为了研究阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae,E.cloacae)SDM的2,3-丁二醇脱氢酶(budC)基因对乙偶姻产生的影响,采用自杀质粒同源重组技术敲除该基因.根据E.cloacae SDM的budC基因序列设计引物,构建budC基因敲除质粒,然后将质粒转化进E.cloacae SDM中,根据表型筛选及PCR验证获得budC基因缺失菌株.进行发酵试验后,利用高效液相色谱检测乙偶姻产量.结果表明,目的基因budC 敲除成功,与原始菌株相比,基因缺失菌株 2,3-丁二醇的产量降低了76.34%,乙偶姻的产量提高了103.78%.budC 基因的敲除阻断了乙偶姻进一步分解代谢产生2,3-丁二醇的途径,提高了乙偶姻的产量.该试验获得了E.cloacaeΔbudC突变株,为利用微生物法工业化生产乙偶姻奠定了基础.

旨在应用自杀质粒重组技术,构建阴沟肠杆菌乳酸脱氢酶突变株,为进一步提高乙偶姻的产量和扩大菌株选择范围奠定基础.利用双酶切的方法将同源片段插入到自杀质粒pKR6K中,构建出ldh基因敲除质粒,然后利用细菌接合的方法敲除E.cloacae的ldh基因.成功克隆出两段E.cloacae乳酸脱氢酶基因的同源序列,长度分别为526 bp,通过序列比对分析,E.cloacae乳酸脱氢酶基因序列相似性为100％.通过对E.cloacae进行乳酸脱氢酶基因的敲除,成功构建一株ldh缺失重组菌株E.cloacae △ ldh,同时2,3-丁二醇提高6.8％,乙酸提高了 24.3％.E.cloacae乳酸脱氢酶缺失工程菌株构建成功,对利用微生物法工业化生产乙偶姻奠定基础.

为获得2,3-丁二醇高产菌株,采用两种诱变方法(物理诱变和化学诱变)对阴沟肠杆菌SDM(E1)进行处理.经紫外诱变后筛选出菌株E2,其2,3-丁二醇产量为27.37 g·L-1,相比于出发菌株提高11.33％.采用化学诱变剂硫酸二乙酯对E2进行化学诱变后,筛选出菌株E3,2,3-丁二醇产量为37.32 g·L-1,相比于菌株E2提高36.32％,相比于E1提高51.77％.以E3为出发菌株、玉米芯为底物进行同步糖化发酵效率的研究,确定玉米芯的最佳预处理条件为温度80℃、时间2 h、碱浓度3％、固液比1∶3;纤维素酶解的初步条件为温度45℃、时间72 h、转速140 r·min-1;同步糖化发酵的最佳条件为纤维素酶0.3 g、初始pH 5.7～6.0、温度36℃、底物浓度100 g·L-1(10％),发酵时间72 h,菌株E3的2,3-丁二醇产量可达到35.61 g·L-1.本文研究结果为木质素同步糖化发酵生产2,3-丁二醇的研究提供了菌株材料,并为木质素为底物的同步糖化发酵奠定了技术基础.