of cells (spores) and the influence of PCR inhibitors which are present in lyophilisation media was eliminated. The high-titre (109 particles per ml) and low-titre (103 particles per ml) phage lysates of Staphylococcus aureus bacteriophages f77 and f53 were used for sample preparation and DNA isolation. The phage lysates were treated by proteinase K. The DNA extracted using magnetic microspheres was RNA-free and multiplex PCR was used for phage DNA identification.

Znacna cast genů zodpovědných za virulenci a rezistenci druhu Staphylococcus aureus je lokalizovana na mobilnich genetických elementech (MGE), ktere představuji významnou složku genomu větsiny kmenů. MGE tvoři obvykle 10-20 % genomu S. aureus a patři k nim bakteriofagy, ostrovy patogenity, plazmidy, chromozomove kazety a transpozony. U různých kmenů je přitomnost jednotlivých typů elementů velmi variabilni a je zdrojem genetickeho polymorfismu využitelneho k jejich identifikaci. K bližsi charakterizaci a detailni typizaci kmenů jsou MGE využivany předevsim v lokalnich epidemiologických studiich, kde pro vysokou miru geneticke přibuznosti kmenů nejsou standardně použivane metody (PFGE, spa-typizace) dostatecně citlive. Detekce MGE je tež důležitou doplňkovou metodou diagnostiky kmenů S. aureus, ktera umožňuje podrobnou charakteristiku izolatů z hlediska sledovani siřeni determinant virulence a rezistence k antibiotikům. V soucasnosti jsou nejvice využivany metodiky založene na vyhledavani genů nesených na MGE pomoci PCR, ktere jsou financně dostupne, dostatecně citlive, casově a instrumentalně nenarocne. Pozornost je věnovana předevsim detekci specifických genů a sekvenci jednotlivých druhů bakteriofagů, plazmidů a u meticilin rezistentnich kmenů (MRSA) take na charakterizaci typu chromozomove kazety SCCmec.

S. aureus je oportunni patogen, tvoři soucast lidske mikroflory a vyskytuje se u 30 - 50 % zdrave populace na nosni sliznici a kůži. V nemocnicnich zařizenich je hlavni přicinou nozokomialnich onemocněni, avsak i v komunitni populaci může způsobit různe formy infekci. Stafylokokova onemocněni se lisi ve sve zavažnosti od mirných kožnich infekci až po život ohrožujici nemoci. Jedna se napřiklad o kožni infekce, abscesy, pneumonie, mastitidy, meningitidy, endokarditidy, ale take o onemocněni způsobene toxiny, odtud nazev toxikozy. Schopnost S. aureus způsobovat tak rozlicna onemocněni je dana jeho schopnosti tvorby velkeho množstvi extracelularnich toxinů (např. toxin syndromu toxickeho soku, stafylokokove enterotoxiny, exfoliativni toxiny, Pantonův-Valentinův leukocidin apod.) a virulentnich faktorů nachazejicich se na buněcnem povrchu stafylokoka. Geny kodujici tyto faktory virulence a geny pro rezistenci k antibiotikům jsou nejcastěji umistěny na mobilnich genetických elementech (MGE) jako jsou bakteriofagy, plazmidy, transpozony nebo ostrovy patogenity. Molekularni diagnosticke metody lze využit ke studiu populacni struktury těchto virulentnich kmenů a sledovat jejich siřeni v ramci nemocnicni pece i v běžne populaci. Molekularni metody jsou založeny na sledovani polymorfizmů v ramci stafylokokoveho chromozomu (PFGE, MLST, spa typizace), dale variability obsahu MGE (PCR, RAPD) a jejich sekvencni analýzy. Vedle stanoveni produkce toxinů kmeny S. aureus je v mikrobiologických laboratořich siroce využivana přima detekce genů kodujicich tyto faktory virulence pomoci PCR.

Druh Staphylococcus aureus patři mezi hlavni původce zavažnýchkomunitnich a nosokomialnich onemocněni. Patogenni kmeny sevzajemně lisi produkci faktorů virulence, jejichž geny jsouneseny na mobilnich genetických elementech. K nejvýznamnějsimmobilnim genetickým elementům patři fagy integrovane vbakterialnim genomu ve stavu profaga. Jejich charakterizace jenezbytnou soucasti studia faktorů virulence a jejich přenosu vbakterialnich populacich. K tomuto ucelu je nezbytne ziskatfagy v dostatecne koncentraci a cistotě. Cilem teto prace jevytvořeni metodiky pro izolaci a detailni charakterizacistafylokokových profagů.