Chimeric gp130 receptors were produced to study the role of three fibronectin type III-like domains in activation of gp130 receptor machinery. The ligand-induced dimerization of gp130 was sufficient to trigger STAT3 signaling pathway. These findings can be used as the basis in designing novel therapeutic gp130 inhibitors.

Одной из важнейших мишеней современных фармакологических препаратов является система поверхностных клеточных рецепторов. Взаимодействия рецепторов с их лигандами и корецепторами вовлечены в процессы передачи сигнала в клетку, они играют исключительно важную роль в жизни любой клетки. Взаимодействие рецептора и его лиганда с последующей передачей сигнала путем активации рецептора зачастую практически невозможно изучать в силу методических ограничений воспроизведения условий подобных взаимодействий на поверхности клетки. В связи с этим разработка новых фармакологических препаратов, действие которых направлено на функционирование рецепторов и их акцепторных доменов, требует создания эффективных скрининговых систем, максимально воспроизводящих условия, необходимые для проявления биологической активности исследуемого терапевтического агента. Для решения данной задачи нами предложена универсальная платформа, позволяющая изучать взаимодействия рецепторов и их лигандов в формате одной клетки непосредственно на поверхности клеточной мембраны. С этой целью был получен ряд генетических конструкций, на основе химерных антигенных рецепторов, способных активировать репортерные Т-клетки. В представленной работе доказана применимость данной системы для анализа взаимодействия рецептора с растворимым лигандом, а также лигандом, заякоренным на поверхностной мембране клетки. На примере ex vivo взаимодействия вариабельного домена анти-myc-антитела в составе химерного рецептора и пептида myc, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина, заякоренного мембране клетки, показано, что химерный рецептор взаимодействует с myc-эпитопом, что приводит к активации Т-клеток. Добавлением лиганда во внеклеточную среду показана применимость метода для анализа взаимодействий трансмембранно заякоренных рецепторов с растворимыми лигандами. В дальнейшем, заменив антитело и антиген другой парой акцептор-лиганд, можно детектировать взаимодействие данных молекул непосредственно на поверхности клетки. Полученные доказательства эффективности работы предложенной платформы позволят осуществлять широкомасштабные скрининговые исследования фармакологических препаратов на мембранах клеток ex vivo.

Membrane-associated intrareceptoral and ligand receptor interactions are involved in intracellular signalling. Community of surface receptors represents extremely important target for modern therapeutics. Their developing evidently requires elaboration of effective screening platforms. In this study we suggest universal platform designed to test receptor ligand interaction in a "single cell" mode. For this purpose we created a DNA vector utilizing modular structure of chimeric receptors. The whole platform was tested using myc peptide- anti-myc antibody counterpart, which is directly linked with regulation of cancer cell development. In this study we succeeded to obtain Jurkat cells transduced with cDNA coding for chimeric antigenic receptor containing extracellular scFv of the myc-specific antibody and human Fc fused with transmembrane anchor. We showed that chimeric receptor interacts with myc peptide in a "single cell" mode, which in turn leads to the activation of T cells. We further suggest that designed system can be used for any other receptor ligand pair to detect their interaction directly on the cell surface. Elaborated platform may be applied for the wide-range screening of the agents with therapeutic potential on the cell membrane ex vivo.

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory demyelinating disease of the central nervous system that primarily affects young and middle-aged people. It is widely accepted that B lymphocyte activation is required for MS progression. Despite the fact that the exact triggering mechanisms of MS remain enigmatic, one may suggest that MS can be induced by viral or bacterial infection in combination with specific genetic and environmental factors. Using deep sequencing and functional selection methodologies we characterized clones of poly- and cross-reactive antibodies that are capable of simultaneous recognition of viral proteins and autoantigens. The latter, in turn, possibly may trigger MS progression through molecular mimicry. It was identified that two cross-reactive antigens are probably recognized by light or heavy chains individually. According to the high structural homology between selected autoantibodies and a number of various antiviral IgGs, we suggest that a wide range of pathogens, instead of a single virus, be regarded as possible triggers of MS.

Экспрессия рекомбинантных антител в культурах клеток млекопитающих считается сегодня одной из важных задач иммунобиотехнологии. Альтернативный подход, позволяющий относительно быстро получать широкий репертуар функционально активных иммуноглобулинов и их фрагментов, заключается в экспрессии их в дрожжевых системах. В настоящей работе получены экспрессионные штаммы метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, секретирующие одноцепочечное каталитическое антитело человека А.17 (A.17scFv), его Fab-фрагмент (A.17Fab) и полноразмерную легкую цепь (A.17Lch). Изучена функциональная активность полученных рекомбинантных белков. Показано, что одноцепочечное антитело А.17 и его Fab-фрагмент способны специфически связывать и трансформировать фосфорорганические соединения. Модификация легкой цепи антитела фосфонатом Х только в составе полного вариабельного домена антитела свидетельствует об участии обеих цепей антитела А.17 в формировании его активного центра. Определены константы равновесия (Кдис) образования нековалентного комплекса и константы скорости первого порядка (k2) реакции ковалентной модификации полученных A.17scFv и A.17Fab n-нитрофенил-8-метил-8-азабицикло[3.2.1]фосфонатом (фосфонат Х), необратимым ингибитором сериновых гидролаз. Сравнение кинетических параметров реакции позволяет утверждать, что исследуемые белки обладают реакционной способностью, сравнимой со способностью полноразмерного и одноцепочечного антитела А.17, продуцируемых, соответственно, в клетках СНО и Escherichia coli.

Expression of recombinant antibodies in mammalian cells is one of the key problems in immuno-biotechnology. Alternatively, expression of a broad panel of antibodies and of their fragments may be effectively performed in yeast cells. We obtained expression strains of the methylotrophic yeast Pichia pastoris producing single-chain human catalytic antibody A17 (A.17scFv), Fab-fragment (A.17Fab), and full-size light chain (A.17Lch). These antibodies were characterized in terms of functional activity. The capacity to specifically bind and transform organophosphorus compounds has been demonstrated for A.17scFv and A.17Fab. The loss of activity of the antibody light chain when expressed alone indicates that the active site is formed by both heavy and light chains of the antibody. We determined the reversible constant K d and the first order constant ( k 2 ) of the reaction of the covalent modification of A.17scFv and A.17Fab by irreversible inhibitor of the serine proteases p -nitrophenyl 8-methyl-8-azobicyclo[3.2.1]phosphonate (phosphonate X). Calculated values indicate that activity of the antibodies expressed in yeast is similar to the full-size antibody A17 and to the single-chain antibody A.17 expressed in CHO and E. coli cells, respectively.