以合成沙丁胺醇(SAL)完全抗原为基础获得针对SAL的多克隆抗体,建立检测SAL的间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法,为进一步开发SAL快速检测试剂盒奠定基础.为此,分别用混合酸酐法和活化酯法制备SAL-BSA免疫原和SAL-OVA检测原,免疫新西兰大白兔获得SAL多抗血清,建立检测SAL ic-ELISA检测方法.结果显示,成功合成了 SAL-BSA和SAL-OVA,其偶联比分别为17 ∶ 1和6.4 ∶ 1;免疫后兔血清抗体效价为1 ∶ 102 400,所建立ic-ELISA的半数抑制浓度(IC50)为24.84 μg/L,最低检测限(IC10)为0.78 μg/L,线性范围IC20～IC80为 3.16μg/L～80.1 μg/L;精密度(CV)％＜10％,回收率在98％～110％之间.特异性鉴定结果显示,SAL多抗血清除与侧链上含有叔丁基官能团的结构类似物具有较强的交叉反应外,不存在与其他同类分子的交叉反应.以上结果表明,成功建立了检测SAL的ic-ELISA检测方法,为进一步开发SAL快速检测试剂盒奠定了基础.

免疫系统中基因的精确表达和调控是生物体产生对病原体强大免疫能力及限制自身免疫的重要因素.越来越多的研究表明,长链非编码RNA(lncRNA)与免疫功能密切相关,能够通过调控免疫细胞分化发育以及免疫细胞效应功能参与免疫反应的调节.论文结合lncRNA调控作用的分子机制,阐述相关lncRNA在免疫应答和免疫调节过程中发挥的生物学效应,以期为从事lncRNA调控免疫应答机制研究提供参考.

为研究胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,TECs)中雌激素(estradiol,E2)对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达的调节作用,本研究首先培养小鼠胸腺髓质上皮细胞系1(medullary thymic epithelial cell line 1,MTEC1),经50 nmol/L E2作用24 h后,观察对细胞表型变化的影响,并用CCK-8试剂盒检测细胞活力;提取细胞总RNA,运用实时荧光定量PCR技术验证E2对lncRNA-2410006H16Rik表达的调节作用;最后运用RT-PCR技术扩增其目的基因,构建pEGFP-N1-lncRNA-2410006H16Rik重组过表达载体.结果显示,50 nmol/L E2能够明显抑制MTEC1的增殖,且相较于对照组细胞,50 nmol/L E2处理组细胞的D450nm值极显著降低(P＜0.01),表明其细胞活力极显著下降.实时荧光定量PCR结果显示,在E2作用下,lncRNA-2410006H16Rik在MTEC1细胞中的表达极显著上调(P＜0.01),约是对照组的2倍,与高通量测序结果一致.经RT-PCR、双酶切及测序结果分析显示,试验成功构建pEGFP-Nl-lncRNA-2410006H16Rik表达载体.结果表明,TECs中lncRNA-2410006H16Rik的表达与E2作用密切相关,为后续在细胞水平上进一步验证lncRNA-2410006H16Rik的调节功能奠定了基础.

为探讨3T3-L1前脂肪细胞增殖分化过程中Ghrelin对microRNAs(miRNAs)表达的影响,将pcDNA3.1(+)-Ghrelin转染至3T3-L1前脂肪细胞,real-time PCR检测10种miRNA的表达变化,并对显著差异表达的miRNA进行生物信息学分析.结果显示,pcDNA3.1(+)-Ghrelin的表达明显上调,约是对照组的5倍;real-time PCR结果显示,miR-125b-5p(P<0.05)表达显著上调,miR-21a-5p(P<0.01)、miR-30c-5p(P<0.05)、miR-181-5p(P<0.01)表达显著下调;生物信息学分析结果显示,预测调节的1062个靶基因与细胞的生长、分化和发育功能相关,核因子1 b(Nfib)是其共同调节的重要潜在靶基因;丝裂原活化蛋白激酶(MAPK signaling pathway)和成脂基因信号通路是其调节差异最为显著的信号通路,与脂肪细胞的增殖和分化密切相关.结果表明,Ghrelin可通过调节miRNA的表达影响3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化.研究结果为进一步探讨Ghrelin发挥效应的分子调节机制和分子调控网络奠定了基础.

为探讨猪瘟病毒(CSFV)感染PK-15细胞后的病毒增殖特点,以CSFV Shimen株细胞毒和PK-15细胞为研究材料,通过建立病毒感染细胞模型,将已感染靶细胞连续传至3代,采用IDEXX CSFV抗原检测试剂盒、反转录PCR(RT-PCR)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测CSFV复制水平和感染情况.结果表明,成功建立细胞感染模型且无细胞病变产生;CSFV抗原检测试剂盒和RT-PCR检测结果显示,随细胞传代次数的增加,CSFV复制水平明显提高;同代次细胞随培养时间的延长,CSFV复制水平也逐渐提高,且靶细胞的培养方式对CSFV的增殖效果有明显影响;IPMA检测结果表明,相同条件下,靶细胞对CSFV敏感性存在明显不同,随培养时间的延长,阳性细胞数量逐渐增加并且感染程度逐渐加强.以上结果表明,病毒感染时间、阳性细胞数量、培养方式及细胞敏感性是影响CSFV体外增殖效果的重要因素,研究结果为进一步提高CSFV体外增殖滴度奠定了基础.