Natural products represent a rich source of antibiotics that address versatile cellular targets. The deconvolution of their targets via chemical proteomics is often challenged by the introduction of large photocrosslinkers. Here we applied elegaphenone, a largely uncharacterized natural product antibiotic bearing a native benzophenone core scaffold, for affinity-based protein profiling (AfBPP) in Gram-positive and Gram-negative bacteria. This study utilizes the alkynylated natural product scaffold as a probe to uncover intriguing biological interactions with the transcriptional regulator AlgP. Furthermore, proteome profiling of a Pseudomonas aeruginosa AlgP transposon mutant provided unique insights into the mode of action. Elegaphenone enhanced the elimination of intracellular P.aeruginosa in macrophages exposed to sub-inhibitory concentrations of the fluoroquinolone antibiotic norfloxacin.

Naturstoffe sind eine ergiebige Quelle für Antibiotika, die vielfältige zelluläre Zielstrukturen adressieren. Die Erforschung ihrer Zielproteine mittels chemischer Proteomik wird häufig durch das Einbringen sterisch anspruchsvoller photoreaktiver Gruppen erschwert. Hier verwenden wir Elegaphenon, ein weitestgehend uncharakterisiertes Naturstoffantibiotikum mit einem nativen Benzophenongrundgerüst für affinitätsbasiertes Protein Profiling (AfBPP) in grampositiven und gramnegativen Bakterien. In dieser Studie wurde das Naturstoffgerüst alkinyliert und als Sonde verwendet wodurch es gelungen ist, den Transkriptionsregulator AlgP als biologisches Angriffsziel aufzudecken. Weiterhin wurden durch Proteomprofiling einer Pseudomoas aeruginosa AlgP‐Transposonmutanten einzigartige Erkenntnisse über den Wirkmechanismus gewonnen. Elegaphenon verstärkt die Eliminierung intrazellulärer P. aeruginosa in Makrophagen bei Behandlung mit dem Fluorchinolonantibiotikum Norfloxacin in subinhibitorischen Konzentrationen.

The proteasome, a validated cellular target for cancer, is central for maintaining cellular homeostasis, while fatty acid synthase (FAS), a novel target for numerous cancers, is responsible for palmitic acid biosynthesis. Perturbation of either enzymatic machine results in decreased proliferation and ultimately cellular apoptosis. Based on structural similarities, we hypothesized that hybrid molecules of belactosin C, a known proteasome inhibitor, and orlistat, a known inhibitor of the thioesterase domain of FAS, could inhibit both enzymes. Herein, we describe proof-of-principle studies leading to the design, synthesis and enzymatic activity of several novel, β-lactone-based, dual inhibitors of these two enzymes. Validation of dual enzyme targeting through activity-based proteome profiling with an alkyne probe modeled after the most potent inhibitor, and preliminary serum stability studies of selected derivatives are also described. These results provide proof of concept for dual targeting of the proteasome and fatty acid synthase-thioesterase (FAS-TE) enabling a new approach for the development of drug-candidates with potential to overcome resistance.

β-Lactones have recently been introduced as the first selective ClpP inhibitors that attenuate virulence of both sensitive Staphylococcus aureus and multiresistant strains (MRSA). Although previous knockout studies showed that ClpP is essential for S. aureus alpha-toxin production, a link between β-lactone inhibition and molecular virulence mechanisms has been lacking so far. We here perform a chemical-proteomic approach to elucidate antivirulence pathways. First, we demonstrate by gel-free activity-based protein profiling that ClpP is the predominant target of β-lactones. Only a few off-targets were discovered, which, unlike ClpP, were not involved in the reduction of alpha-toxin expression. Second, in-depth mechanistic insight was provided by a full proteomic comparison between lactone treated and untreated S. aureus cells. Quantitative mass-spectrometric analysis revealed increased repressor of toxin (Rot) levels and a corresponding down-regulation of α-toxin, providing the first direct connection between the lactone-dependent phenotype and a corresponding cellular mechanism. By building up a quantitative virulence regulation network, we visualize the impact of ClpP inhibition in a systems biology context. Interestingly, a lack of in vitro Rot degradation by either ClpXP or ClpCP calls either for a proteolysis mechanism with yet unknown adaptor proteins or for an indirect mode of action that may involve ClpX-mediated RNA signaling and feedback circuits.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) causes severe infections with only few effective antibiotic therapies currently available. To approach this challenge, chemical entities with a novel and resistance-free mode of action are desperately needed. Here, we introduce a new hydroxyamide compound that effectively reduces the expression of devastating toxins in various S. aureus and MRSA strains. The molecular mechanism was investigated by transcriptome analysis as well as by affinity-based protein profiling. Down-regulation of several pathogenesis associated genes suggested the inhibition of a central virulence-related pathway. Mass spectrometry-based chemical proteomics revealed putative molecular targets. Systemic treatment with the hydroxyamide showed significant reduction of abscess sizes in a MRSA mouse skin infection model. The absence of resistance development in vitro further underlines the finding that targeting virulence could lead to prolonged therapeutic options in comparison to antibiotics that directly address bacterial survival.

Understanding the molecular mechanisms of bacterial pathogenesis and virulence is of great importance from both an academic and clinical perspective, especially in view of an alarming increase in bacterial resistance to existing antibiotics and antibacterial agents. Use of small molecules to dissect the basis of these dynamic processes is a very attractive approach due to their ability for rapid spatiotemporal control of specific biochemical functions. Activity-based protein profiling (ABPP), employing small molecule probes to interrogate enzyme activities in complex proteomes, has emerged as a powerful tool to study bacterial pathogenesis. In this chapter, we present a set of ABPP methods to identify and analyze enzymes essential for growth, metabolism and virulence of different pathogens including S. aureus and L. monocytogenes using natural product-inspired activity-based probes.

The characterization of the target proteins of drug molecules has become an important goal in understanding its mode of action and origin of side effects due to off-target binding. This is especially important for covalently binding drugs usually containing electrophilic moieties, which potentially can react with nucleophilic residues found in many proteins. This review gives a comprehensive overview of the use of activity-based protein profiling (ABPP) as an efficient tool for the target identification of covalently binding drugs.

Activity-based protein profiling (ABPP) has become a powerful chemoproteomic technology allowing for the dissection of complex ligand-protein interactions in their native cellular environment. One of the biggest challenges for ABPP is the extension of the proteome coverage. In this chapter a new ABPP strategy dedicated to monoamine oxidases (MAO) is presented. These enzymes are representative examples of flavin-dependent oxidases, playing a crucial role in the regulation of nervous system signaling.

Discovering and validating new targets is urgently required to tackle the rise in resistance to antimalarial drugs. Now, inhibition of the enzyme N-myristoyltransferase has been shown to prevent the formation of a critical subcellular organelle in the parasite that causes malaria, leading to death of the parasite.

An eleven-step synthesis of (±)-spongiolactone from 1,3-cyclohexanedione is reported that relies on a diastereoselective, nucleophile-catalyzed aldol lactonization (NCAL) process with an advanced ketoacid intermediate that installed the anticipated β-lactone pharmacophore of the natural product. In addition, a stereoselective cyclohexenyl zinc addition to a substituted cyclohexanone simultaneously installed two fully substituted vicinal stereocenters. The reported synthesis enabled preliminary structure-activity studies that revealed a regio- and stereoisomeric derivative of spongiolactone with greater antiproliferative activity towards a leukemia (K562) cell line. Furthermore, unusual antiproliferative selectivity of these spongiolactone derivatives toward the K562 cell line was observed with no inhibition of the breast, liver, and lung cancer cell lines tested.

Discovering and validating new targets is urgently required to tackle the rise in resistance to antimalarial drugs. Now, inhibition of the enzyme N -myristoyltransferase has been shown to prevent the formation of a critical subcellular organelle in the parasite that causes malaria, leading to death of the parasite.

Profil zeigen: Neuartige aktivitätsbasierte Sonden wurden entwickelt, die selektiv Monoaminooxidasen A und B in lebenden Zellen markieren. Mit diesen Sonden konnte gezeigt werden, dass der gegen Parkinson eingesetzte MAO-Inhibitor Deprenyl trotz seines kovalenten Wirkmechanismus eine einzigartige Proteinspezifität aufweist. Aktivitätsbasiertes Protein-Profiling (ABPP) hat sich als nützliche chemische Proteommethode etabliert, mit der es möglich ist, komplexe Ligand-Protein-Wechselwirkungen in ihrer nativen Umgebung zu untersuchen.1 Die Verwendung von kleinen aktivitätsbasierten Sondenmolekülen zur Untersuchung der Enzymaktivität innerhalb zellulärer Systeme hat zur Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von Proteinen geführt, die bei Krebs,2 Signaltransduktion,3 mikrobieller Pathogenese und Virulenz,4 Virus-Gast-Interaktionen5 und anderen biologischen Prozessen eine Rolle spielen. Bisherige ABPP-Studien haben aber fast ausschließlich auf Enzymklassen mit wohletablierten katalytischen Mechanismen abgezielt, deren nukleophile Reste im aktiven Zentrum mit der aktivitätsbasierten Sonde kovalente Bindungen eingehen können (z. B. Serinhydrolasen,6 Cystein-7 oder Threoninproteasen8 usw.). Daraus ergibt sich für das ABPP die wichtige Herausforderung, neuartige Sondenmoleküle zur Verfügung zu stellen, mit denen Enzymklassen mit komplexeren katalytischen Aktivitäten, wie z. B. Kinasen,3, 9 Transferasen10 und Oxidoreduktasen,11 zugänglich gemacht werden und damit ein breiterer Proteombereich abgedeckt werden kann. Wir präsentieren erstmals eine neuartige Klasse von aktivitätsbasierten Sondenmolekülen für eine wichtige Gruppe von Oxidoreduktasen, nämlich Flavin-abhängige Oxidasen. Flavin-abhängige Enzyme katalysieren eine ganze Reihe von Reaktionen, wie Oxidationen, Monooxygenierungen, Dehydrierungen, Reduktionen und Halogenierungen, was sie unentbehrlich für viele zelluläre Prozesse macht.12 Flavin-abhängige Oxidasen repräsentieren eine komplexe Untergruppe, die mit molekularem Sauerstoff als Elektronenakzeptor ein breites Spektrum an Molekülen oxidiert.13 Aufgrund ihrer intrinsischen strukturellen Diversität, der Vielfalt an akzeptierten Substraten und dem Fehlen von konservierten Resten im aktiven Zentrum entziehen sie sich der funktionellen Annotierung durch etablierte genomische, strukturelle oder Proteomanalysen.14 ABPP hingegen könnte eine einfache und nützliche Alternative für das globale Profiling dieser Enzyme darstellen. Wir hielten es für möglich, selektive aktivitätsbasierte Sondenmmoleküle herzustellen, die auf dem Prinzip der Bindung von oxidativ aktivierten Sonden zum Flavin-Cofaktor beruhen, dem einzigen intrinsischen Element das allen Flavin-abhängigen Oxidasen gemein ist.15 Wir präsentieren die Entwicklung und biologische Validierung dieser neuartigen chemischen Proteomik-Strategie für Flavin-abhängige Oxidasen, bei dem wir einen markierungsfreien Ansatz für die In-situ-Enzymmarkierung in lebenden Zellen verfolgen. Durch anschließende Zelllyse gefolgt von Klick-Chemie16 werden Fluoreszenzmarker eingeführt, mit denen die Enzymaktivitäten mittels Gelelektrophorese und Fluoreszenz-Scanning bestimmt werden können. Die Identität der markierten Enzyme wird mithilfe einer LC-MS-basierten Analyseplattform bestimmt (Abbildung 1 A). A) Identifizierung der Zielproteine mithilfe von ABPP. B) Markierung der aktivitätsbasierten Sonden zur Bestimmung von Monoaminooxidasen (FAD-abhängige Oxidasen). Wir überprüften unser ABPP-Design an Monoaminooxidase als repräsentatives Beispiel von Flavin-abhängigen Oxidasen, um den neuen Markierungsmechanismus an einem wohlbekannten Target zu validieren. Monoaminooxidasen17 (MAO, EC 1.4.3.4) sind FAD-haltige Enzyme, lokalisiert in der äußeren mitochondrialen Membran, die die oxidative Deaminierung einiger wichtiger Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (CNS) wie Serotonin, Norepinephrin, Dopamin und xenobiotischer Amine katalysiert. In Menschen kommen zwei Isoformen der Monoaminooxidasen vor, nämlich MAO A und MAO B,18 die auf zwei verschiedenen Genen19 des X-Chromosoms codiert sind und unterschiedliche Substratselektivitäten und Inhibitorsensitivitäten aufweisen,18 obwohl sie ein hohes Ausmaß an Sequenzidentität (70 %) zeigen.19 Die Aufklärung der Kristallstrukturen für beide Isoenzyme MAO A20 und MAO B21 ermöglichte ein detailliertes Bild der strukturellen Besonderheiten in den aktiven Zentren, die die unterschiedliche Substrat- und Inhibitorspezifitäten erklären.20, 22 Darüber hinaus bestätigten sie die kovalente Verknüpfung23 des Isoalloxazin-Rings des FAD-Cofaktor über eine 8α-(S-Cysteinyl)-Verknüpfung zu einem Cys-Rest.24 Aufgrund ihrer Beteiligung im Katabolismus und der Regulation von Neurotransmittern spielen Monaminooxidasen eine essentielle Rolle in der Entwicklung und normalen Funktion des Gehirns. Mutationen des MAO-A-Gens werden mit aggressivem Verhalten in Verbindung gebracht,25 während altersbedingte Erhöhung der Expression von MAO A im Herz26 und MAO B in neuronalem Gewebe27 mit der Entwicklung von kardiovaskulären28 und neurodegenerativen Erkrankungen29 assoziiert werden. Folglich werden MAO-Inhibitoren in der klinischen Praxis zur Behandlung von Depression, Parkinson’s Krankheit, Angstzuständen und anderen mentalen Krankheiten eingesetzt.30 Wir planten und synthetisierten einen kleinen Satz an neuartigen Aktivitätssonden (Abbildung 2 A) auf der Basis der bekannten irreversiblen MAO-Inhibitoren Pargylin und Deprenyl (Abbildung 2 B). Diese Inhibitoren wurden für die funktionelle und biochemische Charakterisierung von Monoaminooxidasen verwendet und sind nützliche Medikamente in klinischer Anwendung.31, 32 Beide Inhibitoren weisen eine N-Propargylamin-Einheit auf, die für die irreversible Enzyminhibierung durch die Bildung eines kovalenten Addukts verantwortlich ist, wie durch Kristallstrukturen von MAO mit acetylenischen Inhibitoren wie Deprenyl, Clorgylin oder Rasagilin eindeutig nachgewiesen werden konnte.20, 33 Im ersten Schritt des Inhibierungsmechanismus wird durch den FAD-Cofaktor das Amin katalytisch zu einem Iminium-Ion oxidiert, wodurch sich ein reaktiver Michael-Akzeptor bildet, der vom N(5)-Atom des Isoalloxazin-Rings nukleophil angegriffen wird und dabei das kovalente Addukt bildet. Wir rechneten damit, dass unsere von diesen Inhibitoren abgeleiteten aktivitätsbasierten Sonden nach dem gleichen Markierungsmechanismus wirken sollten (Abbildung 1 B). Design und Synthese von ABP-Sonden für Monoaminooxidasen (MAO). A) Strukturen des durch irreversible MAO-Inhibitoren inspirierten Satzes an Sonden. B) Strukturen der irreversiblen MAO-Inhibitoren: Pargylin (unspezifisch), Deprenyl (spezifisch für MAO B). C) Syntheseroute für Sonde P1. Die Synthese der ABPP-Sonden begann mit der Einführung der Propargylamin-Gruppe durch reduktive Aminierung. Mitsunobu-Reaktion mit 4-Pentin-1-ol ermöglichte die Anknüpfung eines Alkin-terminierten Alkyl-Linkers under milden Bedingungen, womit die gewünschten Sondenmoleküle erhalten wurden (Abbildung 2 C). Strukturelle Diversität wurde durch Variation des Substitutionsmusters der Aminogruppe und die unterschiedlichen Längen und Strukturen des Kohlenstoffgerüstes zwischen reaktiver Gruppe und Arylring erzielt. Durch Bestimmung der IC50-Werte der synthetisierten Verbindungen in einem gekoppelten Amplex-Red-Peroxidase-Assay und Vergleich mit den zugrundeliegenden Inhibitoren (Abbildung S1 in den Hintergrundinformationen) konnten wir feststellen, inwieweit die Modifikation von Pargylin und Deprenyl durch den Alkin-Linker ihre MAO-Inhibierungseigenschaften verändern würde. Erfreulicherweise führten die in den Sonden vollzogenen Stukturänderungen zu keinen wesentlichen Veränderungen der Inhibitionseigenschaften. Sonde P3, eine racemische Version von Deprenyl mit einem Alkin, zeigte eine verringerte Inhibierung von MAO B, während die auf Pargylin basierende Sonde P1 sogar eine Verbesserung des IC50-Wertes im Vergleich zur Stammstruktur zeigte. Nachdem wir gezeigt hatten, dass unser Sondendesign die Voraussetzung zur Inhibition erfüllt, untersuchten wir ihre Verwendung in vitro unter Verwendung von humaner Monoaminoxidase, die in Pichia pastoris exprimiert worden war. Rekombinante humane MAO-Präparationen wurden mit den entsprechenden Sonden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, und nachfolgend unter CuI-katalysierter Alkin-Azid-Cycloaddition (Klick-Chemie, CC)16 mit einem TAMRA-Azid markiert (Abbildung S2 A). In-Gel-Fluoreszenzscanning wurde zum Nachweis der Markierungsergebnisse eingesetzt (Abbildung 3). SDS-PAGE-Fluoreszenzanalyse der Markierung von Monoaminooxidase A und B in vitro. A) Screening der Alkinsonden P1–6 mit MAO A und MAO B. B) Vergleich von Fluoreszenzscanning (FS) und Coomassie-Brillantblau(CBB)-Färbung der Markierung von MAO B durch Sonde P3. C) Markierung von MAO A und MAO B nach Hitzedenaturierung (6 min bei 96 °C) (rechts) und ohne Hitzedenaturierung (links) des Enzyms. D) Konzentrationsabhängige Markierung von MAO A und MAO B durch Sonde P1. E) Kompetitive Markierung von MAO A und MAO B mit Pargylin und Sonde P1. F) Markierung einer Mischung von beiden MAO-Isoformen mit Sonde P1, P3 und P5. In diesen orientierenden Versuchen konnten wir zeigen, dass beide MAO-Isoformen als das Hauptziel von den drei Sonden P1, P3 und P5 (Abbildung 3 A und B) mit leicht unterschiedlicher Isoformpräferenz (Abbildung 3 F) bei niedrigen Konzentrationen bis zu 100 nM (Abbildung 3 D) markiert werden. Interessanterweise besitzen alle im Screening als aktiv identifizierten Sonden (P1, P3, P5) eine tertiäre Amin-Einheit mit Methylsubstituenten, was auf die Wichtigkeit dieses Fragments zur effizienten Markierung hindeutet. Die strukturellen Analoga ohne Methylsubstituent an der Aminogruppe (P2, P4, P6) zeigten nur schwache Signale, die suggerieren, dass eine sekundäre Aminogruppe die Wechselwirkung zwischen Sonde und Protein mindert oder ein ungünstiges Redoxverhalten bedingt. Das Markierungsereignis bleibt vollständig aus, wenn das Protein vor dem Inkubieren mit der Sonde durch Hitze denaturiert worden ist (Abbildung 3 C), womit belegt wird, dass eine spezifische Markierung nur mit aktivem Enzym vollzogen wird. In Konkurrenzexperimenten konnten wir zeigen, dass unsere ABPP-Sonden mit MAO-spezifischen Inhibitoren um dieselbe Bindungsstelle (Flavin-Cofaktor) im aktiven Zentrum konkurrieren, da Pargylin die Enzymmarkierung durch Sonde P1 vollständig unterdrückt (Abbildung 3 E). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass das entwickelte ABPP-System ein effektives Werkzeug für das Profilieren der Enzymaktivität von beiden MAO-Isoformen in vitro darstellt. Dies motivierte uns, die Aktivität und Selektivität der besten Sonden P1 und P3 für die Untersuchung von Aktivitätsprofilen der Monoaminooxidasen in komplexeren biologischen Proben zu überprüfen. Darüber hinaus waren wir neugierig, ob diese Sonden in der Lage wären, auch andere Flavin-abhängige Enzyme zu adressieren. Zunächst untersuchten wir die allgemeinen Markierungseigenschaften der Sonden P1 und P3 mit verschiedenen Organhomogenaten von Mäusen (Herz, Lunge, Gehirn). Interessanterweise waren die einzigen spezifischen Banden nur in der unlöslichen Fraktion von Mäusehirnlysaten sichtbar (Abbildung S3). Sonde P1, abgeleitet vom unspezifischen MAO-Inhibitor Pargylin, markierte zwei Proteine im Bereich von 60 kDa, während Sonde P3, abgeleitet vom MAO-B-spezifischen Inhibitor Deprenyl, nur ein Protein markierte, das mit der unteren Bande der Markierung durch P1 identisch war. Die Markierung erfolgte dosisabhängig und war auch noch bei Konzentrationen von 100 nM sichtbar (Abbildung S3 B). Bedeutsamerweise entsprachen einerseits die Mobilität der markierten Banden denen von MAO A (obere Bande) und MAO B (untere Bande) (Abbildung S3 C), andererseits unterblieb die Markierung, wenn das Lysat zuerst mit einem Überschuss an MAO-Inhibitoren inkubiert worden war (Abbildung S3 D). Vor dem Hintergrund, dass Pargylin und Deprenyl in der Untersuchung und Behandlung von CNS-Krankheiten (z. B. Deprenyl in der Parkinson-Therapie)32 eingesetzt werden, betrachteten wir eine humane Gehirn-Krebszelllinie (RAEW genannt), die aus einem an einem Glioblastom-Multiform(GBM)-Tumor erkrankten Patienten isoliert worden war, als ein geeignetes Testsystem für die Targetvalidierung.34 Wir bestimmten die Cytotoxizität der Sonden P1 und P3 in eukaryotischen Zelllinien (GBM-Modell, DBTRG-05MG) und stellten fest, dass die Zellen im für unsere ABPP-Experimente benötigten Konzentrationsbereich weiterhin vital waren (Abbildung S4). In-situ-Markierung von GBM-Zellen ergab, dass beide Sonden P1 und P3 zwei Banden im Bereich von 63 kDa als Hauptproteintargets markierten, wobei sich Sonde P3 als viel effektiver erwies (Abbildung 4 A). Eine Konzentration der Sonde P3 von 50 µM war ausreichend, um Sättigung in der Bindung zu erreichen, während noch höhere Konzentrationen die Markierung der viel schwächeren unteren Bande nicht weiter verstärkten. Wichtig zu erwähnen ist, dass bekannte MAO-Inhibitoren die Markierung durch die Sonde P3 verhinderten, was darauf hinwies, dass es sich bei diesen beiden Proteinen um MAO A (60.5 kDa)35 und MAO B (59.4 kDa)35 handeln könnte. Um eine eindeutige Zuordnung der markierten Proteine treffen zu können, führten wir eine quantitative Proteomanalyse mit einem trifunktionellen Reporter-Linker (Biotin-TAMRA-Azid, Abbildung S2 B) durch, der an Sonde P3 unter CC-Bedingungen angeknüpft wurde, um Visualisierung, Anreicherung und nachfolgende Identifikation mittels Massenspektrometrie zu ermöglichen.4e Analyse der Peptidfragmente mithilfe des SEQUEST-Algorithmus identifizierte MAO A mit etwa 40 % Proteinabdeckung (obere Bande der Fluoreszenz-SDS-PAGE). Leider erwies sich die Anreicherung der unteren Proteinbande auf Avidin-Beads als nicht ausreichend. Dieses Protein konnte jedoch eindeutig als MAO B durch Western-Blotting mittels spezifischen Anti-MAO-B-Antikörpern identifiziert werden (Abbildung 4 C). A) In-situ-ABPP-Markierung von humanen Gehirn-Krebszelllinien (unlösliche Fraktion, für das gesamte Proteom siehe Abbildung S5) mit Sonden P1 (Spuren 5 und 6) und P3 (Spuren 2–4). Kompetitive Markierung mit MAO-Inhibitoren Deprenyl (Dep) und Pargylin (Par) und Sonde P3 (Spuren 7 und 8). B) Vergleich von Fluoreszenzscanning und CBB-Färbung der Markierung durch Sonde P3. C) Identifizierung der unteren Bande durch Western-Blotting (WB) mit spezifischen Anti-MAO-B-Antikörpern. Diese Markierungsexperimente mit lebenden Gehirnzellen zeigen, dass die kovalent bindenden Inhibitoren Pargylin und Deprenyl sehr selektiv mit MAO A und B, aber nicht mit anderen Zielproteinen reagieren. Diese außerordentliche Selektivität ist durch den einzigartigen “Selbstmord”-Inhibierungsmechanismus bedingt, der für diese Enzymfamilie maßgeschneidert wurde. Dieser Befund steht im Gegensatz zu anderen ABPP-Studien, die eine Reihe von Off-Targets für klinisch verwendete, kovalent wirkende Medikamente identifiziert haben.36 Die vom MAO-B-spezifischen Inhibitor Deprenyl abgeleitete Sonde P3 zeigte in der In-vitro- und In-situ-Markierung unterschiedliche Isozympräferenz. In Experimenten mit rekombinanten Proteinen markierte diese Sonde beide MAO-Isoformen, in Übereinstimmung mit Studien, die auf einen Verlust der MAO-B-Spezifität bei höheren Konzentrationen hinweisen.37 P3 zeigte jedoch eine höhere Bindungsaffinität zu MAO B (Abbildung 3 F), was sich auch im Mausgehirnextrakt zeigte, bei dem nur die untere Bande, sehr wahrscheinlich MAO B, markiert wurde (Abbildung S3 A). Interessanterweise band dieselbe Sonde in menschlichen Gehrinzellen bevorzugt an MAO A. Dieses bemerkenswerte Ergebnis kann durch die Tatsache erklärt werden, dass die Aktivität von MAO A in intakten Zellen viel höher als für das gereinigte Enzym ist, das bekanntermaßen bei Raumtemperatur instabil ist und seine Aktivität schnell verliert.38 Weiters könnte man vermuten, dass die Topologie der äußeren mitochondrialen Membran (MOM) die Zugänglichkeit der Sonde zum Enzym beeinflussen könnte. Jüngste Studien zeigten,39 dass MAO A in intakten Rattenlebermitochondrien und intakten humanen Plazentazellen an der cytosolischen Seite lokalisiert ist,40 während sich MAO B im Intermembranraum befindet,39 was für die Sonde MOM-Permeabilität notwendig machen würde.41 Andererseits korreliert die schwache Markierung von MAO B sehr gut mit der in einigen kultivierten Gehirnzellen gefundenen niedrigeren Aktivität von MAO B,42 obwohl beide MAO-Isoformen im menschlichen Gehirn in ähnlichem Ausmaß exprimiert werden.43 Zusammengenommen unterstreichen diese Resultate die Bedeutung von In-situ-Studien zur Enzymaktivität, die offensichtlich nicht einfach von der beobachteten Enzymhäufigkeit abhängt, sondern durch viele dynamische Prozesse reguliert wird, die nur in intakten lebenden Zellen stattfinden. Zusammenfassend haben wir die ersten aktivitätsbasierten Sonden präsentiert, die auf Flavin-abhängige Oxidasen abzielen. Wir konnten ihre Nützlichkeit in ABPP-Studien mit Gewebeproben und lebenden Zellen vor allem in der Beschreibung der Aktivität von Monoaminooxidasen zeigen. Der außergewöhnliche Markierungsmechanismus sorgt für eine exzellente Selektivität dieser Sondenmoleküle, die es uns erlaubte, die Off-Target- Wechselwirkungen des klinisch genutzten Medikaments Deprenyl zu untersuchen, für das wir zeigen konnten, dass es ausschließlich mit MAO A und B reagiert. Wir sind überzeugt, dass durch sorgfältige Optimierung der Kernstruktur unser Sonden die Anwendungsbreite unseres chemoproteomischen Ansatzes erweitert werden kann, die zum einen zu einer noch höheren Spezifität bzw. andererseits zu einem breiteren Spektrum an erreichbaren Flavinoxidasen führen wird. In unseren Labors werden gegenwärtig Anstrengungen in dieser Richtung unternommen. Professor Herbert Waldmann zum 55. Geburtstag gewidmet Detailed facts of importance to specialist readers are published as ”Supporting Information”. Such documents are peer-reviewed, but not copy-edited or typeset. They are made available as submitted by the authors. Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article.

Natural products represent an important treasure box of biologically active molecules, from which many drug candidates have been sourced. The identification of the target proteins addressed by these natural products is a foremost goal for which new techniques are required. Activity-based protein profiling (ABPP), exploiting protein-reactive functional groups present in many natural products, offers unseen opportunities in this respect. This review article describes the current status of this field. Many examples are given for the annotation of biological target proteins of natural products containing epoxides, lactones, lactams, Michael acceptors, and other electrophilic groups. In addition, the development of probe molecules identified from biomimetic natural product libraries is discussed.

High profile: new activity-based protein profiling (ABPP) probes have been designed that target exclusively monoamine oxidases A and B within living cells (see picture; FAD=flavin adenine dinucleotide, FMN=flavin monodinucleotide). With these probes it could be shown that the MAO inhibitor deprenyl, which is in clinical use against Parkinson's disease, shows unique protein specificity despite its covalent mechanism of action.