Aflatoxin B1 (AFB1)-induced hepatotoxicity is a common toxic disease in poultry farming. However, there is currently a lack of effective pharmaceutical interventions for treating AFB1. Astaxanthin (AST), a natural carotenoid, exhibits potent antioxidant and immune-enhancing properties. In this study, the effect of AST on AFB1-induced hepatotoxicity was determined using chick embryo liver cells (CELs). The CCK-8 assay results showed that AST significantly attenuated the decrease in viability of CEL cells induced by AFB1, and reduced the activity of the enzymes GOT, GPT, and ALP (P < 0.01). Moreover, AST significantly reduced the AFB1-induced ROS, attenuated the increase in malondialdehyde (MDA), and attenuated the decrease in superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) (P < 0.01). Further, the western blot results showed that AST activated the nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2) signaling pathway, decreased the expression of kelch-1ike ECH-associated protein l (Keap-1), and increased the expression of Nrf2 and its downstream proteins glutamate-cysteine ligase catalytic subunit(GCLC), glutamate-cysteine ligase modifier subunit (GCLM), heme oxygenase-1(HO-1) and NAD(P)H: quinone oxidoreductase (NQO1)(P < 0.01). Furthermore, AST inhibited the expression of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) induced by AFB1 (P < 0.01). Western blot results showed that AST inhibited the nuclear factor-κB (NF-κB) pathway induced by AFB1 by reducing the phosphorylation of the P65 and IκB proteins (P < 0.01). In summary, these findings suggested that AST can be used as a candidate pharmaceutical to protect against AFB1-induced hepatotoxicity. AST protected the liver cells by effectively attenuating AFB1-induced oxidative stress and the inflammatory response.

To investigate the effect and potential mechanism of ethyl acetate extracts from Inonotus obliquus in inhibiting the replicaton of prion, multiple methods were utilized. Using CCK-8 assay to evaluate the cytotoxicity of dichloromethane extracts, ethyl acetate extracts, n-butanol extracts and obtain the maximal concentrations of various extracts. Prion-infected cell model SMB-S15 were treated with three extracts at safe concentrations (0.1×2−14 mg/mL~0.1×2−8 mg/mL) and the inhibitory effects of different extracts on prion replication were analyzed by PrP-specific Western blots. The expression of reactive oxygen species, hydrogen peroxide and related antioxidant factors were measured in SMB-S15 cells treated with ethyl acetate extracts. The results showed that the maximum safe concentrations of dichloromethane extracts, ethyl acetate extracts and n-butanol extracts was 0.1×2−8 mg/mL. Prion replication was significantly inhibited in SMB-S15 cells treated with ethyl acetate extracts at this concentration of 0.1×2−8 mg/mL for 3 days (P<0.01). While there were no inhibitory effects on prion replication in SMB-S15 cells treated with dichloromethane extracts and n-butanol extracts. In addition, ethyl acetate extracts decreased the levels of reactive oxygen species and hydrogen peroxide, increased the expression level of HO-1, GCLC, total glutathione and enhanced the activity of SOD, with statistical difference. These data suggested that the ethyl acetate extracts from Inonotus obliquus could inhibit prion replication in vitro which might be related to the activation of Nrf2 signaling pathway.

研究AFB1致肉鸡急性肝损伤模型的建立,为挑选保肝药物和肝损伤机制的研究建立基础.试验肉鸡随机分为对照组,AFB1低、中、高组,连续喂养7 d.禁食24 h后,心脏采血检测肝功能指标,H&E染色观察肝脏病理学变化,检测MDA、CAT和SOD含量,Western Blot分析Nrf2,HO-1蛋白表达水平.结果表明,同对照比,AFB1组肝脏病理切片均有不同程度的肝损伤变化.随AFB1的剂量增加,AST、ALT、ALP和TBIL的表达逐渐升高,MDA含量逐渐升高,CAT和SOD含量随之降低,Nrf2,HO-1的蛋白含量下降.结果证明连续喂养肉鸡7 d 5 mg·kg-1的AFB1饲料可以建成急性肝损伤模型.

优化桦褐孔菌乙醇粗提物提取工艺并初步探究其对朊病毒复制的影响.采用醇提方法,利用正交试验方法,确定最佳提取工艺.使用CCK-8试剂盒对桦褐孔菌乙醇粗提物处理细胞的安全性进行评价,确定其安全质量浓度;根据安全性评价结果,使用蛋白免疫印记(Western blot)方法检测桦褐孔菌乙醇粗提物对朊病毒复制的影响;通过测定过氧化氢及抗氧化因子等对桦褐孔菌乙醇粗提物的抗氧化活性进行研究.桦褐孔菌乙醇粗提物的最佳提取工艺为:料液比(桦褐孔菌生粉:乙醇)1:10(g/mL),乙醇体积分数75％,提取时间2 h,提取温度80℃,在此条件下,得率为6.32％.桦褐孔菌乙醇粗提物的最大安全质量浓度为6.25×10-4 mg/mL;在此浓度下,处理细胞24 h后,桦褐孔菌乙醇粗提物对朊病毒的复制有抑制作用(p<0.01),可减少H2O2的含量,增加SOD和抗氧化因子GCLM、GCLC的含量,且具有统计学意义.本试验表明桦褐孔菌乙醇粗提物对朊病毒的复制具有抑制作用,且这种作用可能与其抗氧化活性有关.

研究旨在探讨顺铂在诱导鼠肾小管上皮细胞(mRTEC)损伤过程中,香叶木素对细胞的保护作用和可能的机制.在对mRTEC细胞系培养48 h后,MTT试验筛选出顺铂致mRTEC损伤的半数致死剂量,确定香叶木素的最佳剂量,观察mRTEC损伤程度.在筛选出香叶木素的最佳浓度后,给予不同浓度的香叶木素进行治疗,检测细胞存活率,ROS水平以及检测细胞凋亡水平.此外,通过Western Blot检验Nrf2抗氧化信号通路,并且对不同的癌细胞系施用香叶木素,检验其抗癌效果.结果表明,香叶木素可以显著地降低顺铂诱导的mRTRC细胞凋亡及ROS产生,且这种作用是通过Nrf2抗氧化信号通路发挥的作用.此外,香叶木素联合顺铂能够有效抑制癌细胞的生长,这为临床上治疗顺铂治疗癌症过程当中造成的肾损伤提供了依据.

沉香(Agarwood)是一种名贵中药和天然香料,倍半萜是其主要的特征性成分之一.法呢基焦磷酸合酶FPS (Farnesyl pyrophosphate synthase)是萜类化合物生物合成的关键酶之一.本研究根据转录组数据在白木香中克隆一个新的法呢基焦磷酸合酶基因AsFPS2,该基因全长1432 bp,包含一个1287 bp的完整开放阅读框,编码428个氨基酸.AsFPS2具有典型的植物法呢基焦磷酸合酶结构特征包含5个保守的结构域和2个保守的DDXXD基序,与小果沉香(Aquilaria microcarpa)中的法呢基二磷酸合酶蛋白具有86.55％的同源性.AsFPS2基因编码区包含12个外显子和11个内含子.AsFPS2启动子区含有多个应答激素和胁迫的响应元件.表达分析显示,伤害、茉莉酸甲酯和乙烯利处理能显著诱导AsFPS2的表达.研究结果说明AsFPS2可能参与了沉香倍半萜的生物合成,为进一步揭示其在倍半萜积累和沉香形成中的作用打下基础.

目前由于缺失特异性的商品化抗体,不同tau异构体在中枢神经系统疾病中,尤其在朊病毒病中的变化鲜有报道.本研究利用杂交瘤技术制备了抗tau蛋白外显子2和10的单克隆抗体,同时对制备抗体的灵敏度、特异性、免疫反应亲和力、种属反应性等方面进行了评价,随后对制备的抗体应用范围进行了摸索.结果 显示,制备的四株单抗特异性高、灵敏度好,尤其可以识别小鼠脑组织中的tau蛋白.制备的四株单抗可用于间接细胞免疫荧光实验和多种感染神经细胞和感染小鼠模型脑组织的蛋白免疫印迹和免疫组织化学实验.综上,本研究制备了四株tau外显子特异性单抗,上述单抗具有较广的应用范围,将成为神经退行性疾病中tau蛋白检测的有力工具.

对柬埔寨野生柯拉斯那(Aquilaria crassna)沉香的化学成分和生物活性进行研究.实验采用多种柱色谱法对该沉香进行分离纯化;通过现代波普技术结合化合物理化性质对所得单体化合物进行结构鉴定,从柬埔寨野生柯拉斯那沉香共分离出12个化合物,分别鉴定为7α-H-9 (10)-ene-11,12-epoxy-8-oxoeremophilane(1)、7β-H-9(10)-ene-11,12-epoxy-8-oxoeremophilane(2)、neopetasane(eremophila-9,11-dien-8-one)(3)、jinkoh-eremol(4)、(rel)-4β,5β,7β-eremophil-9-en-12,8β-olide(5)、诺卡酮(6)、11-hydroxy-valenc-1 (10)-en-2-one (7)、(7S,9S,10S)-(+)-9-hydroxy-selina-4,11-dien-14-al (8)、5-羟基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙烯基]色酮(9)、5-羟基-6甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮(10)、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮(11)、5-羟基-6甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮(12).其中化合物1～8为倍半萜类化合物,化合物9为2-(2-苯乙烯基)色酮类化合物,化合物10～12为2-(2-苯乙基)色酮类化合物.且化合物2～11均是首次从柯拉斯那沉香分离.采用Ellman比色法对单体化合物进行乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定,活性测定结果表明化合物1～3和12具有乙酰胆碱酯酶抑制活性.

为了探究感染朊病毒后含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein,VCP)的变化情况及其对内质网相关蛋白降解(endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD)信号通路的影响,试验采用细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR等方法分析朊病毒感染的细胞系中VCP及其基因表达情况;West-ern-blot方法检测朊病毒感染的细胞、小鼠脑组织中VCP含量变化,白藜芦醇动态清除朊蛋白(prion protein,PrP)的SMB-S15细胞、PrP重组质粒pcDNA3.1(+)-Cyto-PrP瞬时转染的293T细胞、蛋白酶体抑制剂MG-132处理的SMB-S15细胞中VCP的表达情况,以及朊病毒感染的细胞系中ERAD信号通路关键因子的表达水平.结果表明:与对照组相比,在朊病毒感染的细胞中VCP及基因表达水平差异不显著(P＞0.05);在终末期小鼠脑组织中VCP表达水平差异不显著(P＞0.05);经动态清除PrP、细胞内聚集PrP以及MG-132处理后,VCP表达水平均差异不显著(P＞0.05);在朊病毒感染细胞中ERAD信号通路关键因子calnexin表达水平极显著升高(P＜0.01),OS-9表达水平显著高于对照SMB-PS细胞(P＜0.05).说明感染朊病毒后VCP变化不显著,calnexin和OS-9发生明显变化,提示ERAD信号通路可能会参与朊病毒的复制过程.

为了探讨大黄酚对免疫功能低下小鼠的免疫保护作用,建立了环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠模型。分别通过称重检测小鼠脾脏指数和胸腺指数;MTT法检测模型小鼠T、B淋巴细胞增殖情况;绵羊红细胞的溶血测定法检测血清溶血素水平和抗体细胞生成数;ELISA方法检测血清中细胞因子IL-2、IL-4的水平。结果表明大黄酚能够通过增强T、B淋巴细胞增殖,提高免疫抑制小鼠的脾脏指数和胸腺指数,上调血清中IL-2和IL-4水平,促进溶血素水平升高和抗体细胞生成。说明大黄酚对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠有显著的免疫保护作用。

通过对提取纯化后的原料药进行全面的性质考察,针对其缺陷,对稀释剂种类进行了筛选及处方优化.在香菇多糖颗粒剂处方优化过程中,考察了两种稀释剂单独与混合使用时不同配比对制剂的影响,优化出香菇多糖颗粒剂最优处方原料药∶甘露醇∶乳糖=1∶1.5∶0.5,制备出的香菇多糖颗粒剂经质量检查符合药典规定,质量合格,为制药企业生产香菇多糖颗粒剂提供了理论依据.

朊病毒病是一类具有致死性、传染性和进行性的神经退行性疾病.目前研究发现许多因子都参与了疾病的发生发展过程,包括细胞因子、激酶和一些离子,其中钙离子及相关激酶在朊病毒病致病机制中的研究报道较少,为了探究朊病毒感染中钙调蛋白相关下游激酶的含量变化情况,本研究利用多种检测方法对朊病毒感染细胞系及小鼠脑组织进行了分析.结果显示朊病毒感染后,钙离子和钙调蛋白(CaM)的表达水平升高,下游Ca2/CaM复合物依赖性激酶CaMKIα和CaMKIV表达水平下降,同时这些激酶的上游激酶CaMKKα含量降低,提示朊病毒感染后神经元中钙离子和相关激酶稳态失衡,这种异常变化很可能影响下游多种转录因子合成,这些结果为解释朊病毒感染后神经元大量丢失提供了科学依据.

为探究苍术、川乌等12种中草药的体外抗弓形虫感染效果,经制备水煎剂、测取吸光值和干重,评价其对Vero细胞的毒害作用;合成引物,优化real-time PCR条件,用9种回归模型拟合不同感染孔内弓形虫数目,求得24孔板单孔适合感染量;用适合数目RH速殖子与适当浓度水煎剂作用6h、12h、1d、2d和3d,real-time PCR法定量水煎剂的体外抗弓形虫效果.结果显示,所得水煎剂的吸光值大小与干重间无线性关系,高浓度水煎剂不利于Vero细胞生长.抗感染结果显示,槟榔、白薇、青蒿、蒲公英和柴胡作用3d时弓形虫速殖子数均较空白组显著降低(P＜0.05),其他水煎剂和时间点则作用不明显(P＞0.05),表明槟榔、白薇、青蒿、蒲公英和柴胡可抑制弓形虫体外增殖,能用作研发抗弓形虫感染特效药的重要研究对象.

目的 运用PCR对刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH、PRU、VEG株速殖子和HFF、Vero细胞系以及SPF级昆明鼠脑组织所得DNA样品进行特异性扩增,鉴定并筛选出适合用作弓形虫实时荧光定量PCR(qPCR)分析的内参引物. 方法 体外培养并无菌收集HFF、Vero细胞系及弓形虫RH、PRU、VEG株速殖子,SPF级昆明鼠经颈椎脱臼处死无菌采集脑组织,并提取基因组DNA.合成弓形虫MIC6基因(ToxoDB:TGME49_218520)特异性引物P1/P2,经PCR扩增鉴定所得样品是否含有弓形虫DNA成分,设空白对照.依照ToxoDB数据库弓形虫ACT1基因参考序列(ToxoDB:TGME49_209030)设计引物,经NCBI Primer-BLAST比对分析后进行合成特异性引物P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10和P11/P12,预期片段大小均为121 bp.以弓形虫RHDNA为模板,采用梯度PCR优化ACT1基因内参引物的退火温度.运用已优化条件对待检DNA样品进行PCR特异性扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,鉴定出适合用于弓形虫qPCR定量分析的内参引物. 结果 PCR扩增弓形虫RH、PRU和VEG株DNA.MIC6基因时均出现一条长度约为1050 bp的条带,且空白对照和其他样品无此条带,与预期结果一致,表明所得DNA样品可用.优化退火温度时发现,除P7/P8外其他引物均不受退火温度影响,56℃适合用于PCR或qPCR扩增ACT1基因目的片段的退火温度.以56℃为退火温度对待检DNA进行检测时发现,扩增弓形虫阳性样品时所有引物均能产生1条大小约为121 bp的条带,空白对照无此条带,与预期结果一致.此外,引物P7/P8、P9/P10扩增Vero细胞系和引物P3/P4、P5/P6、P9/P10扩增昆明鼠脑组织DNA样品时均有杂带出现,且有杂带大小约为121 bp;引物P11/P12扩增弓形虫阴性DNA样品时均无杂带出现. 结论 引物P11(5 ′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′)和P12(5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)适合分别用作弓形虫qPCR定量分析时扩增ACT1靶基因的上游和下游引物.

建立一种灵敏、稳定的检测血液中虫草素及其代谢物的高效液相色谱方法,并报告采用该方法进行药代动力学的初步研究.大鼠全血0.5 mL,加入甲醇1mL,涡旋振荡2 min,超声10 min,4℃条件下10 000 r·min-1离心15 min,取上清室温条件下氮气吹干,用体积分数为0.06的乙腈溶液0.5 mL复溶,4℃条件下15 000 r·min-1离心10 min,取上清过0.22μm微孔滤膜进行HPLC检测;色谱条件为Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈冰,6:94(V/V),流速0.8 mL· min-1,柱温30℃,紫外检测波长259 nm.虫草素在0.1～5.0 μg· mL-1浓度范围内线性关系良好,线性回归方程为Y=10.97X-11.73,相关系数r=0.998 0血液样品中虫草素在高、中、低浓度的回收率分别为99.63％、95.37％和93.26％.全血中虫草素的药物代谢动力学初步研究的结果为给药后10～120 min内均未检测到虫草素原型,相同色谱条件下,保留时间为8.8 min左右检测到一虫草素的未知代谢物,且该物质在30 min时含量最高,随后逐渐降低.对该产物富集后通过质谱检测得未知代谢物分子量为252 M.该方法灵敏度高,重现性好,可用于大鼠全血中虫草素的代谢研究;研究结果同时表明,虫草素在大鼠体内代谢速度快,按40 mg·kg-1剂量灌胃,即使灌胃给药后10 min也未检测到虫草素原型.

为了探究朊病毒感染中钙调蛋白信号通路的变化情况,对羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中钙调蛋白的表达变化、分布特点及下游相关激酶及调控蛋白的表达变化情况进行了检测.结果显示在羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑组织中钙调蛋白的表达水平较正常仓鼠明显上调.钙调蛋白下游相关激酶及它们的磷酸化形式均明显下调,同时CaMKs的下游调控蛋白——CREB也呈下调趋势,而靶蛋白——BDNF的表达则明显受到抑制.研究提示在朊病毒感染中很可能存在某种原因影响了钙调蛋白的功能.

朊蛋白因在一类称为朊病毒病的神经退行性疾病中扮演着重要角色而得到了广泛研究.目前,虽然在病理和传播方面已对这类疾病开展了大量研究,但致病的分子机制仍未阐明.那么,如何理解朊病毒病中朊蛋白致病的分子机制呢?从朊蛋白的生理功能中可以获得哪些启发呢?伴随着这些问题,相信深入了解朊蛋白的生理功能可揭示其参与朊病毒病的致病过程.朊蛋白已被证明参与了许多生物学过程,如神经突触生成、神经内稳态、细胞信号转导、细胞粘附和抗应激的保护性作用.朊蛋白的这种多能性使研究人员无法准确了解朊蛋白的分子功能.将努力阐明朊蛋白在中枢神经系统和外周神经系统中的生理作用.

蛋白酶体广泛存在于真核细胞的胞质和胞核中,具有多种催化功能,可选择性降解胞内半衰期短和错误折叠的新生蛋白、应激损伤蛋白、突变的结构功能蛋白及细胞自身需要清除的其他特定蛋白,与基因转录、DNA损伤修复、细胞生长、凋亡和抗原递呈等重要生命活动紧密相关.真核细胞蛋白酶体作用重要,调控方式多样,因此,将就其构成、生物学功能及其调控机制进行综述.

为了建立沙门氏菌的快速、可视化检测方法,根据核酸横流生物传感器(lateral flow nucleic acid biosensor,LFNAB)的检测原理,对沙门氏菌核酸扩增产物进行改良.以沙门氏菌DNA为模板,通过PCR技术和DNA酶的介导,将生物素-三磷酸碱基脱氧核苷酸(Biotin-dNTP)引入DNA链中,使高拷贝的DNA双链携带一定含量的生物素分子.在DNA链上,由于上游引物修饰的异硫氰酸荧光素抗原(FAM)和dNTP上携带的生物素分子(Biotin),导致新产生的PCR产物可采用LFNAB进行检测.实验证明,Biotin-dUTP最佳的使用量是脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dTTP)和Biotin-dUTP混合物的总量的5％,且LFNAB的样品检验效果清晰直观、肉眼可见,能够检测出101 CFU·mL-1浓度的沙门氏菌.

In order to separate a type of antifungal protein from Bacillus subtilis Zl-2,and investigate its antifungal effects,we use the crude protein of Zl-2 to precipitate with ammonium sulfate ((NH4) 2SO4) . The stability of antagonistic protein under different conditions,such as temperature,pH value,ultraviolet and protease,was investigated to understand the antifungal effects mentioned above. The antifungal activity was measured by Fusarium graminearum as an indicator. The results showed that the antifungal protein exhibited a high stability towards the temperature and ultraviolet,but sensitive to pH value and protease. This Zl-2 protein displayed strong inhibition on the growth of Fusarium graminearum mycelium, which led to mycelium malformation,bottom inflation; and inhibited the spore germination. This research discovered that antifungal protein of Bacillus subtilis Zl-2 showed high stability and strong antifungal ability. Importantly,this protein displayed different characteristics,compared with currently-known metabolites obtained from Bacillus subtilis,suggesting that B. subtilis Zl-2 had potential to be a novel antifungal protein.