目的:观察蒙药额尔敦-乌日勒对斑马鱼心脏损伤后再生作用及其可能作用机制,验证其治疗的有效性,为进一步研究蒙药额尔敦-乌日勒提供实验依据.方法:利用转基因鱼系Tg(vmhc:mCherry-NTR)经甲硝唑(MTZ)处理后建立心室损伤模型,把 90 只受精 3d(3dpf,days post fertilization)的斑马鱼胚胎随机分为对照组(DMSO,n =30)和心肌消融组(MTZ,n = 30)以及心室损伤后额尔敦-乌日勒治疗组(MTZ+EW,n =30),治疗组在MTZ处理后24 h(24 hpt,24 hour post treatment)用蒙药额尔敦-乌日勒混悬液以25 μg/mL治疗.3 组在72 hpt检测细胞增殖,用共聚焦显微镜观察细胞增殖情况并定量分析,同时应用RT-qPCR分析一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1 β)、白细胞介素-6(IL-6)的表达量.结果:治疗组斑马鱼胚胎经过蒙药额尔敦-乌日勒治疗后,心肌损伤后的再生修复比例明显上升,且再生心肌细胞的增殖速度较对照组加快、炎症因子表达量明显低于对照组.结论:蒙药额尔敦-乌日勒能够促进斑马鱼胚胎心肌细胞的修复再生,并促进心肌细胞的增殖,抑制心室损伤后的炎症反应.

目的:研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)通过影响DNA甲基转移酶表达变化来上调血管内皮生长因子A(VEGFA)表达水平减轻急性低氧造成的脑损伤.方法:以小鼠海马神经元细胞(HT22 细胞)为研究对象,分为对照组(Control)、低氧组(Hypoxia)和黄芪甲苷处理组(H+AS-Ⅳ).将HT22 细胞低氧 13h 复氧 6 h 构建低氧模型,H+AS-Ⅳ组于复氧的同时给与100 μmol/L的黄芪甲苷药物处理.荧光倒置显微镜观察细胞形态变化;采用Real-time PCR 检测DNA甲基化转移酶 1(DNMT1)、DNA 甲基化转移酶 3A(DNMT3A)、DNA 甲基化转移酶 3B(DNMT3 B)、VEGFA在mRNA水平上的表达变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测DN-MT1、DNMT3A、DNMT3B在蛋白水平上的表达变化.结果:与对照组相比,低氧后,HT22 细胞胞体变小,触角变短.DNMT1、DNMT3 A的mRNA 水平和蛋白水平均有所下降(P＜0.05),DN-MT3B则表达上升(P＜0.05),VEGFA的mRNA水平下降(P＜0.05).与低氧组相比,给予AS-Ⅳ治疗后细胞形态有所改善.DNMT1、DNMT3A 的 mRNA 水平和蛋白水平均无变化,DN-MT3B则有所降低(P＜0.05),VEGFA的mRNA水平上升(P＜0.05).结论:黄芪甲苷可以下调低氧后DNMT3B的表达水平,发挥神经保护作用,这一保护机制可能是通过上调VEGFA的表达来发挥的.

目的 通过稳定表达 70 kD热休克蛋白(HSP)4 重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系,直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化.方法 以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,克隆HSPA4,并连接EGFP.将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载体中,慢病毒转染SH-SY5Y细胞.使用 3 μg/ml嘌呤霉素处理细胞 1 个月,筛选得到HSPA4-EGFP稳转系.通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)、Western印迹、共聚焦显微镜检测等方法,证实HS-PA4-EGFP稳转系能有效且实时反映UPR的变化.结果 扩增到HSPA4-EGFP,并成功构建HSPA4-EGFP稳定表达的UPR报告系统.QPCR检测表明,构建的报告系统可以指示UPR.在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内绿色EGFP的点状分布,其能够反映UPR错误折叠蛋白的多少及分布,分别加入UPR激活剂、抑制剂后,细胞内绿色EGFP的点状分布明显增多和减少,差异有统计学意义(P<0.05).Western印迹检测到细胞中HSPA4-EGFP融合蛋白表达条带.结论 成功构建HS-PA4-EGFP稳转系,能够直观实时反映UPR变化,为深入研究UPR及其相关疾病(包括老年性疾病)提供工具.

目的:建立稳定表达微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白(EGFP-LC3)的人神经母细胞瘤株SH-SY5 Y细胞系,验证EGFP-LC3点状聚集物能够实时直观地反映自噬小体和自噬流.方法:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的cDNA为模板,克隆LC3,并连接EGFP绿色荧光蛋白.将EGFP-LC3连接入慢病毒载体GV348中,构建慢病毒表达载体EGFP-LC3-GV348.慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5 Y细胞),使用3μg/mL嘌呤霉素筛选并处理细胞1月,筛选得到EGFP-LC3稳转系.诱导自噬后,用共聚焦显微镜观察LC3荧光斑点并定量分析.Western blot检测目的蛋白表达情况.结果:经酶切证实,EGFP-LC3-GV348慢病毒表达载体构建正确.在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内的绿色荧光EGFP代表的自噬小体,活体染料LysoTracker Red DND-99将溶酶体染成红色荧光,红色荧光与绿色荧光重叠代表自噬溶酶体.无血清诱导自噬后,自噬小体(绿色荧光斑点)明显增加,差异有统计学意义(P<0.001).Western Blot免疫印迹可见EGFP-LC3融合蛋白表达条带.结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的SH-SY5 Y细胞系,EGFP-LC3荧光斑点可以直观实时反映自噬囊泡,为进一步探讨神经退行性疾病的自噬机制提供了实验基础.

目的:观察FGF2在低氧及低氧预适应条件下小鼠海马神经元细胞中的表达变化,探究FGF2是否参与低氧耐受神经保护作用.方法:使用生物信息学方法进行搜索和鉴定FGF2基因家族成员.在细胞层面建立低氧和低氧预适应模型,通过Western-blot、qRT-PCR检测细胞中FGF2表达情况.结果:FGFs家族分为7个亚家族,其中FGF2含有一个由17个氨基酸组成的F GF受体结合域,能够与特定的F GF受体结合进行信号的转导.在细胞层面,相比于空白对照组(C),低氧组(H)和低氧预适应组(HPC)FGF2在mRNA水平和蛋白水平的表达均有所下降(P<0.05),而与H组相比,HPC组FGF2 mRNA水平和蛋白水平的表达有所升高(P<0.05).结论:F GF参与低氧预适应的神经保护作用.

目的:研究5-氮-2'脱氧胞苷(5-Aza-cdR)通过影响DNA甲基转移酶功能,调节BDNF表达并参与学习记忆的相关机制.方法:以70只6～8周18～22克雄性ICR小鼠为研究对象,随机分为三组:注射PBS为C组,25只;注射5-Aza-cdR为注射组,30只;注射K252a为K252a注射组,15只.通过Western blot、real-time PCR、免疫荧光技术,检测小鼠海马脑区DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)和脑源性神经营养因子(BDNF)在mRNA和蛋白水平的表达变化,通过水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力.结果:与C组比较,小鼠经过5-Aza-cdR处理24 h后,DNMT3B的蛋白水平和mRNA水平均有所下降(P<0.05),BDNF的蛋白和mRNA水平显著增加(P<0.05).与C组比较,5-Aza-cdR注射组的BDNF荧光强度显著增强(P<0.05),小鼠找到目标平台的潜伏期显著降低(P<0.05),目标象限百分比以及目标象限穿越次数均显著增加(P<0.05).结论:5-Aza-cdR下调DNMT3B表达后,通过上调小鼠海马中BDNF的表达,可提高小鼠的学习记忆能力.

低氧/缺血会对神经系统产生损伤,但抑制氧自由基和炎性因子的产生可减轻低氧/缺血状态对脑神经的损伤作用,这也是目前临床治疗相关疾病的一个重要策略.低氧/缺血预适应(hypoxia/ischemi-a preconditioning,H/IPC )指机体接受短暂的低氧/缺血刺激可使组织、器官甚至生物体对随后的严重低氧/缺血压力具有适应性的现象.作为机体的一种内源性保护机制,低氧/缺血预适应可以通过抑制氧自由基和炎性因子来保护神经细胞.目前研究表明,低氧/缺血预适应刺激miRNA的表达变化可能是其发挥保护作用的重要机制之一.

低氧预适应(hypoxic preconditioning,HPC)是指机体在经历一次或多次短暂、非致死性低氧刺激后,获得的对更严重甚至致死性低氧/缺血刺激的耐受性,被认为是机体抗低氧/缺血的一种内源性保护现象[1].

心血管疾病是有着高患病率和高死亡率,对成年人特别是中老年人身体健康有着严重威胁的常见疾病.每年因心血管疾病死亡的人口占全球死亡总人数的30 ％以上,目前已成为临床着重关注研究的领域.有研究表明心血管疾病与微小RNA(microR-NA,miRNA)的调节关系紧密.近年来更是有研究证实了miRNA作为外泌体细胞间信息传递过程中重要的信号分子,参与相关信号通路的调节,并涉及心血管疾病的生理病理机制[1 -2].

目的:探讨基于优慕课+数字教材在生理学教学中的实践.方法:在2018级临床医学专业的大学生理学教学中,进行了基于优慕课+数字教材生理学理论课的研究,在学期末对学生进行问卷调查.结果:95.69％的学生认为该数字教材有助于课前的预习,96.98％的学生认为该数字教材有助于课后的复习及重点知识的掌握.98.71％的学生喜欢本章的课后小结,他们认为这可以帮助其对本章的知识点进行梳理,99.14％的学生认为可以帮助其理解知识点并喜欢同步练习,96.55％的学生认为可促进其思考问题.结论:将数字教材应用于生理学理论课的教学中,可调动学生的学习主动性,加深对所学知识的理解,帮助学生做好预习及复习,促进学生思考问题,以提高学习效果.

目的 探讨纳米氧化铈对斑马鱼胚胎早期发育的影响及机制.方法 将生长发育良好的斑马鱼胚胎随机分为对照组和纳米氧化铈染毒50、100、200、400、800 mg/L剂量组,每组40个.各剂量组斑马鱼胚胎分别予相应质量浓度的纳米氧化铈染毒5d,对照组斑马鱼胚胎不予染毒.观察斑马鱼胚胎死亡以及畸形情况,采用激光共聚焦显微镜实时记录斑马鱼胚胎心率,采用蛋白免疫印迹实验检测斑马鱼胚胎活化的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved Caspase-3)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达情况.结果 各组斑马鱼胚胎死亡率、胚胎畸形率随染毒剂量增大而增加(P＜0.01);800 mg/L剂量组斑马鱼胚胎心率低对照组[(77±8)vs(93 ±4)次/分,P＜0.01].各组斑马鱼胚胎LC3-Ⅱ蛋白相对表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05).各剂量组斑马鱼胚胎cleaved Caspase-3蛋白相对表达水平均高于对照组(P＜0.05);200 mg/L剂量组斑马鱼胚胎cleaved Caspase-3蛋白相对表达水平高于50 mg/L剂量组(P＜0.05).结论 纳米氧化铈颗粒可能通过激活细胞凋亡,引起斑马鱼胚胎早期发育的毒性效应.

为了鉴定MBD基因家族成员,应用在线数据库资源,结合生物信息学方法进行搜索和鉴定MBD基因家族成员,搜索后获得6个MBD蛋白序列,为了后续研究方便命名为MBD1～MBD6.并对其氨基酸序列的理化性质、基因结构、蛋白结构、保守结构域和表达模式进行了预测和分析,并构建了MBD家族系统发生树.结果 表明,MBD家族成员在进化过程中相对保守,但MBD1和MBD4相对其他4个家族成员向不同方向进化.通过对所有MBD基因的表达谱分析得知该基因家族在各组织中均有表达,个别组织和细胞中表达量高低不同表明该家族基因具有一定的时空性和组织特异性,不同基因之间的表达模式差异明显.通过分析家族成员特点为后续实验研究提供理论基础.

本文探析了低氧预适应对神经系统的保护作用尤其是改善学习记忆能力的相关机制,回顾了电压依赖性钙离子通道在神经系统中的作用以及与学习记忆之间的关系.重点总结了低氧预适应诱导下电压依赖性钙离子通道特性的变化情况,并深入归纳了BDNF/TrkB和cAMP/PKA信号通路对电压依赖性钙离子通道的调节机制以及低氧预适应与这些信号通路之间的关系.通过总结低氧预适应调控BDNF/TrkB和cAMP/PKA信号通路影响电压依赖性钙离子通道相关的最新研究进展,为将来阐明低氧预适应提升认知能力的可能机制奠定理论基础.

目的:探讨Kri1l基因突变对斑马鱼脑部发育的影响.方法:通过正向遗传学的手段发现Kri1 l基因突变的斑马鱼系,在光镜下观察野生型与突变型的表型.采用全胚胎原位杂交技术,检测神经发育相关转录因子sox2的表达情况.为了进一步探究脑部神经发育异常,用Tg(Kri1l+/-)与Tg(HuC:EGFP)泛神经元转基因鱼系进行杂交,得到Tg(Kri1l+/-;HuC:EG-FP)双转基因系,绿色荧光标记神经元.利用激光共聚焦显微镜观察野生型和突变型胚胎脑部神经元的变化;通过TUNEL染色观察脑部神经元细胞凋亡的情况.结果:在光镜下Kri1 l突变胚胎的中脑区域变小,神经元明显减少.通过激光共聚焦显微镜观察Tg(Kri1l+/-;HuC:EGFP)双转基因系的脑部神经元,发现Kri1 l突变型胚胎脑部神经元明显减少,且神经元的减少开始于受精二天之后.通过全胚胎原位杂交发现,脑部早期神经干细胞发育没有异常.TUNEL染色结果提示Kri1 l突变胚胎神经元凋亡增加.结论:Kri1 l基因突变导致斑马鱼脑部发育异常,其机制可能是通过引起脑部神经元的凋亡来实现的.

目的 探究氧化钕对斑马鱼早期发育的影响,揭示纳米氧化钕心脏毒性机制.方法 将状态良好的胚胎按40个/孔置于6孔板中,分别暴露于终浓度为0(对照)、50,100、200、400、800 mg/L纳米氧化钕悬液,并轻轻摇匀,于28℃孵育箱中培养,每两天换液一次,连续染毒5 d.观察斑马鱼胚胎死亡、畸形情况,实时监控斑马鱼胚胎心率变化情况,原位杂交染色观察心脏肌球蛋白轻链2(cardiac myosin light chain2,cmlc2)基因的表达情况.通过TUNEL染色方法检测细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,各浓度纳米氧化钕染毒组斑马鱼胚胎的死亡率和畸形率均较高,差异具有统计学意义(P＜0.05);且随着纳米氧化钕染毒浓度的升高,斑马鱼胚胎的死亡率及畸形率呈上升趋势.200 mg/L纳米氧化钕染毒组斑马鱼胚胎的心率降低,差异有统计学意义(P＜0.05).原位杂交结果显示:200 mg/L纳米氧化钕染毒组病理性损害较100 mg/L染毒组和对照组更明显,同时,200 mg/L纳米氧化钕染毒组cmlc2基因表达量也高于对照组和100 mg/L纳米氧化钕染毒组.TUNEL染色结果表明,100、200 mg/L纳米氧化钕染毒组斑马鱼胚胎TUNEL染色阳性心肌细胞数均较高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 纳米氧化钕染毒可能是通过上调斑马鱼胚胎心脏发育标记基因cmlc2,导致心肌细胞凋亡,从而发挥心脏毒性作用.

细胞培养技术是生命科学研究中广泛应用的方法,是国内医学院校本科生基础医学课程的重要组成部分,也是医学生从事工作后常用的临床医疗技能.但是在互联网和生命科学发展日新月异的背景下,国内医学院校细胞培养技术课程实施过程中,在教学内容、教学方法、实验课时与设备和考核方式方面日趋落后.针对以上四个方面出现的问题进行分析并对细胞培养技术课程进行初步的教学改革探索,重点是在教学方法中积极引入"雨课堂"这种新兴的教学工具,以期提高细胞培养技术的课堂教学效果,最终培养医学院校本科生实践能力并符合未来医学工作的需求.

为了探讨小分子非编码RNA-126-3p在低氧预适应小鼠血液外泌体中的表达变化.小鼠随机分为常氧组(对照组)和低氧预适应组(实验组),提取血液外泌体总RNA进行高通量测序,选取差异表达miRNA,运用生物信息学方法分析生物学过程、分子功能、生物途径、信号通路及其直接作用的靶基因预测和分析.采用实时荧光定量PCR (Real time-PCR)技术检测miR-126-3p和直接作用靶基因的表达水平变化.根据高通量测序结果筛选出差异表达miR-126-3p作为候选基因,实时荧光定量PCR结果显示,外泌体miR-126-3p表达趋势与测序结果一致,相对常氧组,低氧预适应组中的表达量下降,筛选出低氧神经保护相关靶基因(HIF1α)并检测不同处理组中相对表达量呈下降趋势.低氧预适应下调miR-126-3p的表达,正调控靶基因HIF1α的表达.

目的 探索原肌球蛋白相关激酶B受体(TrkB)表达和TrkB信号通路活性在低频重复经颅磁刺激(rTMS)治疗癫痫大鼠过程中的变化以及作用机制.方法 构建匹罗卡品诱导的癫痫大鼠模型,采用低频rTMS(1 Hz)干预癫痫大鼠模型后,Western Blot检测TrkB受体全长型和截短型蛋白表达以及全长型TrkB信号通路磷酸化水平的变化情况;膜片钳检测神经元自发放电频率的变化情况.结果 经匹罗卡品诱导构建的癫痫大鼠模型,其神经元放电频率较对照组明显增加(P<0.05).与对照组相比,癫痫模型中全长型TrkB受体表达降低(P<0.05),而截短型表达升高(P<0.05),此外全长型TrkB受体磷酸化程度降低(P<0.05).低频rTMS干预癫痫模型后,与癫痫组相比,全长型TrkB受体表达上调(P<0.05),截短型TrkB受体表达下调(P<0.05),全长型TrkB受体磷酸化水平上调并激活TrkB信号通路(P<0.05).最终,癫痫模型经低频rTMS干预后,其自发放电频率明显降低(P<0.05).结论 低频rTMS可能是通过上调癫痫模型中低表达的全长型TrkB受体,下调高表达的截短型TrkB受体,并激活全长型TrkB信号通路,最终发挥其抗癫痫作用.

目的 探究BDNF、TrkB受体及BDNF/TrkB信号通路在急性低氧与低氧预适应小鼠中的表达变化及作用,进一步完善低氧预适应神经保护的分子机制,为低氧预适应的临床应用提供理论依据.方法 以ICR小鼠为对象,分别构建急性低氧与低氧预适应小鼠模型,模型构建完成0～4 d后,通过Western blot、real-time PCR技术,检测小鼠海马脑区BDNF、TrkB受体在早期相和晚期相的表达及BDNF/TrkB信号通路活性的变化.结果 研究发现随着小鼠低氧次数的增加,耐受时间明显增加(P<0.05);较对照组,急性低氧和低氧预适应组BDNF及全长型TrkB受体表达有增加的趋势,在低氧预适应早期相BDNF蛋白水平表达显著增加(P<0.05).较对照组,截短型TrkB受体表达则有降低的趋势,在低氧预适应中、晚期相其mRNA表达显著降低(P<0.05);较对照组,急性低氧组BDNF/TrkB信号通路活性被抑制,而低氧预适应组BDNF/TrkB信号通路活性有增加的趋势,且在晚期相差异有显著性(P<0.05).结论 低氧预适应可能是通过上调BDNF表达并增加其与TrkB受体的结合,以及下调截短型TrkB受体表达,减少异二聚体形成,从而共同激活BDNF/TrkB信号通路,最终对小鼠产生神经保护作用.

混合式教学已成为当前信息化教学背景下的主流教学模式.为适应高等教育模式的变革,赵昆激发学生学习生理学知识的主观能动性,生理学教学团队精心设计并组建了网络教学资源库.通过对资源库建设的主要内容和实施策略进行总结,为今后开展线上线下相结合的混合式教学实践,进一步提高教学改革水平奠定基础.