РЕФЕРАТ Большинство нейродегенеративных патологий связано с появлением цитотоксических олигомеров и агрегатов мутантных белков, вызывающих дисфункцию клеток мозга и их гибель. В представленной работе изучали функции белковых факторов, как способствующих образованию агрегатов, так и предотвращающих этот процесс. К таким белкам можно отнести глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (ГАФД), тканевую трансглутаминазу (тТГ) и молекулярный шаперон – белок теплового шока 70 (БТШ70). Используя технологию siРНК, мы показали, что подавление экспрессии ГАФД в модели болезни Хантингтона (БХ) вызывает снижение на 45–50% уровня агрегации мутантного хантингтина, содержащего повтор из 103 остатков глутамина, и повышение количества выживших клеток. Впервые установлено, что блокирование синтеза ГАФД снижает степень агрегации супероксиддисмутазы-1 (СОД1) с мутацией G93A в модели амиотрофического бокового склероза (АБС). Обработка клеток, имитирующих БХ и АБС, ингибитором активности ГАФД, гидроксинонненалом (ГНЕ) также снижает количество агрегирующего материала. Агрегации мутантных белков способствует также тканевая трансглутаминаза. Подавление активности этого фермента с помощью цистамина препятствует образованию агрегатов мутантной СОД1 и хантингтина. Роль БТШ70 в контроле агрегации мутантного хантингтина изучали с использованием линии клеток с индуцибельной экспрессией шаперона. Увеличивая содержание БТШ70, мы добились снижения числа и размеров растущих агрегатов мутантного хантингтина. Таким образом, модуляция функции/количества трех белков (ГАФД, трансглутаминазы и БТШ70) влияет на патогенез таких распространенных нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Хантингтона и амиотрофический боковой склероз. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА нейродегенеративные заболевания, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, шапероны, мутантные белки, агрегация. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ EGFP – усиленный зеленый флуоресцентный белок (Enhanced Green Fluorescence Protein); АБС – амиотрофический боковой склероз; БТШ – белок теплового шока; БХ – болезнь Хантингтона; ГАФД – глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа; ГНЕ – гидроксинонненал; ДСН – додецилсульфат натрия; ПААГ – полиакриламидный гель; СОД – супероксиддисмутаза; тТГ – тканевая трансглутаминаза; ФСБ – фосфатно-солевой буфер.

Экспрессия рекомбинантных антител в культурах клеток млекопитающих считается сегодня одной из важных задач иммунобиотехнологии. Альтернативный подход, позволяющий относительно быстро получать широкий репертуар функционально активных иммуноглобулинов и их фрагментов, заключается в экспрессии их в дрожжевых системах. В настоящей работе получены экспрессионные штаммы метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, секретирующие одноцепочечное каталитическое антитело человека А.17 (A.17scFv), его Fab-фрагмент (A.17Fab) и полноразмерную легкую цепь (A.17Lch). Изучена функциональная активность полученных рекомбинантных белков. Показано, что одноцепочечное антитело А.17 и его Fab-фрагмент способны специфически связывать и трансформировать фосфорорганические соединения. Модификация легкой цепи антитела фосфонатом Х только в составе полного вариабельного домена антитела свидетельствует об участии обеих цепей антитела А.17 в формировании его активного центра. Определены константы равновесия (Кдис) образования нековалентного комплекса и константы скорости первого порядка (k2) реакции ковалентной модификации полученных A.17scFv и A.17Fab n-нитрофенил-8-метил-8-азабицикло[3.2.1]фосфонатом (фосфонат Х), необратимым ингибитором сериновых гидролаз. Сравнение кинетических параметров реакции позволяет утверждать, что исследуемые белки обладают реакционной способностью, сравнимой со способностью полноразмерного и одноцепочечного антитела А.17, продуцируемых, соответственно, в клетках СНО и Escherichia coli.

Expression of recombinant antibodies in mammalian cells is one of the key problems in immuno-biotechnology. Alternatively, expression of a broad panel of antibodies and of their fragments may be effectively performed in yeast cells. We obtained expression strains of the methylotrophic yeast Pichia pastoris producing single-chain human catalytic antibody A17 (A.17scFv), Fab-fragment (A.17Fab), and full-size light chain (A.17Lch). These antibodies were characterized in terms of functional activity. The capacity to specifically bind and transform organophosphorus compounds has been demonstrated for A.17scFv and A.17Fab. The loss of activity of the antibody light chain when expressed alone indicates that the active site is formed by both heavy and light chains of the antibody. We determined the reversible constant K d and the first order constant ( k 2 ) of the reaction of the covalent modification of A.17scFv and A.17Fab by irreversible inhibitor of the serine proteases p -nitrophenyl 8-methyl-8-azobicyclo[3.2.1]phosphonate (phosphonate X). Calculated values indicate that activity of the antibodies expressed in yeast is similar to the full-size antibody A17 and to the single-chain antibody A.17 expressed in CHO and E. coli cells, respectively.

At present, neurodegenerative pathologies are the object of active research. Aggregates made of misfolded, mutant proteins causing neuronal death are the reason of the majority of such diseases. One of these illnesses is the Huntington’s disease (HD) that is provoked by expanded repeats of glutamine in N-terminal part of huntingtin. The development of the disease stems from the formation and accumulation of SDSinsoluble protein aggregates in neurons of striatum and cerebral cortex. The aggregates are formed by tissue transglutaminase, which catalyzes the ligation of glutamine residues of mutant huntingtin to lysines of other cellular proteins, such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). The results of our experiments proved that GAPDH is implicated in the formation of SDS-insoluble aggregates because the factors tightly binding the enzyme reduce both the size and amount of aggregates in the cells over-expressing the gene of mutant huntingtin with Q103 repeat. Conversely, the addition of pure GAPDH to ex vivo system of Q103 aggregate formation significantly increased the amount of aggregating Q103. To explore the mechanism of anti-aggregate activity of Hsp70 in HD model we generated human neuroblastoma cell line with metal-dependent expression of Hsp70. The elevation of the Hsp70 level lead to the reduction of both number and size of aggregates. These data were confirmed by using ex-vivo system of aggregate formation: the addition of pure Hsp70 elevated the amount of soluble polyglutamine-containing protein. Using the method of immunoprecipitation we showed that Hsp70 was able to bind GAPDH in dose-dependent manner: the more Hsp70, the lesser content of GAPDH in insoluble polyglutamine aggregates and the lower amount of the latter. It is concluded that a novel mechanism exists, through which Hsp70 sequesters GAPDH from the control of transglutaminase and by this diminishes cell mortality from cytotoxicity of the aggregates.