为了明确河南地区血清6型副猪嗜血杆菌流行菌株的生物学特性,试验从发病猪的肺脏、心血、关节液等病料中分离、纯化副猪嗜血杆菌,并对分离纯化的副猪嗜血杆菌进行PCR鉴定,同时进行血清型分型、致病性试验、毒力基因检测和药敏试验.结果表明:从肺脏中分离得到一株血清6型副猪嗜血杆菌,该菌株携带有vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtC、espP2 9种主要毒力基因;对保育仔猪表现出轻微的致病性;对头孢噻呋、头孢他啶、阿莫西林等16种抗生素敏感,对氨苄西林、青霉素G、卡那霉素等8种抗生素耐药.说明分离得到的血清6型副猪嗜血杆菌毒力较弱,对大多数药物敏感.

为了明确河南省某规模化猪场断奶保育猪副猪嗜血杆菌感染情况,从濒死期病猪的肺脏、心血样品中分离获得1株细菌,通过对该株细菌分离鉴定、血清型分型、致病性试验、毒力基因检测和药敏试验等一系列试验,证实该株细菌为副猪嗜血杆菌14型,该菌株携带有capd、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP等13种主要毒力基因;该菌株对保育仔猪表现出较强的致病性,对头孢他啶、氟苯尼考、头孢噻呋、氨苄西林、强力霉素、土霉素、氧氟沙星敏感,对青霉素、阿米卡星、诺氟沙星、复方新诺明耐药.研究结果可为副猪嗜血杆菌血清14型流行病学研究提供参考.

Porcine interferon α (poIFN-α) is a crucial cytokine that can prevent and treat viral infections. Seventeen functional porcine IFN-α subtypes were found in the porcine genome. In this study, multiple sequence alignment was performed to analyze IFN-α protein structure and function. Phylogenetic tree analysis of the poIFN gene family defined the evolutionary relationship of various subtypes. PoIFN-αs, including poIFN-α1–17, were expressed in an Escherichia coli expression system. The antiviral activities of these IFN-α proteins against vesicular stomatitis virus (VSV) and pseudorabies virus (PRV) were examined in PK-15 cells. We found that the antiviral activity of different poIFN-α molecules greatly differed as follows: the poIFN-α14 and 17 subtypes had the greatest antiviral activities against VSV and PRV in PK-15 cells, poIFN-α1, 2, 3, and 8 exhibited lower biological activities, and poIFN-α4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, and 16 had minimal or no effect in the tested target cell‒virus systems. Moreover, our studies demonstrated that the antiviral activity of IFN-α was positively correlated with the induction of IFN-stimulated genes, such as 2′–5′ oligoadenylate synthetase 1 (OSA1), interferon-stimulated gene 15 (ISG15), myxoma resistance protein 1 (Mx1), and protein kinase R (PKR). Thus, our experimental results provide important information about the antiviral functions and mechanism of poIFN-α.

为了掌握河南规模化猪场猪呼吸道疾病综合征主要细菌性病原的感染情况,本研究采集了临床有明显呼吸道症状猪的肺脏或气管分泌物病料样品284份,采用细菌分离纯化、形态学观察、PCR鉴定和药敏试验等方法对感染细菌进行分离鉴定.结果共分离鉴定出432株病原菌,其中猪链球菌132株,支气管败血波氏杆菌145株,副猪嗜血杆菌129株,胸膜肺炎放线杆菌10株,多杀性巴氏杆菌16株,分别占30.6％、33.6％、29.8％、2.3％和3.7％.单一细菌感染为147份,占52％;混合感染为137份,占48％.分离菌株对14种常用抗生素均表现出不同程度的耐药性,且表现严重的多重耐药现象.结果表明猪呼吸道疾病综合征临床病例中细菌感染非常严重,混合感染或继发感染比较普遍,分离菌株耐药明显.该结果为今后规模化猪场猪呼吸道疾病综合征的防控提供了参考依据.

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是引起猪(Sus scrofa)革拉泽氏病(Glasser's disease)的病原,是临床上危害猪群健康的最为严重的细菌性病原之一.副猪嗜血杆菌血清型众多,其中4型是分离比例最高的血清型,也是危害较为严重的血清型.crp是编码环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)受体蛋白(cAMP receptor protein,CRP)的基因,CRP是最重要的系统调控因子之一,在细菌感染过程中适应环境变化具有重要作用.为了研究crp基因对4型副猪嗜血杆菌生长、抗性和毒力等生物学特性的影响,本研究采用自然转化法构建了4型副猪嗜血杆菌临床分离株HPS4的crp基因缺失株Δcrp,对HPS4及Δcrp的形态、生长特性、生物膜形成、压力耐受、血清杀菌活性、铁利用率和小鼠(Mus musculus)毒力等进行了研究.结果表明,本研究成功构建了4型副猪嗜血杆菌临床分离株HPS4的crp缺失株Δcrp,HPS4的crp基因缺失后,生长显著减慢,生物膜形成能力明显减弱,对渗透压、氧化应激和热应激的耐受能力降低,在血清中的存活能力下降,对铁的利用能力降低,对小鼠的毒力降低.研究结果表明,crp基因对HPS4的生长、抗性和毒力有明显的影响.本研究为进一步探究crp基因的功能,筛选HPS4弱毒株提供基础资料.

[目的]副猪格拉菌是引起猪格拉泽氏病的病原,是危害养猪业最为严重的细菌性病原之一,该菌血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱.血清 2 型是中等毒力毒株,近年来临床分离比例越来越高,危害越来越严重.从河南某规模化猪场保育猪群分离到副猪格拉菌血清 2 型并进行系列试验,为科学防控该病提供参考.[方法]对副猪格拉菌临床疑似病例猪只无菌采集肺脏、气管、心血等样品,通过细菌分离纯化、革兰氏染色镜检、常规PCR、豚鼠致病性试验及琼脂扩散药敏试验等方法,对疑似细菌进行形态观察、鉴定、血清型分型、毒力基因检测、耐药基因检测、致病性和耐药性等一系列生物学特性研究.[结果]从肺脏样品中分离获得 1 株副猪格拉菌,经鉴定为血清 2 型,该菌株携带vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2 毒力基因,对豚鼠有较强的致病力.该菌株携带有aadA1、strA、strB、aphA1、tet(B)、sul2 多个耐药基因,对青霉素G、卡那霉素、阿米卡星、链霉素、四环素、土霉素、复方新诺明有较强的耐药性;对头孢噻呋、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林、左氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星敏感性较好,临床用药效果显著.[结论]分离出的副猪格拉菌 2 型菌株毒力较强,且能透过血脑屏障,有明显的多重耐药性.研究结果可为副猪格拉菌血清 2 型流行病学调查、致病机制研究以及临床防控措施制定提供参考.

为确定猪干扰素α8(poIFN-α8)蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗病毒作用,合成poIFN-α8基因,克隆入pCSMH大肠杆菌表达载体,将重组表达载体转化DH5α感受态细胞,进行温度诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳.将表达的目的蛋白利用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱纯化后,采用Western blot试验检测重组poIFN-α8的反应原性,利用猪肺泡巨噬细胞(PAM)检测0.01、0.05、0.1、1 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白对PRRSV的抗病毒活性,并检测重组poIFN-α8蛋白对下游干扰素刺激基因(ISG)Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用.结果表明,成功构建了 pCSMH-IFN-α8表达载体,实现了 poIFN-α8在大肠杆菌中的包涵体表达,且重组poIFN-α8蛋白具有良好的反应原性;0.05 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白可显著抑制PRRSV在PAM中的复制,poIFN-α8的抗病毒效果显著优于猪干扰素α2(poIFN-α2)、猪干扰素α5(poIFN-α5),且重组poIFN-α8能有效激活ISG的表达.综上,表达的重组poIFN-α8蛋白能有效抑制PRRSV的复制,且能激活ISG的表达.

干扰素（interferon, IFN）是一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子，目前已经应用于多种人和动物病毒病的预防和治疗。不同猪干扰素亚型的抗病毒活性差异较大，为了解猪IFN-α14的抗病毒活性，将猪IFN-α14基因序列进行分析，去除信号肽、优化密码子，并采用基因合成的方法合成了猪IFN-α14亚型基因，将其克隆入pCSMH原核表达载体，优化诱导条件，利用Ni琼脂糖凝胶纯化柱进行亲和层析，获得高纯度的重组猪IFN-α14蛋白，Western blot检测证明重组蛋白具有较好的特异性。用不同浓度的重组猪IFN-α14处理Vero细胞后，接种1 000 TCID 50 猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）,24 h收集细胞和上清，通过荧光定量检测细胞内病毒的RNA水平，同时测定细胞上清中病毒的TCID 50 。猪IFN-α14蛋白被成功表达并纯化，证明了10μg/L的重组猪IFN-α14干扰素能够显著抑制PEDV的复制。与本实验室前期表达纯化的猪IFN-α2、8相比，猪IFN-α14抑制PEDV复制的活性显著提高，为新型抗病毒药物开发提供了重要的依据和数据支持。

[目的]了解河南地区副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)血清7型流行菌株的毒力及耐药情况.[方法]以Hps血清7型参考菌株为对照,对6株Hps血清7型临床分离菌株进行16S rRNA基因扩增、序列分析、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验研究.[结果]16S rRNA基因测序及相似性比对结果显示,菌株1436与参考菌株0007相似性为100％,菌株1565、1624与参考菌株0007相似性均为98.6％.系统发育树分析表明,菌株1436与参考菌株0007亲缘关系最近;菌株1624与参考菌株0007亲缘关系最远.6株临床菌株与参考菌株表现为2种毒力基因型,菌株均携带有vta1、vta2、vta3、wza、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和esp P2毒力基因,其中5株临床菌株还携带omp P2 毒力基因.豚鼠致病性试验结果显示,临床菌株毒力较参考菌株表现出不同程度的增强,参考菌株不能感染豚鼠发病,未表现任何临床症状;临床菌株可感染豚鼠发病,表现出一定的临床症状,发病率为20％～40％,死亡率为0.参考菌株和临床菌株均对头孢他啶和头孢噻呋敏感,对强力霉素、氟苯尼考中介,对新霉素、卡那霉素、阿米卡星、红霉素、替米考星等耐药,且均表现出多重耐药现象.[结论]Hps血清7型临床菌株有一定的致病性,但毒力较弱,对头孢类药物敏感,有明显的多重耐药现象,临床上应注意对该血清型的防控.本研究为Hps血清7型流行病学、致病机制研究奠定了基础,为Hps血清7型的临床防控提供了参考依据.

为筛选对猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株有较好抑菌作用的中草药,挑选穿心莲、黄芩、苦参、白头翁、芒果叶和百里香6种中草药,采用水提取和65％乙醇提取相结合的方法制备单剂中草药的提取液,然后浓缩至含原生药物1 g/mL.采用二倍稀释法分别测定这6种中草药对传染性胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibition concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal bacteriocidal concentration,MBC),以筛选出体外抑菌效果较好的中草药.结果表明,胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株抑菌圈最大的是百里香和芒果叶,其抑菌圈直径分别为40 mm和35 mm,其次为白头翁、黄芩、穿心莲和苦参,其抑菌圈直径在8～16 mm之间.百里香、芒果叶、白头翁、黄芩、穿心莲和苦参的最小抑菌浓度分别为0.198、0.198、0.396、0.396、25、25 mg/mL.百里香、芒果叶、白头翁、黄芩、穿心莲和苦参的最小杀菌浓度分别为0.396、0.396、0.792、0.792、50、50 mg/mL.除穿心莲和苦参外,其余4种中草药对胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌株有很多好的抑菌和杀菌效果,其中百里香和芒果叶效果最佳.本结果为由传染性胸膜肺炎放线杆菌多重耐药菌引起的猪接触传染性胸膜肺炎的防控和治疗奠定了基础,为开发中草药相关无抗产品以及防治由多重耐药菌引起的猪接触传染性胸膜肺炎提供了参考.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is an economically important pathogen in the pig industry worldwide. Many viruses manipulate their cellular metabolism to replicate themselves and cause infection. A conserved cellular energy sensor, 5’-AMP-activated protein kinase (AMPK), maintains cellular energy homeostasis. We found that PRRSV infection caused significant AMPK activation in a time-dependent manner via the ROS–calcium/calmodulin-dependent protein kinase-2 pathway. RNA interference-mediated AMPK knockdown could increase PRRSV replication in MARC-145 cells, suggesting that AMPK contributed to PRRSV infection regulation. Moreover, investigation of the effect of AMPK activity on PRRSV replication showed that PRRSV replication could be suppressed by the pharmacological agonists 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside and A769662. Conversely, an AMPK inhibitor, compound C, markedly enhanced PRRSV infection. Furthermore, the AMPK agonist A769662 was found to exert no effect on PRRSV entry, assembly, and release, suggesting that A769662 may hinder the PRRSV genome replication in MARC-145 cells. In conclusion, AMPK may be a promising antiviral drug target against PRRSV infection.

为了掌握河南某规模化猪场保育猪发病猪群的感染病原,研究从濒死期病猪的肺脏、心血样品中分离获得一株细菌,通过对该株细菌分离鉴定、血清型分型、致病性试验、毒力基因检测和药敏试验等一系列研究工作.结果表明,该株细菌为副猪嗜血杆菌,血清型为7型,与副猪嗜血杆菌vHPS7株(GenBank登录号:CP049089)同源性为100％.该菌株同时携带有vta1、vta2、vta3、wza、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、dtC、espP等毒力基因,结合豚鼠致病性试验结果和临床发病情况,该菌株具有较强的致病性;对头孢噻呋、头孢他啶、强力霉素、土霉素、四环素、阿奇霉素6种药物敏感;对青霉素G、阿莫西林、氨苄西林、复方新诺明、左氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、壮观霉素、卡那霉素、阿米卡星11种药物耐药.该研究为今后副猪嗜血杆菌血清7型致病机制研究奠定了基础,为副猪嗜血杆菌血清7型的临床防控提供了理论基础.

为了解猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌临床分离菌株与标准菌株蛋白质差异表达情况,采用定量差异蛋白质组学研究策略,以临床分离菌株(HN201616)与标准株(CVCC261)的细菌全蛋白质为研究对象,鉴定差异表达蛋白质及生物信息学分析.结果显示:共鉴定出1 373个蛋白质,其中显著差异的蛋白质数为395个[显著性差异蛋白质数目按照差异倍数(FC)≥1.5和FC≤0.67,P≤0.05进行相应的筛选],包括上调蛋白质205个,下调蛋白质190个;鉴定出的与抗生素耐药相关的蛋白质主要有二氢叶酸还原酶、外膜蛋白、麦芽糖蛋白、二氢蝶酸合成酶、谷胱甘肽转移酶、丙酮酸激酶、谷氨酰水解酶、ATP-结合盒家族蛋白等.这些结果将有助于深入探索猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌多重耐药机制,为研发新型抗菌药剂和筛选潜在药物靶点提供思路.

为研究重组猪干扰素α2亚型(porcine interferon α2,poIFN-α2)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的抑制作用,试验构建了 pCSMH-poIFN-α2的大肠杆菌表达载体,采用温度诱导poIFN-α2表达后,收集包涵体并复性后,采用亲和层析的方法对poIFN-α2进行纯化.采用Western blot方法检测纯化后蛋白的特异性,结果显示该蛋白具有较好的特异性和反应原性.用不同浓度的重组poIFN-α2处理MARC-145和PAM细胞24h后,接种PRRSV(1 000 TCID50).24h后收集细胞,采用荧光定量PCR检测细胞内PRRSV ORF7的核酸水平,同时检测细胞上清液中PRRSV的TCID50.结果证明大肠杆菌表达的重组poIFN-α2可以有效抑制PRRSV的增殖.进一步检测重组poIFN-α2在PAM细胞上诱导干扰素刺激基因(ISG)的水平,结果证明重组poIFN-α2可有效诱导PAM细胞内ISG的上调.本研究为研发新一代抗病毒药物奠定了基础.

为了分析猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪肠道α冠状病毒(PEAV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)在临床中的混合感染情况,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法将已经验证为PEDV阳性的样本进行PDCoV和PEAV检测.结果 表明,PDCoV和PEDV混合感染比例为6.28％,191份PEDV阳性样本中,PDCoV阳性为12份,PEAV阳性为1份,PDCoV、PEAV和PEDV共感染的比例为0.52％.结果 表明目前临床生产中PEDV仍然是引起仔猪腹泻的主要病毒性传染源,为临床生产中仔猪腹泻的防控工作提供理论依据和技术支撑.

为了解牛肺炎支原体临床分离菌株(HN12)与标准菌株(PG45)蛋白质差异表达情况,采用定量蛋白质组学研究策略,在牛支原体临床分离菌株(HN12)和标准菌株(PG45)的全蛋白质中进行差异蛋白质鉴定,并进行生物信息学分析.结果表明,共鉴定2402个蛋白质,其中存在显著差异的有66个.上调蛋白质数量为25个,下调蛋白质数量为41个.鉴定出的蛋白质主要有膜蛋白、跨膜蛋白、脂蛋白、延长因子、膜脂蛋白P81、伴侣蛋白、可变表面脂蛋白和ABC转运蛋白等.

牛亚硝酸盐中毒是指因一次性食入大量富含硝酸盐或亚硝酸盐的饲料而引起的一种中毒性疾病,以发病突然、病程持续时间短、可视黏膜发绀、血液呈暗褐色、呼吸困难、急性死亡为主要特征.本文介绍了一例因饲喂变质青绿饲料而引起的育肥牛亚硝酸盐中毒病例的临床症状、病理变化和治疗过程,供同行参考.

四环素类药物是在兽医临床中常用的一类抗生素,为了解胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)对四环素类抗生素的耐药情况,本研究对从临床分离鉴定的85株APP进行了四环素类抗生素临床耐药情况和相关基因的分析和检测.应用药敏纸片法进行药敏试验,结果:APP对四环素的耐药率较高为76.5％,其次为金霉素54.1％、美他环素48.2％、多西环素45.9％、土霉素28.2％、米诺霉素25.9％、替加环素22.3％.采用PCR方法对四环素类10种耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL1和tetL2进行检测,结果:tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL2、tetL1 耐药基因的扩增阳性率分别为78.8％、41.2％、15.3％、8.2％、21.2％、15.3％、43.5％、24.7％和30.6％,而tetL1扩增则全部阴性,未检出其耐药基因.本研究结果为四环素类抗生素在猪传染性胸膜肺炎临床上的应用和新药研发提供了一定的理论依据.

为了解河南省规模化鸡场滑膜炎的感染情况,采集腱鞘炎、滑膜炎、骨关节炎、气囊炎、心包炎等症状病死鸡的肺脏、心包积液、关节液等病料共159份.通过病原分离培养、16S rRNA基因序列测定比对,共分离鸡滑液囊支原体25株,分离率为15.7％,表明河南省鸡滑膜炎感染率较高.将其中分离自某规模化蛋鸡场的分离株命名为HNMsy1,对HNMsy1进行毒力试验和免疫原性试验,结果显示,HNMsy1具有较强毒力,用该菌株制备的疫苗对鸡滑液囊支原体的攻毒保护率为100％.

为了解掌握副猪嗜血杆菌4型(Haemophilus parasuis serotype4,HPS4)临床分离菌株的耐药性和耐药基因携带情况.试验选用6大类18种常用抗菌药物,通过药敏纸片扩散法对10株HPS4菌株的耐药性进行检测研究,并通过PCR方法检测了菌株携带氨基糖苷类和喹诺酮类药物的耐药基因情况.结果表明,被检菌株对红霉素、阿奇霉素、替米考星、四环素、土霉素、强力霉素和氟苯尼考有很好敏感性,耐药率均为10％;对头孢噻呋、头孢他啶和大观霉素较敏感,耐药率为20％;对氨基糖苷类卡那霉素、阿米卡星、新霉素和喹诺酮类诺氟沙星、左氟沙星、氧氟沙星表现出较高耐药性,耐药率均在50％以上,且所有菌株均表现出3重及以上多重耐药现象.10株HPS4菌株共检出了strB、aphA1、gyrA、parC 4种耐药基因,检出率分别为50％、60％、80％、80％,结合耐药表型结果,表明这4种耐药基因可能是介导HPS4菌株对氨基糖苷类及喹诺酮类药物产生耐药性的主要原因.研究为临床防控副猪嗜血杆菌4型选药用药提供了科学的理论依据,充实了副猪嗜血杆菌耐药谱的数据库,为进一步研究其耐药机制奠定基础.