Long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) and their metabolites are critical players in cell biology and embryonic development. Here we show that long-chain acyl-CoA synthetase 4a (Acsl4a), an LC-PUFA activating enzyme, is essential for proper patterning of the zebrafish dorsoventral axis. Loss of Acsl4a results in dorsalized embryos due to attenuated bone morphogenetic protein (Bmp) signaling. We demonstrate that Acsl4a modulates the activity of Smad transcription factors, the downstream mediators of Bmp signaling. Acsl4a promotes the inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase and the Akt-mediated inhibition of glycogen synthase kinase 3, critical inhibitors of Smad activity. Consequently, introduction of a constitutively active Akt can rescue the dorsalized phenotype of Acsl4a-deficient embryos. Our results reveal a critical role for Acsl4a in modulating Bmp-Smad activity and provide a potential avenue for LC-PUFAs to influence a variety of developmental processes.

Grainyhead/CP2 transcription factor family members are widely conserved among the animal kingdom and have been implicated in different developmental processes. Thus far, nothing has been known about their roles in zebrafish. Here we identify seven zebrafish grainyhead-like (grhl) / cp2 genes, with focus on grhl1, which is expressed in the periderm and in epidermal ionocyte progenitors, but downregulated when ionocytes differentiate. In addition, expression was detected in other "non-keratinocyte" cell types of the epidermis, such as pvalb8-expressing cells, which according to our lineage tracing experiments are derived from the same pool of progenitor cells like keratinocytes and ionocytes. Antisense morpholino oligonucleotide-based loss-of-function analysis revealed that grhl1 is dispensable for the development and function of all investigated epidermal cell types, but required as a negative regulator of its own transcription during ionocyte differentiation. Knockdown of the transcription factor Foxi3a, which is expressed in a subset of the grhl1 population, caused a loss of ionocytes and a corresponding increase in the number of pvalb8-expressing cells, while leaving the number of grhl1-positive cells unaltered. We propose that grhl1 is a novel common marker of all or most "non-keratinocyte" epidermal progenitors, and that the sub-functionalisation of these cells is regulated by differential positive and negative effects of Foxi3 factors.

Signale durch Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) spielen im Zebrafish und Frosch Embryo eine entscheidende Rolle bei der Musterbildung entlang der dorsoventralen Achse, dabei bestimmen sie sowohl unterschiedliche Zellschicksale als auch die gerichtete Zellbewegung entlang der D/V-Achse wahrend der Gastrulation. Mehrere soegannte forward genetic Screens mit ENU-mutagenisierten Zebrafischen haben die unentbehrliche Funktion von mehreren Komponenten des BMP-Signal-Wegs aufgezeigt, darunter die BMP-Liganden selbst, die Rezeptoren von BMPs, der durch BMPs regulierte Transkriptionsfaktor Smad5 und der extrazellulare BMP-Inhibitor Chordin. Der BMP-Signalweg interagiert mit denen anderer Signalwege, wie Fibroblast Growth Factors oder Wnts. Jedoch gibt es immer noch neue Gene zu entdecken, die in Prozessen der fruhen Musterbildung beteiligt sind; weiterhin ist die genaue Rolle des BMP Gradienten in der Festlegung von Zellschicksalen entlang der D-V Achse eines gastrulierenden Zebrafisch Embryos nicht vollkommen geklart. Als Ausgangspunkt meiner Doktorarbeit habe ich an einem ruckwarts gerichteten genetischen Screen, basierend auf Antisense Morpholino Oligonukleotiden fur spezifischen Knock-Down von Genen im Zebrafisch, teilgenommen. Als Teil eines Konsortiums mehrerer Arbeitsgruppen habe ich eine Kollektion von Morpholinos erstellt und auf Phanotypen in der Fruhentwicklung, Entwicklung der Hypophyse und der Haut untersucht. Ein Morpholino, gerichtet gegen das Gen acyl-CoA Synthetase longchain family member 4a (acsl4a), dessen Produkt im Metabolismus der langkettigen Fettsaure Arachidonsaure beteiligt ist, verursachte Defekte in der D-V Musterbildung. Im ersten Teil dieser Arbeit beschreibe ich den Phanotyp von Embryonen nach dem Knock-down von acsl4a, der auf eine essentielle Rolle von Acsl4a in der Aufrechterhaltung des Gradienten des BMP Signals wahrend der Gastrulation hindeutet. Jedoch konnte der Phanotyp nur mit einem von mehreren untersuchten Morpholinos erreicht werden. Ebenfalls ist es mir missgluckt die Defekte durch gleichzeitige Uberexpression von acsl4a, welches nicht von dem Morpholino erkannt wird, zu retten. Ausserdem habe ich weitere Komponenten des Archidonsaure Metabolismus untersucht, jedoch keine der getesteten Komponenten interferierte mit der Fruhentwicklung des Zebrafisch Embryos. Zusammengefasst bleibt die Rolle von acsl4a und seine Verbindung zum BMP-Signalweg wahrend der D-V Musterbildung des Zebrafisch Embryos ungeklart. Im zweiten Teil dieser Arbeit befasse ich mit der Frage der Festlegung von Zellschicksalen, genauer der zeitlichen Folge der zellularen Bestimmung, entlang der D-V Achse und ihrer Abhangigkeit von BMP Signalen. Entsprechen dem Konzept von Morphogenen bestimmt der stufenweise von dorsal nach ventral ansteigende BMP Gradient die verschiedenen Zellschicksale entlang der D-V Achse. Im Ektoderm wird angenommen, dass ein hoher Grad von BMP Signal epidermale Schicksale induziert, bei gleichzeitigem blockieren der neuralen Entwicklung, so dass ventrale Zellen zu Haut werden, wahrend Neuronen sich aus dem dorsalen Ektoderm, wo der Grad der BMP Signale am niedrigsten ist, entstehen. In anderen Zusammenhangen wurden BMPs als Faktoren beschrieben die die Pluripotenz von Stammzellen aufrechterhalten, dabei arbeiten sie als prinzipieller Inhibitor von Zellspezifikationsprozessen. Interessanterweise ist der Gradient von BMPs sehr dynamisch uber die Zeit, mit einer sehr breiten Expression zu einem fruhen Zeitpunkt, die wahrend der Gastrulation schrittweise auf die ventrale Seite des Embryos beschrankt wird. Deswegen habe ich mich gefragt, ob BMPs das ventrale Ektoderm in einem mehr pluripotenten Zustand halten, wahrend dorsale Zellen zu einem wesentlich fruheren Zeitpunkt spezifiziert und auf ihr endgultiges Zellschicksal festgelegt werden, passend zu dem fruheren Verlust der Expression von BMPs. Um diesen Gedanken zu uberprufen habe ich Studien zur zellularen Festlegung mit heterotopischen und heterochronischen Transplantationen von dorsalen gegen ventralen ektodermalen Zellen des Zebrafisch Embryos wahrend verschiedener Zeitpunkte der Gastrulation durchgefuhrt. Uberraschenderweise, konnte ich weder fur ventrale noch dorsale Zellen zeigen, dass sie auf ihr ursprungliches Schicksal festgelegt sind, da sie die Expression ihrer entsprechenden Markergene nach der Transplantation in eine ektopische Umgebung verlieren. Jedoch, nur ventrale Zellen waren fahig das Schicksal ihrer neuen Umgebung (dorsal) anzunehmen, wobei dorsalen Zellen in einer ektopischen ventralen Umgebung sowohl die Expression dorsaler als auch ventraler Markergene fehlt. Dies zeigt, dass ventrale ektodermale Zellen tatsachlich ihre Pluripotenz langer als dorsale Zellen behalten. Weitere Experimente mit mutanten Embryonen haben zu zeigen ob dieser Effekt Signale durch BMPs benotigt.