猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)可引起猪(Sus scrofa domesticus)繁殖障碍,疫苗是预防猪细小病毒病、提高母猪抗病力和繁殖率的有效方法.为高效表达猪细小病毒结构蛋白VP2基因及制备猪细小病毒基因工程亚单位疫苗,根据家蚕密码子频率将PPV-VP2的基因序列进行优化合成,并将此目的基因片段连接到转移载体,通过共转染将目的基因重组到orf1629基因缺损的亲本病毒BmBacmid上,获得重组杆状病毒(Recombinant baculovirus)rBmNPV(PPV-VP2).将重组杆状病毒rBmNPV(PPV-VP2)感染家蚕(Bombyx mori)蚕蛹,并用表达的抗原制作疫苗,采用豚鼠(Cavia porcellus)进行疫苗效力试验.经Western blot和质谱分析、电镜观察表达产物.结果表明,在蚕蛹中成功表达出可自组装成病毒空衣壳颗粒的目的蛋白;表达蛋白产物经血凝反应测定,每克蚕蛹表达的抗原效价相当于200剂以上商用疫苗;用表达产物制备成3种抗原剂量的疫苗免疫豚鼠,均产生抗体反应,其抗体能在体外中和PPV病毒.即使每克蚕蛹制备200头份疫苗免疫豚鼠,其血凝抑制效价(hemagglutination inhibition,HI)也达到了1:128,中和抗体效价达到1:83,不低于市售商品苗免疫产生的效价.本研究为猪细小病毒亚单位空衣壳疫苗提供了低成本生产方法.

纳米抗体(nanobody,Nb)作为目前已知的能与目标抗原结合的最小单位抗体,在生物医药、临床研究等方面具有良好的应用前景.根据大肠杆菌密码子偏好性优化合成严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)中和性纳米抗体H11-D4基因,将其克隆到pET28a表达载体上后,转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)进行诱导表达,通过镍柱纯化、质谱分析、Western Blot鉴定H11-D4的表达情况并使用中和试验验证其中和活性.研究结果显示,纳米抗体H11-D4可成功在大肠杆菌中表达,最佳诱导条件为IPTG终浓度1.0mmol·L-1,37℃诱导5h.H11-D4抗体的分子量大小约为17.9kD,与预测值相符.经镍柱纯化后,产量为25.16 mg·L-1.透析复性后利用TritonX-114快速有效地去除了内毒素,中和试验成功验证了 H11-D4的中和活性(IC50)为171.1 nmol·L-1,研究结果可为纳米抗体的原核表达和新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)的预防及治疗提供基础数据支撑.

干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性,可增强机体抗病毒能力,已经广泛应用于病毒性疾病的防控.小反刍兽疫病毒是危害山羊、绵羊等小反刍动物常见的病毒之一,该病毒的传播对全球养殖业造成了严重的影响.为了表达具有高效抗病毒活性的羊α干扰素(OviIFN-α),将OviIFN-α基因序列根据家蚕密码子偏好性进行优化合成,构建pVL1393-OviIFN-α转移载体,将转移载体与ORF1629缺失型杆状病毒基因组DNA利用脂质体介导的转染法在BmN细胞中进行重组,重组病毒感染家蚕,在蚕血淋巴液中获取重组蛋白OviIFN-α.利用微量细胞病变抑制法在BHK-VSV*GFP系统中检测到该蛋白表达量可达6.5×105 U/mL左右.小反刍兽疫病毒增殖抑制实验显示,羊α干扰素对小反刍兽疫病毒在BHK细胞中的复制产生了明显的抑制作用,IC50为136.93 U左右.该结果为羊α干扰素用于小反刍兽疫疫情防控提供了重要的理论依据.

为了用家蚕杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白,将不同株系的PCV2 Cap蛋白基因、人工改造的Cap蛋白突变体基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体,用共转染技术成功构建了重组杆状病毒.将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量Cap蛋白的表达产物.结果表明,纯化蛋白主要为病毒空衣壳粒子,推算PCV2空衣壳在家蚕中的表达量可达1.2 mg/蛹～1.6 mg/蛹.电镜观察可见到完整的空衣壳粒子,胶体金标记免疫电镜观察可见到完整的胶体金粒子,金粒大小为10 nm.

杆状病毒表达系统主要宿主有昆虫细胞和家蚕两种类型,已广泛应用于结构生物学的研究和生物制剂尤其是疫苗的研发.近十余年来由于合成生物学的发展,该系统的发展目标已从单一基因操作转向于需多基因协同操作才能完成的任务.重点研究领域涵盖了难以表达蛋白如膜蛋白的表达量改善、多基因协调表达的兴起尤其是重组腺相关病毒(rAAV)的包装研究、杆状病毒作为哺乳动物基因呈递载体应用的优化、高质量完全人源化蛋白表达系统的建立和完善、通过研究杆状病毒和宿主的互作以改善表达产物的质和量等方面,这极大地拓展了该系统作为一个表达系统的研发应用范围.该系统优化的重点在于进行系统、集成式的改良以提高目的产品的质和量,尤其是应重视宿主侧的遗传背景改良以及病毒和宿主互作的研究.

CRISPR技术作为一种新型的基因编辑技术,被广泛应用于微生物、动物和植物领域.对CRISPR/Cas系统的起源、分类特点等进行了阐述,重点梳理了CRISPR/Cas系统分类的发展历程,并根据最新分类方法,介绍了不同类型的CRISPR/Cas系统的作用机制、内部不同蛋白的作用特点及应用与发展,以期探寻更多的CRISPR/Cas系统,扩大该系统的应用领域.

干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用.利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物.采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ 的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL.此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖.上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础.

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性、接触性传染病,对我国的畜牧业发展造成了严重的影响,目前主要通过疫苗进行防控.为检测PPRV主要抗原蛋白血凝素(hemagglutinin,H)蛋白的免疫原性,从GenBank数据库中查找了近年来公布的H蛋白氨基酸序列,选择1条符合我国流行趋势的序列,对其基因序列进行优化合成后克隆至pET28a载体上.筛选出表达量高的Rosetta(DE3)菌株进行表达,表达产物经SDS-PAGE、Western Blot及质谱分析鉴定.经镍柱亲和层析纯化出单一H蛋白,取20μg与佐剂混合后免疫小鼠,收集血清进行抗体效价检测,结果显示,血清中H蛋白抗体滴度在二免2周时达到1:6400,表明H蛋白具有较好的免疫原性.进一步对二免2周时血清进行中和抗体检测显示,小鼠血清对PPRV疫苗株具有中和效应,中和效价不超过1:40.研究结果对H蛋白用于PPRV疫苗的研发提供了理论依据.

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的世界上最重要的畜牧疾病之一,严重影响世界畜牧业的发展,而疫苗免疫仍然是对疫情预防和控制的最有效手段.铁蛋白具有自组装和生物修饰的特性,在纳米疫苗等领域具有广阔的应用前景.选用O型口蹄疫病毒的vp1基因和幽门螺杆菌铁蛋白基因,通过融合PCR将vp1基因构建到铁蛋白亚基基因前端,在大肠杆菌中表达后通过His标签进行镍柱亲和层析纯化.将纯化好的重组蛋白进行Western blotting检测、质谱分析和透射电镜观察,发现重组蛋白VP1-Ferritin在大肠杆菌中获得表达,并可自组装成纳米颗粒.

干扰素(interferon,IFN)是宿主先天免疫系统的重要组成部分,它是抵抗病原体的第一道防御.为了利用家蚕杆状病毒表达系统表达鸡κ干扰素,根据已报道的序列对鸡κ干扰素的基因序列进行家蚕密码子优化,并利用共转染技术成功构建了表达用重组杆状病毒.将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量鸡κ干扰素的表达产物,并通过Western blot技术对产物进行了检测鉴定.用细胞病变抑制法对干扰素κ抑制VSV-GFP感染鸡成纤维细胞(CEF)的效果进行检测,结果显示鸡干扰素κ的抗病毒效价可以达到(1.04±0.23)×107 IU·mL-1以上.高效价鸡κ干扰素的成功表达为其在抗家禽疫病等方面提供了重要的试验数据.

传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)是传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)的病原,其导致的高死亡率使全球的家禽养殖业受到了严重的经济损失.近年来,基因工程疫苗和DNA疫苗的迅速发展为IBD更有效的防控带来了希望.基于自然合成的铁蛋白大多可以组装成较稳定的多聚体这一特点,其可以作为很多疾病的免疫原载体.根据大肠杆菌密码子的偏好性,对IBDV-VP2、铁蛋白序列进行了优化,并通过大肠杆菌表达系统进行了融合表达,通过质谱、Western blotting、SDS-PAGE检测,该融合蛋白已成功在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,且通过透射电镜可观察到大小均一的纳米级颗粒,研究结果为后期探究铁蛋白自组装对提高IBDV疫苗的广谱性、免疫原性的作用提供了参考,也为进一步研究其作为药物和抗原载体的应用机制奠定了基础.

目前,传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒(减毒)猪瘟疫苗存在免疫保护期短、毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决上述问题.铁蛋白24个亚基可以自组装成稳定的多聚体纳米颗粒,成为理想的抗原呈递载体和疫苗开发平台.基于此,将铁蛋白与具有较强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2(具有高保守性的保护性抗原)结合,构建融合基因E2-Fe,将该基因克隆到pET28a原核表达载体中,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导条件的探索及其高效表达,再将表达的融合蛋白进行镍柱纯化、质谱分析、Western-blotting验证及电镜检测.结果 显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到pET-28a载体上,0.50％乳糖诱导6h为融合蛋白E2-Fe表达的最优条件;质谱分析与Western-blotting均显示融合蛋白的大小约为51 kD,与理论值相符;电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm.结果 表明,融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2在大肠杆菌中得到高效表达,经镍柱纯化后可获得数量可观的自组装纳米颗粒抗原,为研究新的猪瘟疫苗拓宽了研究思路.

鸭α干扰素(DuIFN-α)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤等生物学活性的细胞因子,可用于鸭及其他家禽养殖业中各种病毒性疾病的预防和治疗.将编码鸭α干扰素的基因序列密码子优化后进行合成,再对翻译起始序列进行优化,然后将2条序列分别克隆到杆状病毒转移载体上得到pVL1393-DuIFN-α和pVL1393-DuIFN-αm,与缺失orf1629的杆状病毒reBmBac共转染家蚕卵巢细胞系,获得携带目的片段的重组病毒reBmBac-DuIFN-α和reBmBac-DuIFN-αm.用重组病毒感染5龄起蚕后从血淋巴中获得表达产物,在鸡胚细胞中采用微量细胞病变抑制法检测表达产物对VSV* GFP病毒的抑制效果.结果 显示,重组DuIFN-α产物的效价可达8.13×105 U/mL,重组DuIFN-αm的效价可达3.07× 105 U/mL;重组病毒reBmBac-DuIFN-α经筛选纯化后,表达量提高,最高效价可达(1.90±0.25)×106 U/mL.研究结果为利用家蚕杆状病毒表达系统表达生产高抗病毒活性的重组鸭α干扰素奠定了基础.

λ干扰素作为一种多效性细胞因子属于Ⅲ型干扰素,研究表明其能够对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素逃逸的病毒起作用.为了利用家蚕杆状病毒表达系统高效表达出具有高抗病毒活性的羊λ3干扰素(OvIFN-λ3),首先将OvIFN-λ3基因优化后合成,将其克隆至转移载体pVL1393中,得到重组质粒pVL1393-OvIFNλ3,再将重组质粒与失活拯救型家蚕杆状病毒穿梭载体reBmBac DNA共转染家蚕卵巢传代细胞Bm-N,得到含OvIFN-λ3基因的重组杆状病毒.随后利用重组杆状病毒感染五龄起蚕,待其发病后收集蚕血淋巴.采用微量细胞病变抑制法在羊肾细胞上进行重组表达绿色荧光蛋白的水疱型口炎病毒(recombinant vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,VSV-GFP)的攻毒实验,测定OvIFN-λ3抗病毒活性可达(6.5±0.27)×105 U/mL;利用空斑筛选法筛选重组病毒,感染家蚕后,测定其效价最高可达(3.1±0.42)×106 U/mL,表达量明显提高.家蚕杆状病毒表达系统为羊λ3干扰素产品的大量生产应用提供了新方法.

随着基因治疗产品不断得到批准用于临床研究,基因治疗相关的病毒载体也受到广泛关注,其中腺相关病毒载体因其低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛且稳定表达等独特优势成为最有前景的病毒载体,广泛应用于临床研究,目前已有2种重组腺相关病毒载体的药品得到批准且效果显著,但由于大规模生产技术的缺乏限制了重组腺相关病毒载体的研究和广泛应用.就腺相关病毒的结构和功能、载体的生产方式及其现阶段在基因治疗中的应用进行了综述,以期为今后以腺相关病毒为载体的基因治疗大规模应用于市场提供参考.

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAY)是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统(AcMNPV-sf9)包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用.家蚕杆状病毒表达系统与AcMNPV-sf9系统相比,具有包装量更高、成本更低的优势,因此更适用于包装重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV).首先,将AAV2功能基因cap和rep进行序列优化后合成,克隆到杆状病毒转移载体pVL1393上,将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和荧光素酶(luciferase,Luc)基因分别作为报告基因克隆到含有巨噬细胞病毒IE(cytomegalovirus-IE,CMV-IE)启动子的病毒转移载体pVL1393-ITRs-MCS上.随后,将构建好的转移载体分别与缺陷型家蚕杆状病毒reBmBac共转染BmN细胞系,获得分别重组有cap、rep和报告基因的家蚕杆状病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV).再将纯化的重组病毒(reBm-Cap2、reBm-Rep2)与reBm-EGFP、reBm-Luc分别混合后感染家蚕,收获其表达产物,纯化得到含有目的基因的rAAV病毒.利用rAAV病毒感染哺乳动物细胞后,通过检测EGFP、Luc的表达状态来验证rAAV包装成功与否.结果显示,利用家蚕杆状病毒系统成功包装了rAAV2,并且在哺乳动物细胞中实现了报告基因的表达.

鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)是一类具有免疫调节及抗病毒活性的细胞因子.利用家蚕杆状病毒表达系统表达具有高生物活性的鸡γ-干扰素.首先,对ChIFN-γ基因序列进行优化与合成,再将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393多克隆位点中,与缺少orf1629基因的家蚕杆状病毒reBmBac共转染BmN细胞获得重组病毒reBm-ChIFN-γ.将reBm-ChIFN-γ注射感染家蚕5龄幼虫,检测感染后96～120 h之间发病蚕体的血淋巴.PCR扩增结果显示成功构建了重组杆状病毒reBm-ChIFN-γ,Western blot检测重组杆状病毒在家蚕体内表达了目的干扰素,微量细胞病变抑制法检测表达产物具有明显的抗病毒活性,效价约为(3.24±0.32)×106 U/mL.试验结果表明,利用家蚕杆状病毒表达系统成功地表达出具有较高抗病毒活性的鸡γ-干扰素,为鸡γ-干扰素相关生物制剂的研发奠定了基础.

Interferon (IFN) has a broad spectrum of antiviral activity.In order to meet the requirement of using interferon in prevention and treatment of livestock virus disease,the feasibility of preparing recombinant sheep interferon (OvilFN-γ) by silkworm baculovirus expression system is explored.The OvilFN-γ gene sequence was optimized according to codon bias of silkworm and amplified through PCR.The OvilFN-γ gene sequence with His tag sequence (OvilFN-His-Tagged-γ was cloned and used to construct recombinant viruses containing OvilFN-γ and OvilFN-His-Tagged-γ respectively.These two recombinant viruses were used to infect silkworm larvae of the 5th instar.Western blotting revealed successful expression of recombinant OvilFN-γ and OvilFN-His-Tagged-γγ in hemolymph of silkworm.The recombinant OvilFN-γγ in silkworm hemolymph had a titer of 1.6x106 U/mL and that of recombinant OvilFN-His-Tagged-γ had a titer of was 2.8x105 U/mL as detected by cytopathic inhibition method.The former had a stronger antiviral activity than the latter.When diluted by 2.0x104 times,it could completely inhibit VSV-GFP virus infection.The above results provide a good experimental basis for efficient and safe production of recombinant interferon γ with antiviral activity in silkworm baculovirus expression system.

利用生物信息学方法,对斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株基因组DNA序列进行分析.结果表明,斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组DNA含有7个同源重复区,分别包含3~8个64 bp不完全回文序列,在回文序列中心均含有一个PvuI限制性酶切位点,并且存在多个正向或反向互补的重复序列和与病毒基因组DNA复制相关的motif基序,对7个hrs中40个回文序列进行比对分析,发现其序列的核苷酸一致性高达90%以上.

淀粉酶是家蚕体内比较重要的一种消化酶.利用real-time PCR技术对Bmamy5和Bmamy7基因在家蚕5龄3d不同组织的mRNA转录水平进行了分析,结果显示Bmamy7只在家蚕5龄3d中肠和马氏管组织中有转录,在中肠组织的转录高达3×109个拷贝/μg总RNA,在马氏管组织中的转录丰度较低,只有1.9×106拷贝/μg总RNA;Bmamy5只在中肠组织中有转录,转录水平为1.5× 109个拷贝/μg总RNA.根据在家蚕转录组数据库中预测的编码家蚕淀粉酶的cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆到两个家蚕淀粉酶基因Bmamy5和Bmamy7,Bmamy7基因长1 608 bp,ORF长1512 bp,编码503个氨基酸;氨基酸序列分析表明Bmamy7具有典型的α-淀粉酶结构域.Bmamy5全长1196bp,ORF长738 bp,编码245个氨基酸.对Bmamy5和Bmamy7进行了原核表达,Bmamy7重组蛋活性较弱,但未检测到Bmamy5重组蛋白的目的条带.研究结果为家蚕淀粉酶基因的研究与应用提供了参考.