C использованием методов световой микроскопии и цитофотометрии ДНК проведен сравнительный анализ структурной организации каллусов гибридной линии ячменя Дуэт ? Биос, выращенных в стандартных условиях культивирования и на средах, содержащих ионы алюминия (20 и 40 мг/л). В морфогенных каллусах, растущих на среде без алюминия, идентифицировано три основных типа клеток: меристематические, дифференцированные и гибнущие. Меристематические клетки формируют морфогенные зоны, характерным признаком дифференцированных клеток является прогрессирующее накопление вакуолей с запасными веществами. В каллусах, выживающих в присутствии алюминия, отсутствуют структурно обособленные зоны меристематических клеток, резко снижается количество дифференцированных клеток с запасными веществами и возрастает количество гибнущих клеток. По данным цитофотометрии изменение морфологического статуса устойчивых каллусов сопровождается частичным подавлением пролиферации, накоплением клеток в постсинтетической фазе клеточного цикла и полиплоидизацией, по-видимому, вызванной эндоредупликацией ДНК. Принципиально важно, что устойчивые к токсическому действию алюминия каллусы обладают высокой способностью к регенерации: доля морфогенетически активных каллусов, выживших в среде с алюминием (40 мг/л) примерно в 5 раз превосходит долю морфогенных каллусов в контроле. Для выявления клеточных мишеней токсического действия алюминия в сформированных тканях изучены корешки ризогенных каллусов. С этой целью использовали каллусы, полученные от растений, толерантных к токсическому действию алюминия (сорт Купец), чувствительной линия 999-93 и полученной методом клеточной селекции линии, устойчивой к действию алюминия линия 917-1. Оказалось, что в растущих корнях каллусов, полученных от неустойчивых линий, алюминий индуцирует гибель дифференцированных клеток эпидермиса и проводящей системы, тогда как недифференцированные клетки меристемы остаются интактными. В противоположность этому ризогенные каллусы, полученные от устойчивых форм, дают нормальные корешки. Это наблюдение имеет важное прогностическое значение, так как позволяет отбирать устойчивые к алюминию регенеранты на ранних этапах клеточной селекции. Полученные данные позволяют высказать предположение, что появление устойчивых линий обусловлено, по-видимому, сомаклональной изменчивостью, индуцированной высокими концентрациями селективного агента. Такого рода изменчивость возникает в системе in vitro в условиях стресса, в результате активации таких эпигенетических факторов, как, например, метилирование ДНК или ацетилирование белков хроматина.

В работе проведен морфологический и цитоэмбриологический анализ растений томата, трансформированных генами, кодирующими хитинсвязывающие белки из Amaranthus caudatus L. (ac) и A. retroflexus L. (RS-intron-Shir), а также гевеиноподобные антимикробные пептиды из Stellaria media L. (amp2). Полученные трансгенные линии были адаптированы к почвенным условиям и выращены в защищенном грунте. Анализ трансгенных растений поколения Т0 выявил линии, фенотипически не отличающиеся от растений дикого типа, и три линии (по одной линии с каждым из вышеперечисленных генов), которые имели существенные нарушения в дифференцировке цветоносных побегов, строении цветков и плодов. Продемонстрировано сохранение нарушений в развитии генеративных органов в 6 вегетативных поколениях. Показано, что у трансгенных растений с вегетативно наследуемыми аномалиями наблюдаются нарушения в формировании мужского гаметофита, отсутствие нормального оплодотворения и, как следствие, развитие партенокарпических плодов. Детальный анализ растущих семяпочек аномальных трансгенных линий показал, что на месте неоплодотворенного зародышевого мешка формируется и разрастается замещающая ткань, по структуре отличающаяся как от зародышевой, так и от эндоспермальной ткани нормальной семяпочки. Формирование замещающей ткани происходит в результате продолжающейся пролиферации клеток эндотелия, утративших способность к нормальной дифференцировке. Конечным этапом развития замещающей ткани является ее гибель, сопровождающаяся лизисом клеток. Методом ОТ-ПЦР экспрессия целевых генов была подтверждена у всех трех линий с аномальным фенотипом, а также у ряда линий, фенотипически не отличающихся от нетрансформированного контроля. Это означает, что нарушения органов генеративной сферы у трансформированных растений не зависят от экспрессии привнесенных в геном томата гетерологичных генов. Обсуждается, что причиной возникновения нарушений у трансгенных растений является прямое или опосредованное влияние агробактериальной трансформации на изменение экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы и контролирующих включение каскада генов, необходимых для нормального развития растений.

После гипотонической обработки и последующего возврата в изотонические условия в нуклеоплазме культивируемых клеток формируются многочисленные глобулярные тельца – интерфазные проядрышки, роль которых в восстановлении структуры ядрышка детально не изучена. Показано, что интерфазные проядрышки обладают ограниченной подвижностью внутри ядра. Методом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания продемонстрировано, что мажорный ядрышковый белок В23 не связан с проядрышками стабильно, а обменивается между проядрышками и окружающей нуклеоплазмой. По мере восстановления структуры ядрышка В23 постепенно в нем накапливается, что сопровождается исчезновением проядрышек.

AIM:Detection of duration of existence of Yersinia enterocolitica in substrates ofagro complex and formation of biofilms by causative agent during artificial semination of forage and meat products.MATERIALS AND METHODS:Y. enterocolitica 09 strain and its rifampicin-resistant (Rmr) mutant were used. Microbial landscape of samples was studied by seeding on selective media (HiMedia), biochemical properties of isolates were controlled on API test-systems (Bio-Merieux). The presence ofyopA gene localized on virulence plasmid pCad was determined in PCR. Vital staining of biofilms was carried out by Live/Dead stain (Invitrogen, USA). Visualization of the data was registered by using GMS-510 (USA) microscope with digital camera and Skope Photo software (USA). Formation ofyersinia bacterial biofilms was confirmed by using scanning electron microscope (SEM) JSM6380 (Japan).RESULTS:Prolonged duration of existence of Y. enterocolitica in substrates of agro complex with conservation of pCad virulence plasmid by causative agent was detected. SEM demonstrated stages of biofilm formation during artificial semination of animal forage, meat products and materials of food equipment in a wide range of temperatures from 10 to 30 degrees C, and vital stain detected viable yersinia in mature biofilms.CONCLUSION:Agro complexes are a variant oftechnogenic foci where ecological conditions for prolonged existence of sapronosis are formed.

В работе изучена динамика изменений структуры хроматина на различных стадиях дифференцировки сперматид человека. Показано, что в ядрах ранних сперматид хроматин полностью декомпактизован, его структурной единицей является фибрилла толщиной около 8 нм. На начальных стадиях дифференцировки эта “элементарная” фибрилла является преобладающей структурой в ядрах, а на последующих этапах она постепенно замещается крупными глобулярными комплексами диаметром около 60 нм. В дальнейшем глобулы ассоциируют в фибриллярные структуры, толщина которых уменьшается до 30–40 нм. На всех стадиях дифференцировки, кроме конечных, глобулярно-фибриллярные комплексы представляют собой центры ассоциации элементарных фибрилл. Процесс конденсации хроматина имеет векторный характер – он направлен от апикальной зоны ядра к базальной. В зрелых сперматидах преобладающим компонентом являются фибриллы толщиной около 40 нм, тонкие фибриллы практически отсутствуют. По своей структурной организации ядра зрелых сперматид полностью соответствуют ядрам сперматозоидов с “незрелым” хроматином, которые в небольшом количестве обнаруживаются в эякуляте здоровых доноров и могут преобладать над нормальными клетками при паталогиях спермиогенеза. Причина такой остановки дифференцировки остается непонятной. Возможно, в части сперматид блокируется формирование межмолекулярных дисульфидных связей, которые необходимы для завершающей фазы компактизации генома. Полученные результаты обсуждаются в связи с известными моделями организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека.

Conformational changes in chromatin structure are nowadays the object of intensive research due to its importance for proper regulation of intranuclear processes. The fine structure of chromatin within the DNA replication sites was studied in in situ fixed cells and cells permebilized by low ionic strength solutions in the presence of divalent cations. The latter method provides visualization of higher level chromatin structures such as globular chromomeres and chromonema fibres. Nascent DNA was detected immunochemically using anti-BrdU antibodies on the surface of ultrathin sections prepared from Epon-embedded material. It was shown that newly replicated DNA preferentially localized within the zones filled with globular and fibrillar elements with characteristic diameter of 30 nm, and not in chromonema fibres, while after replication had been completed DNA became embedded into as thick as 60-80 nm chromonema elements. The results obtained are discussed in the context of conception of hierarchical folding of chromatin fibers.

A method of nuclear matrix and chromosomal scaffold preparation from cultured animal cells was developed. After the high-salt extraction, interphase and mitotic cells were not detached from the coverslips that enabled us to analyse the nuclear matrix and chromosomal scaffold in cells at all mitotic phases. Morphological methods (phase contrast microscopy and electron microscopy of ultrathin sections) did not reveal any structures that could be identified as a chromosomal scaffold. However, after staining with antibodies to XCAP-E and topoisomerase IIalpha some structures were revealed in metaphase cells having both localization and morphology of a chromosomal scaffold. The cell residuals were not stained with antibodies to XCAP-E and topoisomerase IIalpha, if the nuclear matrix and chromosomal scaffold were destabilized by addition of beta-mercaptoethanol.

In the present work we have studied the distribution of some proteins participating in the nuclear envelope assembly (lamins A/C, B and LAP2 alpha) in mitotic cells and after hypotonic treatment with 15% Hank's solution. In untreated cells, these proteins are localized in the nuclei of interphase cells migrate to the cytoplasm during mitosis. Hypotonic treatment of interphase, prophase and telophase cells does not lead to considerable relocalization of lamins A/C and B. However, unlike normal mitosis, in prometaphase and metaphase cells their chromosomes acquire affinity to lamins and LAP2 alpha. Comparative analysis of lamins and LAP2 alpha distribution have revealed that chromosomes have special sites for binding with different proteins.

The interaction of condensin subunit XCAP-E with various nucleolar subcompartments in XL2 cells was studied. In the interphase cells, XCAP-E was associated with a granular component of nucleoli (as shown by double staining with antibodies against B23) and with small nucleolus-like structures in the nucleoplasm. Inhibition of transcription by actinomycin D does not disrupt interaction of XCAP-E with the granular compartment of segregated nucleoli. Treatment with DRB 5,6-dichloro-1 beta-ribofuranozide-benzimidazole causes disintegration of nucleolar fibrillar complexes, but does not affect nucleolar localization of XCAP-E. The data suggest that nucleolar association of XCAP-E is independent on the functional state of the nucleolus, and imply a possible role of this protein in rRNA processing and pre-fibosome assembly.

Function of condensin subunits XCAP-E and pEg7 (XCAP-D2) in the formation and maintaining of special organization of mitotic chromosomes has been studied in Xenopus laevis cells (XL-2). The experimental conditions involved blocking chromosomes being in the condensed state in cells treated by cytostatics, or during their reversible artificial decondensation. The latter was induced by incubation of living cells in hypotonic medium. In extensively mollen chromosomes, XCAP-E and pEg7, remained associated with axial regions of chromosomes. In contrast, upon adaptation of cells to hypotonic conditions and recondensation of chromosomes to nearly initial state, both proteins dissociated from chromosomes into the cytoplasm. In K-mitotic cells, after a 3-6 h treatment with nocodazole or taxol, considerable dissociation of XCAP-E and pEg7 from chromosomes was observed without significant changes in overall level of chromosome compactization. Taken together the data suggested that condensins play no important role in maintaining mitotic chromosomes being in condensed state. Rather, it seems probable that mitotic function of condensins may be associated either with the formation of the higher order chromosome structure, and/or segregation of sister chromatids, the processes being tightly linked with chromosome compactization. This paper is in memory of Professor Katherine Le Guellec of Rennes-1 University, who left us in June 2001. Professor Le Guellec initiated this work in Rennes and offered all the possible help that this work be continued in Moscow University. Let the memory of Katherine, a great scientist and sympathetic friend, live for ever in ours hearts.

The role of the nuclear matrix components in the organization of structural and functional domains of interphase nuclei was studied using irradiation with blue light in the presence of a photosensibilized agent (Ethidium bromide). Nuclear domain resistance to extractive solution (2 M NaCl) treatment served as a criterion of irradiation-induced stabilization of different nuclear domains. The following results have been obtained: 1) the structural organization of the complexes of chromatin and clusters of replication does not depend on the state of the nuclear matrix in isolated nuclei; 2) chemical stabilization of the nuclear matrix by Cu(2+)-ions is not sufficient for the organization of chromatin domains; 3) irradiation in the presence of Ethidium bromide stabilizes domains of the nuclei, but does not lead to stabilization of the nuclear matrix internal network. Hence, the irradiation prevented extraction from the nuclear domains of nonhistone proteins which were not standard matrix proteins. Based on the results obtained, a hypothesis was proposed about a coexistence of two groups of nonhistone proteins in the cell nucleus. The first group includes proteins of the nuclear matrix involved in immobilization of scafford attachment regions and active genes. The second group includes some hypothetical structural proteins participating only in compaction of DNA of condensed chromatin.

A new method of differential decondensation of mitotic chromosomes has been proposed by means of repeated treatment of live cells with 15% Hanks' balanced salt solution. The procedure of cell treatment includes three stages: the first hypotonic shock, cultivation in isotonic medium, and the second hypotonic shock. As a result, after a standard methanol-acetic acid fixation and Giemsa staining some discrete Giemsa-positive globules are revealed in mitotic chromosomes. Such globules are symmetrically arranged in axial regions of sister chromatids. The comparative analysis of marker chromosomes has revealed a topological conformity of these globules to G-bands of chromosomes. It has been shown that it is the first hypotonic shock that triggers induction of structural modification of chromatin in interphase nuclei and in mitotic chromosomes. Of interest is the fact that the effect of the first shock is prolonged in time and is realized during at least one cell cycle, with the normal structure of mitotic chromosomes being restored after S-phase of the successive cell cycle.