目的:通过研究健脾益气摄血方对免疫性血小板减少症(Immune Thrombocytopenia,ITP)模型小鼠脑肠肽及T细胞相关细胞因子的影响,探讨健脾益气摄血方治疗ITP的效应机制.方法:以被动型免疫造模法建立ITP模型,实验前从 30只BALB/c小鼠尾静脉取血,用全自动血细胞计数仪检测血小板计数,按照血小板计数随机分为对照组、ITP组、泼尼松组和健脾益气摄血方中剂量组、高剂量组,每组 6 只.以酶联免疫吸附试验法检测小鼠脑、结肠及血清中 3 种脑肠肽和血清、脾T细胞相关细胞因子的水平.结果:与ITP组比较,除血清小鼠垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)外,泼尼松组3 种脑肠肽在3 种组织均升高;健脾益气摄血方中高剂量均可升高脑血管活性肠肽、结肠食欲刺激素和 3 种组织的PAC-AP水平.泼尼松组血清PACAP低于健脾益气摄血方中高剂量组.与ITP组比较,泼尼松降低血清、脾γ干扰素,升高血清、脾白细胞介素-2 和脾白细胞介素-4、白细胞介素-10;在血清、脾,健脾益气摄血方中高剂量组可升高白细胞介素-2、白细胞介素-10,降低白细胞介素-17A.处理组间对比,益气摄血方高剂量组血清白细胞介素-2、脾转化生长因子-β1 高于泼尼松组;益气摄血方高剂量组脾白细胞介素-17A低于泼尼松组.结论:健脾益气摄血方可从 3 个机制改善Th1/Th2 细胞、Th17细胞/调节性T细胞失衡治疗ITP.1)通过上调脑肠肽水平,改善脑肠轴介导的肠道免疫功能失调,降低Th1 细胞、Th17 细胞数量,升高Th2 细胞、调节性T细胞水平;2)通过抑制Th1 细胞分泌γ干扰素和Th17 细胞分泌白细胞介素-4、白细胞介素-10,促进Th2 细胞分泌白细胞介素-17A和调节性T细胞分泌转化生长因子-β1、白细胞介素-27,逆转Th1/Th2 细胞、Th17/调节性T细胞失衡;3)通过上调白细胞介素-2 水平改善调节性T细胞缺陷间接恢复Th1/Th2 细胞、Th17/调节性T细胞平衡.

目的 通过检测脑、结肠、血清中血管活性肠肽(VIP)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)水平,探讨强的松治疗免疫性血小板减少症(ITP)的潜在机制.方法 BALB/c小鼠18只,SPF级,体重18～22 g,雌雄各半,采用全自动血细胞计数仪检测血小板计数,依据血小板计数采用区间分组法随机分为正常组、模型组及强的松组,每组6只.正常组注射生理盐水,模型组和强的松组注射抗小鼠血小板血清(APS)复制ITP动物模型.强的松组在模型复制第8天起开始强的松干预,正常组和模型组则予以生理盐水;注射APS前、注射后第4天、实验第8天(给药第1天)、实验第12天(给药第5天)、实验第15天(给药第8天)动态检测血小板计数;实验结束后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测小鼠脑、结肠、血清中VIP、PACAP含量;用免疫组织化学法观察小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达的变化;原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡率的变化.采用ELISA检测小鼠脾脏中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17A(IL-17A)的水平.结果 与正常组比较,模型组及强的松组注射APS后,小鼠生命活力明显减弱,并于实验第8天出现皮肤渗血等现象;强的松组经药物干预后,小鼠饮食量和体重均增加,毛色恢复光亮,渗血点减少.实验各组小鼠注射APS前、注射后第4天、实验第8天(给药第1天)、实验第12天(给药第5天)、实验第15天(给药第8天)不同时间点的外周血小板计数比较:①不同时间点的外周血小板计数有差异(F =20.618,P =0.000);②3组的外周血小板计数有差异(F =59.621,P =0.000);③3组的外周血小板计数随时间变化趋势有差异(F =7.072,P =0.000).与正常组比较,模型组小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达升高(P＜0.05),淋巴细胞凋亡率升高(P＜0.05).与模型组比较,强的松组小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达降低(P＜0.05),淋巴细胞凋亡率降低(P＜0.05).与正常组比较,模型组小鼠在脑、结肠、血清中VIP、PACAP水平均下降(P＜0.05);与模型组比较,强的松组小鼠在脑、结肠、血清中VIP水平均升高(P＜0.05);强的松组小鼠在脑、结肠中PACAP水平均升高(P＜0.05).与正常组比较,模型组小鼠脾脏中IFN-γ、IL-17A水平均升高(P＜0.05),IL-4、IL-10水平均下降(P＜0.05);与模型组比较,强的松组小鼠脾脏中IFN-γ、IL-17A水平均下降(P＜0.05),IL-4、IL-10水平均上升(P＜0.05).结论 基于VIP/PACAP调节肠道免疫功能可能是强的松治疗ITP的潜在机制之一.

RATIONALE:Immune thrombocytopenia (ITP) is thought to be a result of immune dysfunction, which is treated by glucocorticoids such as prednisone. Vasoactive intestinal peptide (VIP) and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) have immunomodulatory properties, but their role in intestinal immune control is unclear. The major goal of this study was to look at the effects of prednisone on platelet, VIP, and PACAP levels in ITP mice, as well as the regulatory system that controls intestinal immunity.METHODS:Eighteen BALB/c mice were randomly divided into three groups: blank control group, model control group, and prednisone group, with six mice in each group. The ITP animal model control group and the prednisone group were injected with anti-platelet serum (APS) to replicate the ITP animal model. The prednisone group began prednisone intervention on the 8th day. Platelet count was dynamically measured before APS injection, on the 4th day of injection, on the 1st day of administration, on the 4th day of administration, and at the end of the experiment. After the experiment, the expression of p53 protein in mouse mesenteric lymph node lymphocytes was detected by immunohistochemistry. The changes in lymphocyte apoptosis rate in mouse mesenteric lymph nodes were detected by in situ terminal transferase labeling (TUNEL). The contents of VIP and PACAP in the mouse brain, colon, and serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The contents of IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17A in the mouse spleen were detected by ELISA.RESULTS:①Changes of peripheral platelet count: there was no significant difference in platelet count among the three groups before modeling; on the 4th day, the platelet count decreased in the model control group and prednisone group; on the 8th day, the number of platelets in model control group and prednisone group was at the lowest level; on the 12th day, the platelet count in prednisone group recovered significantly; on the 15th day, the platelet count in prednisone group continued to rise. ②Changes of VIP, PACAP: compared with the blank control group, VIP and PACAP in the model control group decreased significantly in the brain, colon, and serum. Compared with the model control group, the levels of VIP and PACAP in the brain, colon, and serum in the prednisone group were increased except for serum PACAP. ③Changes of mesenteric lymphocytes: the expression of p53 protein in the mesenteric lymph nodes of model control group mice was significantly higher than that of blank control group mice. After prednisone intervention, the expression of p53 protein decreased significantly.④Changes of cytokines in spleen: compared with blank control group, IFN- γ, IL-17A increased and IL-4 and IL-10 decreased in model control group. After prednisone intervention, IFN- γ, IL-17A was down-regulated and IL-4 and IL-10 were upregulated.CONCLUSIONS:Prednisone-upregulated VIP and PACAP levels decreased P53 protein expression and apoptosis rate in mesenteric lymph node lymphocytes and affected cytokine expression in ITP model mice. Therefore, we speculate that the regulation of intestinal immune function may be a potential mechanism of prednisone in treating ITP.

急性白血病是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病,过度增殖的白血病细胞能抑制正常造血细胞,造成不同程度的血红蛋白、白细胞、血小板下降而见贫血、出血、感染等临床症状[1].基于细胞形态学特征,将急性白血病分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)和急 性髓系白血病(acute mye loid leukemia,AML)[1].

目的 探讨健脾益气摄血方治疗原发免疫性血小板减少症(ITP)的可能效应机制.方法 30只BALB/c小鼠随机分为正常组,模型组,强的松组和健脾益气摄血中、高剂量组,每组6只.除正常组外,其余各组小鼠使用豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)注射法建立ITP小鼠模型.造模成功后第8天,正常组、模型组均予0.1 ml/10 g生理盐水灌胃,强的松组给予浓度为2 mg/ml强的松溶液0.1 ml/10 g灌胃,健脾益气摄血组中、高剂量组分别给予健脾益气摄血方颗粒剂4.1、8.2 mg/g灌胃.各组均每日1次,共灌胃8天.使用免疫浊度法检测小鼠肠黏液中分泌型免疫球蛋白A (sIgA)含量,免疫组化法检测小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达,TUNEL法检测小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡率,流式细胞术观察小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞周期的变化.结果 与正常组比较,模型组小鼠肠黏液中sIgA含量降低,肠系膜淋巴结淋巴细胞P53蛋白表达升高,淋巴细胞凋亡率升高(P＜0.01);与模型组比较,强的松组及健脾益气摄血中、高剂量组sIgA均升高,p53蛋白表达降低,淋巴细胞凋亡率均显著降低(P＜0.05或P＜0.01);健脾益气摄血高剂量组sIgA含量明显高于健脾益气摄血中剂量组和强的松组(P＜0.01),健脾益气摄血高剂量组和强的松组淋巴细胞凋亡率均低于健脾益气摄血中剂量组(P＜0.01);各组小鼠淋巴细胞周期分布差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 健脾益气摄血方治疗ITP效应机制可能与调控肠黏液中sIgA含量及肠系膜淋巴结淋巴细胞中P53蛋白表达,降低淋巴细胞凋亡率,改善肠道免疫功能有关,且具有一定的量效关系.

目的 观察丹参酮Ⅱa对HL-60的凋亡与自噬以及相关因子水平的影响,探讨丹参酮Ⅱa抗急性髓系白血病的分子机制.方法 使用不同浓度的丹参酮Ⅱa处理HL-60细胞24、48 h后用CCK-8法检测增殖抑制率,吉姆萨染色观察细胞形态,Western blotting检测Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP-1、p-AMPK、p-mTOR、LC3B水平变化,联用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1以CCK-8测细胞存活率.结果 以0、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L丹参酮Ⅱa处理HL-60细胞24、48h后HL-60增殖被抑制,其作用随浓度增加和时间延长而加强,24、48 h的IC50分别为32.87、18.4 μmol/L;吉姆萨染色镜下观察见,随着药物浓度增加HL-60凋亡增加;Western blotting显示Caspase-3减少、Cleaved-Caspase-3增加,PARP-1切割增加,凋亡增强;p-AMPK增加、p-mTOR减少、LC3B增加,显示AMPK/mTOR自噬通路激活,联用巴弗洛霉素A1后丹参酮Ⅱa增殖抑制作用减弱.结论 丹参酮Ⅱa通过诱导HL-60凋亡和自噬发挥抗白血病作用,AMPK/mTOR可能是介导这一效应的重要信号通路.

中医学认为脾是集合消化系统,并涉及其他脏器的重要功能单位,具有"主运化、主统血"的生理功能,并以升清为其主要生理特性.脾虚证是中医脾胃理论的重要组成部分,包括脾气虚、脾阳虚及脾虚兼证等多种证型,脾虚证的形成机制涉及众多物质及系统功能的改变[1].

原发免疫性血小板减少症(ITP)是一种以血小板减少为特征的自身免疫性疾病,其发病机制、发病原因目前尚未完全明确.ITP的中医病名为"紫癜病".陈信义教授团队认为ITP的病机为"脾气亏虚、脾不统血",拟定健脾益气摄血方,临床上取得良好疗效.并为此开展一系列临床和基础研究证实其免疫调控效果,以期阐明其具体起效机制.文章就陈信义教授在开展国家重点基础研究发展计划("973"计划)项目临床试验过程中对健脾益气摄血方治疗ITP研究所采用的免疫指标进行概括和讨论.

目的 观察益髓颗粒对低危、中危Ⅰ型骨髓增生异常综合征(MDS)患者贫血及相关症状的改善作用.方法采用随机双盲、安慰剂对照的研究方法,将48例低危、中危Ⅰ型MDS患者随机分为治疗组与对照组,各24例.治疗组在西医治疗基础上加用益髓颗粒,1袋/次,2次/d;对照组在西医治疗基础上加用安慰剂,1袋/次,2次/d.连续治疗8周后,分析2组治疗前后近期疗效指标,包括血常规、症状及疲乏程度.结果 治疗后治疗组血红蛋白(Hb)水平升高且高于对照组(P＜0.05),症状总有效率高于对照组(P＜0.01),症状总积分下降且低于对照组(P＜0.05),头晕症状较治疗前改善,气短、乏力、头晕、麻木症状改善均优于对照组(P＜0.01,P＜0.05),疲乏程度总有效率高于对照组,疲乏程度评分下降且低于对照组(P＜0.01).结论 益髓颗粒能升高低危、中危Ⅰ型MDS患者Hb水平,改善患者症状及疲乏程度.

目的 探讨靛玉红及丹参酮Ⅱa联用促进雄黄降解突变型PMLA216T-RARα的作用机制.方法 用不同浓度雄黄作用于野生型及突变型PMLA216T-RARα,观察2组细胞PML-RARα降解作用,验证PMLA216T-RARα存在砷剂耐药.根据CCK8测出的IC50值确定各组分浓度,使用不同浓度、不同组合的雄黄、靛玉红、丹参酮Ⅱa作用于转染PMLA216T-RAR1α 细胞,应用蛋白质印迹法检测单用、两两联合及三者联合对PML-RARα的降解及自噬相关因子(p-mTOR、LC3B)的作用.分别联用蛋白酶体抑制剂卡非佐米及自噬抑制剂巴佛洛霉素A1,应用蛋白质印迹法检测各组细胞中PML-RARα的降解情况.结果 与对照组(不用药物干预)比较,雄黄浓度为0.5 μmol/L,作用于PML-RARα野生型及突变型PMLA216T-RARα 时,均使PML-RARα发生了明显降解(均P＜0.01),突变型PMLA216T-RARα表达的PML-RARα均比野生型高(均P＜0.01).与对照组比较,雄黄4μmol/L、靛玉红8umol/L、丹参酮Ⅱa 8 μmol/L作用于PMLA216T-RARα时,均使PML-RARα发生降解(均P＜0.01),可降低p-mTOR水平(均P＜0.01),升高LC3B水平(P＜0.05,P＜0.01),雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红三者联合时上述作用最强(P＜0.01).与对照组比较,雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红、雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红+卡非佐米联用作用于PMLA216T-RARα时,均使PML-RARα发生明显降解(均P＜0.01);与对照组比较,单用卡非佐米、单用巴佛洛霉素A1、雄黄+丹参酮Ⅱa+靛玉红+巴佛洛霉素A1,作用于PMLA216T-RARα时,均使PML-RARα发生了明显蓄积,且雄黄+丹参酮 Ⅱa+靛玉红+巴佛洛霉素A1组PML-RARα表达高于单用卡非佐米及单用巴佛洛霉素A1组(均P＜0.01).结论 靛玉红及丹参酮Ⅱa联用可通过自噬增强雄黄对突变型PMLA216T-RARα的降解作用,三者联用自噬作用最强,可能为复方黄黛片治疗急性早幼粒细胞白血病的作用机制之一.

目的 构建PMLA216T-RARα过表达质粒,并研究雄黄对其蛋白产物的影响及机制.方法 通过资料库及文献获得PML、RARα的mRNA序列,以及PML-RARα[的融合位点.设计引物后,通过聚合酶链反应获得目的 片段,通过无缝克隆技术连接两个片段,插入突变,并与载体质粒相连接,测序验证.转染质粒至HL-60细胞,血清饥饿法处理24 h后用Western blot观察PML-RARα、p-mTOR、p62、LC3B水平变化;不同浓度的雄黄处理24 h后,用Western blot观察PML-RARα、p-mTOR、p62、LC3B水平变化.结果 测序结果显示质粒构建成功,序列符合预期设计.1、2、4、8μmol/L雄黄处理后PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα水平低于未经雄黄处理(0μmol/L)的PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05);0.5 μmol/L雄黄处理后PMLWT-RARα水平低于未经雄黄处理的PMLWT-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).相同浓度雄黄处理后PMLA216T-RARα水平高于PMLWT-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).5％ FBS和未经FBS处理的PMLA216T-RARα、p-mTOR水平低于10％ FBS处理的PMLA216T-RARα、p-mTOR水平,p62、LC3B水平高于10％ FBS处理的PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).4、8、16、32、64 μmol/L雄黄处理后PMLA216T-RARα水平低于未经雄黄处理的PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜ 0.05);8、16、32、64μmol/L雄黄处理后p-mTOR、p62水平低于未经雄黄处理的p-mTOR、p62水平,LC3B水平高于未经雄黄处理的LC3B水平,差异有统计学意义(P＜0.05);16 μmol/L雄黄处理后p-mTOR、p62水平低于8μmol/L雄黄处理后的p-mTOR、p62水平,LC3B水平高于8 μmol/L雄黄处理后的LC3B水平,差异有统计学意义(p＜0.05).结论 错义突变型PMLA216T-RARα过表达质粒构建成功,高浓度雄黄可能通过选择性自噬下调PMLA216T-RARα.

原发免疫性血小板减少症(ITP)是一种免疫介导的获得性血小板减少所致的出血性疾病,对于进行诊断再评估仍确诊为ITP、脾切除无效或术后复发的ITP称为难治性ITP.由于发病机制复杂,目前临床上难治性ITP尚无统一的治疗方案.利妥昔单通过杀伤功能异常的B淋巴细胞,缓解血小板破坏从而对ITP起到良好的治疗作用.文章从利妥昔单抗治疗难治性ITP的作用机制、临床方案及疗效研究等方面进行综述,以期促进利妥昔单抗在难治性ITP治疗中的进一步研究.