将大熊猫源细小病毒VP2基因优化后克隆至pFastBac Dual载体,重组获得穿梭质粒rBacrnid-Panda-dVP2,转染Sf9细胞拯救获得表达大熊猫源细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒rpFBD-Panda-dVP2.rpFBD-Panda-dVP2感染Sf9细胞会形成明显的细胞病变,间接免疫荧光鉴定显示rpFBD-Panda-dVP2感染的Sf9细胞可见明显的绿色荧光.对感染细胞后收获的抗原进行Western blot鉴定,结果显示在约65 kDa处可见明显的目的蛋白条带;电镜下可见与天然细小病毒形态大小相似的粒子,表明rpFBD-Panda-dVP2感染昆虫细胞后可成功组装成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),获得的VLPs血凝效价可达1 ∶ 215.将大熊猫源细小病毒VLPs免疫幼猫后可诱导机体产生血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)抗体,HI效价最高可达1 ∶ 211,且保护性抗体水平可持续至少12个月.大熊猫源细小病毒VLPs的成功构建,为大熊猫细小病毒病新型基因工程疫苗的研制奠定基础,对防控大熊猫细小病毒病具有重要意义.

目的 优化生物反应器悬浮批次培养狂犬病病毒(rCVS-11-dG株)工艺,制备灭活免疫原,并检测其免疫原性.方法 摇瓶培养BHK-21细胞,优化rCVS-11-dG株病毒培养温度、接种MOI及接毒时初始细胞密度等病毒培养条件,使病毒与细胞相互适应,提高病毒滴度,为生物反应器培养病毒提供参数.在5L体积的生物反应器中,低血清悬浮培养BHK-21细胞,稀释传代并接毒,确定细胞培养阶段最适传代时间、病毒培养阶段最适收毒时间,利用优化后条件培养病毒,收获的病毒液经β-丙内酯灭活后,分别加入Gel(02)、PCP-2及铝胶佐剂,制备免疫原,分单次和2次免疫BALB/c小鼠,荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibody virus neutralization,FAVN)检测小鼠血清抗体效价.结果 rCVS-11-dG株狂犬病病毒在摇瓶中的最适培养条件为温度34℃,接种MOI = 0.01,接毒初始细胞密度3 × 106个/mL,接毒后48 h病毒滴度可达2 × 108.25 TCID50/mL.生物反应器中病毒最适培养条件为温度34℃,DO 40％,MOI =0.01,搅拌120 r/min,pH 7.4,接毒后108 h病毒滴度可达2 × 109 TCID50/mL.病毒液灭活后混合不同佐剂免疫小鼠,单次和2次免疫组小鼠首免后14 d抗体效价均高于0.5 IU/mL,2次免疫组小鼠免疫后28、42 d抗体水平均高于单次免疫组.结论 应用生物反应器培养工艺制备的灭活免疫原的病毒滴度高于摇瓶培养工艺,免疫小鼠后能产生高效价的中和抗体.本研究为生物反应器规模化生产狂犬病病毒及其灭活疫苗制备工艺的改进奠定了基础.

目的 探究犬细小病毒免疫球蛋白注射液的有效性.方法 将实验犬分为模型对照组、对症治疗组与球蛋白治疗组,所有犬同时进行人工感染犬细小病毒,在实验犬发病后根据每日的状态,对症治疗组与球蛋白治疗组进行相应的治疗,球蛋白治疗组除进行与对症治疗组相同的治疗外,加入犬细小病毒免疫球蛋白的注射治疗.每日观察临床症状并进行评分,采集肛拭子用胶体金抗原检测试纸判断粪便排毒情况;每日采血,进行血常规及血液生化检测,对检测结果及实验犬死亡后解剖结果进行分析,根据模型对照组对另外2个治疗组的治疗效果进行对比.结果 所有实验犬发病率100％,模型对照组的好转率为20％,对症治疗组的好转率为40％,球蛋白治疗组的好转率为80％.结论 通过人工感染模型与治疗组间的治疗效果对比,证实了犬细小免疫球蛋白注射液具有治疗犬细小病毒病的效果.

建立犬细小病毒(CPV)人工感染模型,掌握犬细小病毒病的发病规律,为治疗性药品的有效性评价提供对照.选取CPV抗体阴性健康比格犬20只,随机分为A、B、C、D4个稀释组,每组使用病毒液HA效价分别为213,210,27,24,以SD15株CPV作为攻击毒,稀释的病毒液每只犬分3次灌服15 mL.攻毒后,每日观察临床症状并进行评分、采集肛拭子用胶体金抗原检测试纸判断粪便排毒情况;每日采血,全血进行血常规及血液生化检测,血清进行抗体检测,对血象及部分生化指标进行分析.结果 显示,以HA价为27的病毒液作为发病模型的攻毒液时可使犬在攻毒后的4～5 d发病;发病率100％;临床症状评分逐日增加;在血常规检测中WBC先升高,然后下降;在生化检查中GLOB、tCO2均下降低于正常值;血清检测HI抗体结果由低至高,达到210;死亡率高达80％,即C组(27)为最适CPV发病模型组.本试验揭示了犬人工感染CPV的发病规律,为CPV治疗性药品有效性评价奠定基础.