This study aimed to investigate the effects of different levels of autophagy induced by transient serum starvation on the metabolism, lipid metabolism, and differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells (SMSCs) to preliminary elucidate the role and function of autophagy in the regulatory network of skeletal muscle development. Different levels of autophagy were induced by controlling the serum concentration in the culture system for 24 h. Apoptosis, membrane potential, reactive oxygen species (ROS), ATP, and myogenic and lipogenic differentiation markers were monitored to determine if autophagy affected the metabolism and differentiation of SMSCs. Autophagy was induced in SMSCs via serum starvation (5%, 15%), as evidenced by decreased p62 and mTOR phosphorylation levels and increased LC3B lipidation and AMPK phosphorylation levels. Transmission electron microscopy revealed the presence of autophagosomes, and the rates of morphologically abnormal nuclei and mitochondria gradually increased with the decrease in serum concentration, the number of autophagic lysosomes also increased, indicating that 5% serum starvation induced severe autophagy, while 15% serum starvation induced mild autophagy. Compared with the control group and 15% serum-starved SMSCs, SMSCs undergoing 5% serum starvation had the highest intracellular ATP and ROS levels, the highest percentage of apoptotic cells, and the lowest membrane potential. The 15% serum-starved SMSCs had the highest membrane potential, but the percentage of apoptotic cells did not change significantly compared with the control group. The levels of the myogenic markers MyoD1 and MHC were significantly higher in 15% serum-starved SMSCs than in serum-sufficient SMSCs and the lowest in the 5% serum-starved SMSCs. The lipid contents (measured by Oil Red O staining and quantification of triglycerides) and lipogenic markers Peroxisome Proliferators-activated Receptors γ and Lipoprotein Lipase were also significantly higher in SMSCs undergoing 15% serum starvation than in the control group, and the lowest in the 5% serum-starved SMSCs. Different levels of starvation stress induce different levels of autophagy. Mild autophagy induced by moderate serum starvation promotes the metabolism and differentiation of SMSCs, while severe autophagy renders SMSCs more apoptotic, abnormal metabolism and suppresses SMSC differentiation into adipocytes or myocytes, and reduces lipid metabolisms. Our study suggests that autophagy plays a role in skeletal muscle development and may help design strategies for improving meat production traits in domestic pigs.
为了高效分离纯化并获得结构完整的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),用于PRRSV的形态学研究、动物免疫以及制备高质量疫苗,本试验在Marc-145细胞中增殖PRRSV HuN4株,经超滤浓缩后,分别采用氯化铯密度梯度离心方法和凝胶层析技术纯化PRRSV.结果显示,与氯化铯密度梯度离心相比,凝胶层析纯化可以得到纯度更高、结构更完整的病毒粒子.将凝胶层析纯化得到的PRRSV免疫小鼠制备多抗,间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,多抗血清可与PRRSV发生特异性反应;酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示,抗体效价可达到1:25 600以上,纯化的病毒具有良好的免疫原性.结果表明,应用凝胶层析技术可得到高纯度、结构完整的PRRSV粒子,且纯化后PRRSV能够诱导良好的免疫应答,本试验结果可为PRRSV的纯化提供参考.
为了研制安全有效的非洲猪瘟(ASF)疫苗,本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株基因组序列合成ASFV K205R基因,通过同源重组技术构建重组腺病毒Ad5-ASFV-K205R,使用Western blot检测K205R非结构蛋白的表达情况,PCR检测其遗传稳定性,腺病毒滴度检测试剂盒测定其滴度.使用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA测定血清K205R特异性抗体,采用多因子检测试剂盒测定血清中IFN-γ和IL-4细胞因子含量,采用CCK8法检测淋巴细胞的增殖情况.结果显示,成功包装出重组腺病毒Ad5-ASFV-K205R,能够正确表达K205R融合蛋白;接种293T细胞并连续传代20代,均可稳定遗传,病毒滴度可达9.5×1010PFU/mL;ELISA结果显示,小鼠一免后7～21 d可检测到K205R特异性抗体,并在二免后14 d内产生更高的抗体水平;K205R蛋白能显著刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4,同时也能显著刺激脾脏淋巴细胞增殖(P＜0.05).结果表明,Ad5-ASFV-K205R重组腺病毒免疫小鼠能诱导机体的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有很好的应用潜能,为进一步研发ASF疫苗提供基础.
为了制备牛妊娠相关糖蛋白18(boPAG18),并预测其理化性质和功能,本试验优化密码子并合成boPAG18 基因,构建pET30a-boPAG18 重组质粒.以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的蛋白质表达量为指标,优化装液量、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度条件,采用亲和层析法纯化boPAG18,SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定.预测boPAG18 的疏水性、信号肽、修饰位点、结构和蛋白相互作用.结果显示,经双酶切鉴定,pET30a-boPAG18 重组质粒构建成功,boPAG18 基因1 143 bp,表达蛋白约38 kDa.确定最佳表达条件为在OD600 nm值为0.6,装液量为40 mL,IPTG终浓度为0.2 g/L,37℃诱导4h.纯化的boPAG18 纯度高达98%,浓度为2.63 mg/mL.该蛋白分子式为C1923 H3007 N519 O541 S17,分子质量为42.6 ku,等电点为9.31,亲水性平均值为-0.041,为两性蛋白,蛋白质不稳定指数为 42.41,在水中不稳定;脂肪系数为 88.43,有 381 个氨基酸;消光系数为47 370 mol-1·cm-1,半衰期为30 h.boPAG18 前15 个氨基酸为信号肽,无跨膜区域;有糖基化修饰位点57 个,磷酸化修饰位点68 个,B细胞抗原表位13 个,二级结构中α-螺旋占比19.42%、β-转角占比5.77%、无规则卷曲占比44.88%、延伸链占比29.92%;有7 个相互作用蛋白,可能参与了母体在妊娠期的泌乳、抗菌和神经保护等调节功能.本试验为深入研究boPAG18 的结构和功能提供了数据支持.
为研究黄芩多糖对伪狂犬病毒(PRV)感染猪睾丸(ST)细胞的作用并筛选与调控相关的差异基因,本试验建立PRV感染ST细胞模型,将其分为预防、治疗和杀毒模式,分别使用不同浓度的黄芩多糖溶液进行处理,每个模式下设立空白对照组和PRV对照组.采用 CCK-8 法检测黄芩多糖对 ST 细胞存活率的影响,显微镜观察各组细胞形态,ELISA 检测IFN-γ、IFN-α和TNF-α细胞因子含量;在24h时提取RNA进行转录组测序,分析其差异表达基因并进行GO功能和KEGG通路分析.结果显示,PRV感染ST细胞出现病变.与PRV对照组相比,黄芩多糖浓度为97.66 μg/mL时,3 种模式中细胞存活率均极显著升高(P<0.01),细胞病变减轻,IFN-γ和 IFN-α含量均极显著提高(P<0.01),TNF-α含量极显著降低(P<0.01),治疗指数(TI)分别为2、4 和4.治疗模式下,97.66 μg/mL黄芩多糖处理组、空白对照组和PRV对照组比较共交集差异基因74 个,其中SOCS3、VEGFA、ZBTB18、CLCN6、RSBN1、RBM47 和TET2 基因差异表达较为显著,差异表达基因显著富集到15 条信号通路,PRV对照组与空白对照组和PRV对照组与黄芩多糖治疗组比较,差异表达基因主要分别涉及核糖体、内吞、MAPK、TNF和MAPK、mTOR、TLR等相关通路.结果表明,黄芩多糖对PRV感染ST细胞具有保护作用,其作用可能是通过调节TNF信号通路和TLR信号通路中SOCS3、CCL5、FOS、PIK3R1 和MAP3K8 等相关基因的表达来实现.本试验结果将为进一步探索黄芩多糖调控PRV感染宿主的作用机制提供理论依据.
为了探究不同地区褐黄血蜱的单倍型多态性、遗传分化和种系发育关系,本试验以采自于湖南、河南两省的褐黄血蜱(各10只,共20只)为研究对象,通过PCR扩增其细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cox1)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅳ(nad4)基因序列,对其单倍型多态性(Hd)、遗传分化和种系发育关系进行分析.结果显示,cox1基因序列(849 bp)包含4个变异位点,5个单倍型(h=5,A1～A5,Hd=0.653),其基因分化系数(Gst)=0.061,遗传分化系数(Fst)=-0.047,基因流(Nm)=-5.625;nad4基因序列(626 bp)包含3个变异位点,3个单倍型(h=3,B1～B3,Hd=0.363),其Gst=0.004,Fst=0.074,Nm=3.125;cox1+nad4 基因序列包含 7 个变异位点,7 个单倍型(h=7,C1～C7,Hd=0.768),其Gst=-0.010,Fst=-0.015,Nm=-16.560;在所构建的种系发育树中,20只褐黄血蜱均处于种系发育树的一个分支.结果表明,湖南、河南两省的褐黄血蜱个体之间虽表现出单倍型多态性,但它们之间具有较近的亲缘关系,尚未出现遗传分化.
为了分析小鼠泛素特异性蛋白酶2(USP2)2种主要转录本(Usp2-45和Usp2-69)及其编码蛋白的理化特性,构建Usp2-45真核表达载体和Usp2启动子荧光素酶报告质粒,探究生物钟系统对Usp2不同转录本启动子的调控作用,本试验利用在线软件对小鼠Usp2-45和Usp2-69基因进行生物信息学分析;克隆Usp2-45基因的蛋白编码序列(CDS)并构建pcDNA3.1-Usp2-45-Flag重组载体,转染至小鼠NIH3T3胚胎成纤维细胞后,利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测Usp2-45在mRNA和蛋白水平的表达;扩增Usp2-45和Usp2-69的启动子片段,并构建其荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告试验检测Usp2启动子对生物钟核心转录因子脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1(BMAL1)和昼夜运动输出周期蛋白(CLOCK)的应答活性;通过构建不同长度的Usp2-45启动子荧光素酶报告质粒鉴定其生物钟转录调控功能区.结果显示,小鼠USP2-45和USP2-69蛋白均为不稳定蛋白,亲水性强,无跨膜区域和信号肽,且基因的CDS区高度保守;pcDNA3.1-Usp2-45-Flag重组质粒的酶切和测序结果与预期一致,转染重组质粒组的Usp2-45在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于对照组(P＜0.01).双荧光素酶报告试验结果显示,Usp2-69启动子对BMAL1/CLOCK无应答活性,而不同长度的Usp2-45启动子对BMAL1/CLOCK均具有显著应答活性,活性由强到弱依次为1 368、2 004和998 bp.结果表明,本试验系统分析了小鼠USP2的理化性质和结构特性,成功构建了 pcDNA3.1-Usp2-45-Flag真核表达载体,初步鉴定了生物钟系统选择性调控Usp2-45节律性转录的启动子功能区.
为了研究母猫双孔腹腔镜绝育手术后非抗生素给药的恢复效果,本试验将10只健康母猫随机分为2个组进行双孔腹腔镜绝育手术,术中采用超声刀切除母猫的卵巢和部分子宫,手术时间约30 min,A组母猫术后3 d连续给予抗生素+止疼药处理,B组母猫术后连续3 d仅给予止疼药处理,观察母猫术前、术后血液中白细胞和C反应蛋白水平,以及术后疼痛反应和伤口愈合情况.结果显示,术后7 d时,2个组母猫伤口均愈合良好,无感染情况发生;2个组母猫的疼痛反应除术后2 d时差异显著(P＜0.05)外,其余时间均差异不显著(P＞0.05);2个组间白细胞数量比较差异均不显著(P＞0.05);2个组间C反应蛋白水平除术后1和3 d时差异显著(P＜0.05)外,其余时间均差异不显著(P＞0.05);2个组母猫术后7 d时,上述指标比较均差异不显著(P＞0.05),且均与术前水平差异不显著(P＞0.05).结果表明,双孔腹腔镜绝育手术后连续3 d仅止疼药处理与抗生素+止疼药处理母猫的疼痛反应、白细胞数量、C反应蛋白水平和伤口愈合情况差异不明显,即非抗生素给药方法可应用于母猫的双孔腹腔镜绝育手术.
为有效治疗临床上由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎,本试验从平菇中分离出1株产抗菌物质的菌株,对抗菌物质进行初步确证后,通过16S rRNA基因测序方法对分离菌株进行鉴定,并采用琼脂扩散法对该菌株所产抗菌活性物质的理化特性和抑菌谱进行测定.结果显示,经分析抗菌物质为一种细菌素;经鉴定该产细菌素菌株为粪肠球菌,命名为EF-3;EF-3所产细菌素可被蛋白酶K和胰蛋白酶水解,具有一定热稳定性,在pH=4.0～6.0的条件下抗菌活性较强,且对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌具有良好抗菌活性.因此,本试验分离获得的产细菌素粪肠球菌EF-3有望作为一种替抗产品用于治疗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎.
为探讨碳青霉烯类药物对接合效率的影响,并分析接合试验过程中是否由于接合子的生长导致接合效率被高估,本试验以3株分别携带不同碳青霉烯耐药质粒的菌株ML83、WF1321和VH12为供体菌,大肠杆菌C600为受体菌,采用不同亚抑菌浓度的美罗培南分别处理供体菌和受体菌,分别采用传统方法(接合效率=接合子数÷受体菌数)和真实接合效率方法[接合效率=接合子数÷(供体菌数×受体菌数×接合时间)]对碳青霉烯耐药质粒的接合效率进行评价.结果显示,与不加药物的对照组相比,不同亚抑菌浓度的美罗培南对碳青霉烯耐药质粒的接合转移均有促进作用(P＜0.05),且促进作用随着美罗培南浓度的升高而增大;与真实接合效率方法相比,传统方法获得的接合效率更高,但真实接合效率方法得到的接合效率组间差异性更显著.结果表明,细菌真实的接合效率被高估,真实接合作用主要发生在前期指数对数期,后期极有可能是由于接合完成后接合子的生长导致总接合效率的升高.
本病例为1只走失后2 d找回时疑似发生车祸而倒地不起的患犬,曾在当地宠物医院就诊,经X线检查无明显骨折,以消炎止痛方式治疗3 d无效后,转诊至本院.对患犬进行神经学检查判定为神经缺损4级,血常规、血液生化和核磁共振成像(MRI)等实验室检查结果显示,患犬C5段右侧脊神经根和C6～T2段脊髓神经受损,最终确诊为神经损伤性瘫痪.采用安置导尿管、药物治疗、电灸治疗、激光理疗和水下跑步锻炼等中西医学结合的方式进行治疗,1个月后患犬恢复正常.本病例诊治过程表明,MRI检查在诊断神经损伤性疾病中具有重要意义,以中西医结合的方式治疗犬神经损伤性瘫痪具有显著疗效.
为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)在我国部分省份的流行情况,本试验在2017-2021年期间于湖北、河南、湖南、江西、浙江、河北、福建和山东8个省份127个规模化猪场采集了 2 357份病料样品,使用聚合酶链式反应(PCR)对PCV2进行病原检测,同时对PCV2的单独感染和PCV2与其他病原体的混合感染进行分析,并对华中地区的50株PCV2进行遗传演化分析.结果显示,8个省份的PCV2阳性率介于52.17％～67.78％;不同年份PCV2阳性率介于50.53％～71.85％;共检出PCV2阳性样品1 436份,总体阳性率为60.92％;PCV2单独感染率为15.18％,PCV2与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的混合感染率为22.08％,PCV2与猪肺炎支原体(MHP)、猪链球菌(SS)的混合感染率为18.31％;遗传演化分析发现,PCV2d亚型占阳性样品数的80％(40/50),PCV2a亚型占4％(2/50),PCV2b亚型占16％(8/50),未发现PCV2c和PCV2e亚型.结果表明,我国华中地区PCV2的感染率较高,且PCV2和PRRSV及PCV2和MHP、SS的混合感染率高于PCV2的单独感染率,同时PCV2d亚型已经成为华中地区当前PCV2流行的优势毒株.
为评估四川省兽医系统实验室检测能力,四川省动物疫病预防控制中心于2021年组织开展了全省市、县两级兽医系统实验室检测能力比对工作,共有21个市级和148个县级兽医系统实验室参与比对.结果显示,市级兽医系统实验室非洲猪瘟病毒核酸检测、口蹄疫病毒O型抗体检测、禽流感病毒H5亚型抗体检测项目结果正确率分别为100％、92.06％和93.65％;县级兽医系统实验室非洲猪瘟病毒核酸检测、口蹄疫病毒0型抗体检测、禽流感病毒H5亚型抗体检测、禽流感病毒H7亚型核酸检测、猪瘟抗体检测、布鲁氏菌病抗体检测、包虫病抗原检测项目结果正确率分别为99.19％、98.11％、96.68％、100％、96.99％、100％和97.50％.比对结果表明,四川省市、县两级兽医系统实验室检测能力总体较好,同时也反映出部分实验室在人员稳定和培训、设施设备等方面存在的问题,需进一步加强建设.
为了研究狗枣猕猴桃多酚提取物(APE)的抗疲劳作用,本试验将小鼠随机分成6个组:空白对照组、疲劳模型组、茶多酚对照组[茶多酚,30 mg/(kg·bw·d)]、狗枣猕猴桃多酚低、中、高剂量组[灌胃剂量分别为25、50和100 mg/(kg·bw ·d)],每天灌胃1次,连续灌胃15 d,干预结束后进行负重游泳试验,记录各组小鼠的力竭游泳时间;并进行不负重游泳试验,分析小鼠运动后肝糖原(HG)和肌糖原(MG)含量变化,同时检测小鼠血清中乳酸(LD)和尿素氮(BUN)含量,以及肝脏组织中丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力.结果显示,与疲劳模型组相比较,狗枣猕猴桃多酚高剂量组小鼠负重游泳时间极显著延长(P＜0.01),HG和MG含量分别提高了 54.26％和94.78％,血清中LD和BUN含量分别降低了 55.22％和14.2％,肝脏中SOD活力和GSH含量分别提高了 87.48％和66.14％,MDA含量降低了23.24％(P＜0.01).结果表明,狗枣猕猴桃多酚能提高小鼠的抗疲劳能力,为抗疲劳功能性食品的开发利用提供一定的科学依据.
本院曾接诊1例急性动脉血栓(Artertal throm-boembolism,ATE)导致双后肢瘫痪的患猫,采用手术切开血管,取出血栓,患猫恢复后肢运动功能,现报告如下. 1基本信息 布偶猫,雄性,2岁4个月,体重5.6 kg.主诉:宠物主人晚上到家以后发现患猫双后肢瘫痪,呼吸急促,精神沉郁,无食欲.瘫痪前未见明显异常,体况评分2/5,心率260次/min,呼吸频率80次/min,收缩压200 mmHg,肛温38.2℃.触诊双后肢无脉搏,本体感受缺失,肢端凉.
人类生活向自然界的强势延伸不仅侵扰了野生动物赖以生存的环境,还打破了人与自然和谐相处的生态平衡状态,生态平衡状态的失衡对野生动物法治保护提出了严峻的考验.虽然我国陆续出台了《中华人民共和国野生动物保护法》(以下简称《野生动物保护法》)、《陆生野生动物保护实施条例》、《关于全面禁止非法野生动物交易、革除滥食野生动物陋习、切实保障人民群众生命健康安全的决定》等一系列规范性法律文件,但是由于现行野生动物保护执法事项不明晰、执法监管不到位,我国野生动物保护执法工作仍然存在较大的提升空间.鉴于此,本文在深入探讨我国现行野生动物保护执法的现实困境的基础上,提出野生动物保护执法的完善路径,以期为未来野生动物保护执法工作的优化提供参考.
2021年3月,江西省某养鹅场免疫过雏鹅痛风和小鹅瘟卵黄抗体的雏鹅发生痛风,为分析其原因,本试验取9只7日龄病死鹅,剖检观察大体病变;采集所有病例的肝脏样品,分别用星状病毒通用RT-PCR和水禽细小病毒通用PCR进行扩增,对所有扩增产物进行测序和序列分析.剖检结果显示,所有病例均有典型内脏和关节尿酸盐沉积.检测结果显示,所有肝脏样品均为鹅星状病毒(GoAstV)和鹅细小病毒(GPV)阳性.序列同源性分析与遗传演化分析结果显示,所测星状病毒和细小病毒分别属于GoAstV基因2型(GoAstV-2)和GPV 2.2分支.结果表明,该养鹅场的病例均存在GoAstV-2和2.2分支GPV混合感染.
为了解浙江省猪圆环病毒2型(PCV2)基因型和遗传变异情况,本试验对2021年采自浙江省不同地区的27份PCV2阳性病料进行PCV2全基因组扩增、克隆和测序,并将其全基因组、ORF2基因核苷酸序列及其推导的Cap蛋白氨基酸序列与不同国家和地区的流行株进行遗传变异分析.结果显示,27株PCV2流行株之间全基因组和ORF2基因核苷酸序列同源性分别为91.0％～99.9％和81.7％～99.9％,与不同国家和地区的PCV2参考株之间全基因组和ORF2基因核苷酸序列同源性为90.7％～99.9％和81.8％～100％.遗传进化树分析显示,27株PCV2流行株分别处于4个分支,其中8株为PCV2a基因型,6株为PCV2b基因型,12株为PCV2d基因型,1株为PCV2e基因型.27株PCV2流行株Cap蛋白的糖基化位点和核定位信号区氨基酸序列呈高度保守,B细胞抗原表位和T细胞抗原表位存在多个氨基酸突变.结果表明,浙江省多种基因型PCV2共存,以PCV2d基因型流行为主.本试验结果对于了解浙江省PCV2流行毒株的基因型和变异状况具有重要的意义.
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(RABV)引起的急性、高度致死性的烈性人兽共患病.狂犬病临床以特异性恐风、恐水、咽肌痉挛和进行性瘫痪等症状为典型特征,感染后一旦出现狂犬病的典型症状,病死率近乎100％.疫苗免疫是狂犬病预防和控制的唯一有效措施,能使全球的狂犬病患病率显著降低.然而,目前的狂犬病疫苗仍存在生产工艺复杂、需多次接种才能产生保护性抗体等问题,随着科学技术的不断发展和进步,新型狂犬病疫苗的研发也成为了研究热点之一.本文在传统狂犬病疫苗的基础上,对狂犬病的活载体疫苗、核酸疫苗、病毒样颗粒疫苗、亚单位疫苗和减毒疫苗的发展现状进行了综述,同时对多种新型疫苗在狂犬病消除中的作用进行了展望.
猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的单股环状闭合DNA病毒,是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原,目前包括4个基因型:PCV1、PCV2、PCV3和PCV4.其中,PCV3是近年来新发的一种严重危害养猪业的基因型,已经在全球范围呈现广泛流行趋势,引起了国内外学者的广泛关注.本文主要从病原学、流行病学、临床症状、致病机理、免疫反应和诊断方法对PCV3近年来研究情况进行了综述,为PCV3后期的各方面研究提供参考.
