Nanotechnology techniques have a prominent role in the current technical and scientific scene. The layer-by-layer (LbL) deposition allows obtaining nanostructures with sophisticated multilayer, using a simple, but versatile technique. This procedure, which is used to coat and functionalize surfaces with nanometer- thick films, has applications in bioengineering, medicine, chemistry, materials and chemical engineering among other areas. Chitosan is a biomaterial, coming from the chitin, a very abundant polymer in nature, which has been recently tested as scaffolds. In this experiment we test the hypothesis that the hyaluronic acid-chitosan polyelectrolyte multilayer biofilm would be a good substrate to the adherence of equine mesenchymal stem cells derived from bone marrow. The results showed that these biofilms accelerate the process of cell adhesion on smooth surfaces, allowing a constant cell growth and creating a great option to cover surgical materials.

A viabilidade e maturidade fetais podem ser estimadas através da avaliação dos fluídos fetais em muitas espécies, no entanto a composição bioquímica do líquido amniótico durante a gestação ainda não está bem definida para a espécie equina. O objetivo deste estudo foi estabelecer e comparar o perfil bioquímico do liquido amniótico em diferentes momentos da gestação e no momento do parto para um melhor entendimento da fisiologia da gestação de equinos. Foram avaliados valores encontrados para pH, osmolaridade, glicose, uréia, creatinina, gamma-GT, sódio, potássio, cloretos e proteína total no liquido amniótico colhido de 122 éguas comparando-se os resultados encontrados entre as colheitas em terço inicial (TI), médio (TM) e final (TF) da gestação e no momento do parto (MP). As amostras colhidas nos períodos gestacionais foram realizadas em frigoríficos abatedouros. As idades gestacionais (IG), em dias, foram definidas através de fórmula de regressão sugerida por Naves et al. (2008), utilizando-se a mensuração crânio-caudal dos fetos. Devido a presença de graus variados de assimetria e desvios de um padrão Gaussiano de distribuição, o teste de Kruskal-Wallis foi usado para comparar a mediana de cada variável-resposta entre os grupos de estudo. Quando houve evidência significante de que pelo menos uma das medianas era diferente das outras, o teste de Wilcoxon foi usado para realizar comparações múltiplas entre os grupos. O método de Bonferroni foi usado para ajustar o valor-P resultante das comparações múltiplas. A análise estatística foi realizada com o procedimento PROC NPAR1WAY e significância estatística foi definida como p<0,05 .pH e osmolaridade do líquido amniótico equino não sofreram alterações significantes entre os terços gestacionais e no momento do parto. Os valores encontrados para glicose foram significativamente menores nas amostras do grupo TF e MP. As concentrações de uréia tenderam ser estatisticamente diferente em pelo menos um dos grupos estudados e foi observado um padrão crescente nas concentrações de creatinina durante as fases gestacionais, enquanto que a concentração encontrada no grupo MP foi igual a concentração encontrada no grupo TF. Valores para gamma GT diferiram apenas entre os grupos TF e MP e mais estudos devem ser conduzidos sobre sua função no liquido amniótico das espécies domésticas. Os valores de sódio e cloretos não diferiram significativamente entre os grupos estudados e as concentrações de potássio diferiram apenas entre os grupos TF e MP refletindo a manutenção do equilíbrio eletrolítico do líquido amniótico equino durante a gestação. As concentrações de proteínas totais variaram de maneira heterogênea entre os grupos, porém todos estes demonstraram baixas concentrações. Concluímos que a composição bioquímica do liquido amniótico equino varia de acordo com o desenvolvimento fetal e pode ser utilizada como mensuração da viabilidade e maturidade do feto no futuro, no entanto devido ao pequeno número de estudos conduzidos e diferenças encontradas em seus resultados, outros estudos devem ser realizados para a melhor definição do perfil bioquímico do líquido amniótico equino durante as fases gestacionais e no momento do parto.

The viability and fetal maturity can be estimated by biochemical evaluation of the fetal fluids of several species; however the biochemical composition of amniotic fluid during pregnancy is not fully defined for equine. The aim of this study was to establish and compare the biochemical profile of amniotic fluid in different moments of pregnancy and at delivery, in order to better explain the peculiarities of the physiology of pregnancy in mares. The values founded for pH, osmolarity, glucose, urea, creatinine, gamma-GT, Sodium, potassium, chloride and total protein were evaluated in amniotic fluid collected from 122 mares comparing the results between the initial-third (IT), mid-third (MT) and latter-third (FT) of gestation and at delivery (D). The gestational period samples were collected at slaughterhouses. Gestational ages (IG), in days, were defined following the regression formula suggested by Naves et al. (2008) by measuring the craniocaudal (CC) distance of the fetuses. Commercial kits for biochemical evaluation were used. Due to the presence of varying degrees of asymmetry and deviations from a standard Gaussian distribution, the Kruskal-Wallis test was used to compare the median of each response variable among the study groups. When there has been significant evidence that at least one of the medians differed from the others, the Wilcoxon test was used to perform multiple comparisons between groups. The Bonferroni method was used to adjust the resulting p-value for multiple comparisons. Statistical analysis was performed using PROC Npar1way and statistical significance was defined as p<0.05. The pH and osmolarity of equine amniotic fluid did not change significantly during the stages of pregnancy and at delivery. The values found for glucose were significantly lower during late pregnancy and at delivery. Concentrations of urea tended to be statistically different in at least one of the groups. A significant increase in creatinine concentrations was observed during the initial-third, medium-third and the final-third of pregnancy and the value found at delivery remained equal to final-third. Values for Gamma GT differed only between FT and D groups and more studies should be conducted about its role in the amniotic fluid of domestic species. For the sodium and chlorideions, they were not significantly different between the studied stages, and the potassium ion was significantly different only between FT and D reflecting the maintenance of electrolyte balance of the amniotic fluid during equine pregnancy. Total protein concentrations were different between groups, but all the groups showed low concentrations. We conclude that the values of the parameters studied varied according with the fetal development and can be used for the evaluation of fetal viability and maturity in the future, but the scarce number of studies in this area and the difference between the results found in literature demonstrate the need of more works to establish the biochemical profile of equine amniotic fluid during pregnancy and at delivery.

O interesse nas pesquisas com células-tronco derivadas de anexos fetais de diversas espécies cresceu exponencialmente nas últimas décadas em virtude de serem fontes de células-tronco adultas com potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares que apresentam pouca ou nenhuma imunogenicidade, apresentando-se assim como alternativa de grande importância para a formação de bancos celulares. Apesar do crescente interesse, os estudos para espécie equina ainda são escassos. O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico equino obtidas do terço inicial, médio e final da gestação (LA-CTMs), comparando suas características. Foram colhidas 23 amostras de líquido amniótico as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e às diferenciações osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro. Todas as amostras demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico as células de todos os grupos foram imunomarcadas para CD44, PCNA e vimentina com ausência de marcação para citoqueratina e Oct-4. Na citometria de fluxo observou-se a expressão de CD44 e CD90 e ausência de expressão de CD34, sendo que os marcadores CD44 e CD90 mostraram padrão de expressão decrescente em relação ao desenvolvimento gestacional. As amostras obtidas de todas as fases da gestação foram capazes de diferenciação nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. Portanto, as células obtidas do líquido amniótico apresentaram características morfológicas, imunofenotípicas e potencial de diferenciação típicos das CTMs, demonstrando que a colheita pode ser realizada em qualquer fase gestacional. No entanto, mais pesquisas devem ser realizadas principalmente quanto à expressão de marcadores de pluripotencialidade (como o Oct-4) e ao seu potencial de diferenciação em linhagens extra mesodermais já relatados na literatura.

Butyrolactone I (BL-I) and roscovitine (ROS) are selective inhibitors of the cyclin-dependent kinases, and both have been shown to reversibly inhibit meiotic resumption in cattle oocytes without having a negative effect on subsequent development to the blastocyst stage. The aim of this study was to evaluate the in vitro production of bovine embryos in the presence of BL-I (Enzo Life Sciences International Inc., Plymouth Meeting, PA, USA) and ROS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). For that, Nellore oocytes were matured in TCM-199 with Earle’s salts + 10% FCS, FSH, and LH, in a 5% CO2 atmosphere. To delay meiosis, the oocytes were maintained for 6 h in medium in the presence of 25 µM BL-I + 6.25 µM ROS. The oocytes were then cultured for 18 h in agent-free medium to resume meiosis, completing 24 h of maturation. After 24 h of maturation (Day 0), oocytes were fertilized in human tubal fluid (HTF, Irvine, New Zealand), in a 5% CO2 atmosphere. Semen was selected through Percoll gradient and the concentration was adjusted to 2 × 106 sperm mL–1. The presumed zygotes were cultured inside a bag in 90-µL droplets of SOFaa + 0.6% BSA + 2.5% FCS in a 5% CO2, 5% O2, and 90% N2 atmosphere until Day 7, when blastocyst rate was evaluated. Five replicates were done. Data were analysed with ANOVA, followed by Tukey’s test using the general linear models procedure (PROC GLM) of SAS, version 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). The level of significance adopted was 5%. No statistical differences were observed in blastocyst production rate: control, 33.3 ± 3.74%; BL-I + ROS, 38.0 ± 4.5%. Thus, the presence of BL-I + ROS in the prematuration medium of bovine oocytes did not compromise their subsequent developmental competence. The next steps of the present study are evaluating the kinetics of blastocyst formation and detecting apoptotic cells in situ by TUNEL, which will show that these substances do not compromise embryonic quality.

O interesse nas pesquisas com células-tronco derivadas de anexos fetais de diversas espécies cresceu exponencialmente nas últimas décadas em virtude de serem fontes de células-tronco adultas com potencial de diferenciação em diversas linhagens celulares que apresentam pouca ou nenhuma imunogenicidade, apresentando-se assim como alternativa de grande importância para a formação de bancos celulares. Apesar do crescente interesse, os estudos para espécie equina ainda são escassos. O objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do líquido amniótico equino obtidas do terço inicial, médio e final da gestação (LA-CTMs), comparando suas características. Foram colhidas 23 amostras de líquido amniótico as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e às diferenciações osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro. Todas as amostras demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico as células de todos os grupos foram imunomarcadas para CD44, PCNA e vimentina com ausência de marcação para citoqueratina e Oct-4. Na citometria de fluxo observou-se a expressão de CD44 e CD90 e ausência de expressão de CD34, sendo que os marcadores CD44 e CD90 mostraram padrão de expressão decrescente em relação ao desenvolvimento gestacional. As amostras obtidas de todas as fases da gestação foram capazes de diferenciação nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. Portanto, as células obtidas do líquido amniótico apresentaram características morfológicas, imunofenotípicas e potencial de diferenciação típicos das CTMs, demonstrando que a colheita pode ser realizada em qualquer fase gestacional. No entanto, mais pesquisas devem ser realizadas principalmente quanto à expressão de marcadores de pluripotencialidade (como o Oct-4) e ao seu potencial de diferenciação em linhagens extra mesodermais já relatados na literatura.The interest in stem cells derived from fetal annexes of many species has exponentially increased during the last decades, because they are adult stem cell sources with potential of differentiation in several cell lineages; which present little or no immunogenicity and are an alternative with great importance for storage cell banks. Despite the rising interest, studies for the equine species are still rare. The aim of this study was to isolate, characterize and differentiate mesenchymal stem cells derived from equine amniotic fluid obtained from initial, middle and late third of gestation (AF-MSCs), and compare their results. Twenty three samples from equine amniotic fluid were evaluated by morphological, immunocytochemical and immunophenotypical (Flow cytometer) assays and osteogenic, adipogenic and chondrogenic in vitro differentiation. All samples demonstrated plastic adhesion and fibroblastoid morphology. The immunocytochemical assay demonstrated cells from all the studied groups were positive for CD44, PCNA and vimentin and negative for cytokeratin and Oct-4. Flow cytometry demonstrated expression of CD44 and CD90 and no expression of CD34, where CD44 and CD90 markers presented decreasing pattern of expression in relation to the gestational development. All samples collected from all gestational phases were capable to differentiate in osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineages. Thus, cells obtained from equine amniotic fluid presented morphological and immunophenotypical characteristics and potential of differentiation typical of MSCs showing that the collection can be performed at any stage of pregnancy. However, more studies should be performed about the expression of pluripotent markers as Oct-4 and the differentiation potential for extra mesodermal lineages prior demonstrated in the literature.

RESUMO A equideocultura tem um papel importante no agronegocio brasileiro gerando divisas e diversos empregos diretos e indiretos. Por este motivo, a pesquisa cientifica em prol do desenvolvimento da producao equina brasileira tem refletido a tendencia atual induzindo estudos principalmente nas areas de medicina esportiva, neonatologia e biotecnologias da reproducao. Assim, na ultima decada surgiu um grande interesse no estudo das celulas-tronco para a medicina equina principalmente para o tratamento das lesoes musculoesqueleticas e osteoarticulares dos cavalos atletas, pelo seu alto potencial de aplicacao na medicina veterinaria regenerativa. As celulas-tronco (CT) podem ser classificadas quanto seu grau de potencialidade como totipotentes, pluripotentes, multipotentes e unipotentes, e quanto a sua origem como embrionarias ou somaticas. As complicacoes do uso terapeutico das CTs embrionarias levaram a identificacao de diversas fontes de celulas-tronco adultas, entre estas as CT hematopoieticas e CTs mesenquimais. A fonte mais utilizada de celulas-tronco mesenquimais (CTM) e a medula ossea, no entanto, como o seu numero e a capacidade de diferenciacao destas celulas diminuem com a idade, seu potencial terapeutico tambem declina com o tempo. Devido a estas limitacoes outras fontes de celulas-tronco mesenquimais foram identificadas, sendo que as celulas derivadas dos anexos fetais tem recebido bastante destaque. CTMs derivadas do liquido amniotico, membrana amniotica, sangue do cordao umbilical e tecido de cordao umbilical humanos ja foram isoladas e caracterizadas demonstrando muitas vantagens em sua utilizacao, como a coleta nao invasiva e indolor, e a possibilidade de formacao de bancos de armazenamento. Alem disso, existem muitos relatos de que as CTMs derivadas de anexos fetais expressam marcadores embrionarios como o Oct-4 e o Nanog, o que demonstra que estas celulas podem manter caracteristicas de pluripotencia dos tecidos de onde se originam. Recentemente, pesquisas com CTMs derivadas dos anexos fetais de equinos tem sido realizadas e vem obtendo excelentes resultados. Esta revisao de literatura tem como objetivo reunir os estudos sobre as celulas-tronco mesenquimais com origem nos anexos fetais demonstrando-as como uma fonte alternativa, etica, de facil obtencao e com grandes vantagens em sua utilizacao na medicina veterinaria equina. Palavras-chave : Celulas-tronco, anexos fetais, equinos ANEXOS FETALES: UNA FUENTE ALTERNATIVA DE CELULAS MADRE MESENQUIMALES PARA LA MEDICINA VETERINARIA EQUINA RESUMEN La cria de caballos tiene un papel importante en la agroindustria brasilera en la generacion de divisas y varios puestos de trabajo directos e indirectos. Por esta razon, hoy en dia la investigacion cientifica para el desarrollo de la produccion brasilera equina refleja la tendencia actual elaborando estudios con enfasis en medicina deportiva, neonatologia y biotecnologia de la reproduccion. Por lo tanto, en la ultima decada ha surgido un grande interes en el estudio de celulas madre para la medicina equina principalmente para el tratamiento de lesiones osteoarticulares y musculo esqueletico de los caballos deportivos, debido a su alto potencial para aplicacion en medicina regenerativa veterinaria. Las celulas madre (CM) se pueden clasificar por su grado de potencialidad como unipotentes, totipotentes, pluripotentes y multipotentes, y cuanto a su origen como embrionarias o somaticas. Las complicaciones del uso terapeutico de CM embrionarias llevaron a la identificacion de varias fuentes de celulas madre adultas, entre estas las CMs hematopoyeticas y mesenquimales. La fuente mas comun de celulas madre mesenquimales (MSC) es la medula osea, sin embargo, como el numero y capacidad de diferenciacion de estas celulas disminuye con la edad, su potencial terapeutico tambien se reduce con el tiempo. Debido a estas limitaciones otras fuentes de celulas madre mesenquimales fueron identificados, y las celulas derivadas de los anexos fetales han recibido mucha atencion. CMMs derivados de liquido amniotico, membrana amniotica, sangre del cordon umbilical y tejido de cordon umbilical humano fueron aisladas y caracterizadas mostrando muchas ventajas en su uso, tales como la recogida no invasiva y sin dolor, y la posibilidad de formacion de bancos de almacenamiento. Ademas, hay muchos informes de que las CMMs derivadas de los anexos fetales expresan marcadores embrionarios, como Oct-4 y Nanog, lo que demuestra que estas celulas pueden mantener las caracteristicas de pluripotencialidad de los tejidos de donde provienen. Recientemente, la investigacion con CMMs derivadas de anexos fetales de equinos estan siendo hechas y estan obteniendo excelentes resultados. Esta revision pretende reunir a los estudios sobre celulas madre mesenquimales procedentes de los anexos fetales muestrando como una fuente alternativa, etica, de facil obtencion y con grandes ventajas en su uso en medicina veterinaria equina. Palabras-clave: Celulas madre, anexos fetales, equino FETAL ANNEXES: AN ALTERNATIVE SOURCE OF MESENCHYMAL STEM CELLS FOR EQUINE VETERINARY MEDICINE ABSTRACT The horse breeding industry has an important role in the Brazilian agribusiness generating wealth and many direct and indirect jobs. For this reason, the scientific research for the development of Brazilian horse production has reflected the current trend leading to studies focusing on sports medicine, neonatology and biotechnology of reproduction. Thus, in the last decade, the study of stem cells has come in scope to equine medicine primarily for the treatment of osteoarticular and musculoskeletal injuries of athletic horses, because it’s high potential for application in veterinary regenerative medicine. Stem cells (SC) can be classified by degree of potential as totipotent, pluripotent, multipotent and unipotent, and by its origin as embryonic or somatic. Complications of the therapeutic use of embryonic SCs leaded to the identification of several sources of adult stem cells, as the hematopoietic SC and mesenchymal SC. The most common source of mesenchymal stem cells (MSCs) is bone marrow, however, as their number and differentiation capacity decrease with age, their therapeutic potential also declines with time. Because of these limitations other sources of mesenchymal stem cells were identified, and the cells derived from fetal annexes have received much attention. MSCs derived from amniotic fluid, amniotic membrane and umbilical cord blood and tissue have been isolated and characterized showing many advantages in its use, such as non-invasive, painless collection and the possibility of formation of storage banks. In addition, there are many reports that MSCs derived from fetal annexes express embryonic markers such as Oct-4 and Nanog, which demonstrates that these cells can maintain pluripotency characteristics of the tissue from which they arise. Recently, several studies using MSCs derived from fetal annexes of horses have been carried out with excellent results. This review aims to gather studies on mesenchymal stem cells derived from horse fetal annexes showing them as an alternative, ethical source, easy to obtain and with great advantages to be used in equine veterinary medicine. Key words: Stem cells, fetal annexes, equine