为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的间接ELISA方法,试验基于p72/p32基因序列,构建了重组质粒pCold-p72/p32,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导获得相应的重组蛋白,通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,利用Ni2+柱亲和层析法纯化p72/p32重组蛋白,并以此为包被抗原建立2种快速检测ASFV的间接ELISA方法,并对方法的临界值、有无交叉反应、重复性及敏感性进行了检测,并对来自不同猪场的临床样本进行验证性检测.结果表明:试验成功构建了重组质粒pCold-p72/p32,2种重组蛋白均能与ASFV阳性血清反应;p32以可溶性蛋白和包涵体蛋白形式表达,p72以包涵体蛋白形式表达.基于p32重组蛋白所建立的间接ELISA方法的临界值为0.543,基于p72重组蛋白所建立的间接ELISA方法的临界值为0.612;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10％;与猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等常见病原的阳性血清无交叉反应;与商品化的非洲猪瘟抗体试剂盒检测结果的符合率分别为95.1％和91.3％.说明试验建立的2种间接ELISA方法均具有良好的特异性、敏感性和重复性.通过比较,可以初步认为以p32重组蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测效果更好,可以用于猪血清样本中ASFV抗体的检测.

为了建立一种针对非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的血清学检测手段,参考ASFVPig/HLJ/2018株全基因组序列合成非结构蛋白B119L的基因序列,成功构建重组表达质粒pCold-Ⅰ-B119L,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达获得重组蛋白,利用纯化后的B119L重组蛋白作为诊断抗原,建立检测ASFV抗体的间接ELISA检测方法.结果显示:原核表达的B119L蛋白的分子质量为14.4 ku,与预期相符;以其为包被抗原建立的间接ELISA检测方法的批间及批内变异系数均小于10％;标准阳性血清的最低检测稀释度为1:5 120;对ASFV阳性血清具有特异性,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒阳性血清无交叉反应;该间接ELISA方法与商品化试剂盒的符合率为100％.本研究中建立的间接ELISA检测方法特异性、重复性、灵敏度良好,为ASFV的临床检测和流行病学调查提供了依据,对于预防ASFV的感染具有重要作用.

为了制备ANXA8膜联蛋白的多克隆抗体,本研究以PK-15细胞ANXA8基因为模板,通过RT-PCR扩增得到猪源ANXA8基因,并克隆到pGEX6p1载体.加入His-tag标签,成功构建了重组质粒pGEX6p1-ANXA8,鉴定正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,纯化后的重组蛋白利用SDS-PAGE、Western blot进行鉴定.以纯化后的重组蛋白作为抗原,免疫SPF级昆明鼠,获得针对ANXA8蛋白的多克隆抗体.经过ELISA检测,抗体效价达1 ∶25 600,经过Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测,抗体可以与ANXA8蛋白产生特异性结合反应.本试验成功地应用大肠杆菌表达ANXA8蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得鼠源阳性血清,为ANXA8蛋白结构及功能的研究奠定基础.

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)HLJ/2018株(GenBank登录号:MK333180)MGF360-11L核苷酸序列,合成MGF360-11L基因序列,将其克隆至pET-32a(+)载体.测序正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达与纯化,纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定.以纯化的MGF360-11L重组蛋白作为包被抗原,建立了检测ASFVMGF360-11L抗体的间接ELISA方法.用建立的间接ELISA方法与法国ID-Vet非洲猪瘟抗体检测试剂盒分别对192份临床血清样品进行检测比较,结果显示,该间接ELISA方法的特异性为91.6％,敏感性为92.1％,符合率约为91.7％.表明,该间接ELISA方法敏感性高、重复性好和特异性强,可初步用于临床血清样品非洲猪瘟抗体的检测,该方法的建立为ASFV的快速诊断提供了更多选择,对非洲猪瘟的防控提供了技术支持.

为了解2017-2019年广西猪伪狂犬病病毒(PRV)的流行和遗传变异情况,对2017年1月至2019年8月于广西各地区采集的284份疑似伪狂犬病发病猪临床样品进行检测和病毒分离,对分离毒株的gC、gG基因进行克隆、测序、遗传变异分析.被测样品中有85份阳性,阳性率为29.9％,从中共分离到10株PRV毒株,其中9株为国内变异毒株,1株为国内经典毒株.结果显示:广西地区流行的不同亚型PRV毒株在gC、gG基因上均存在相似的核苷酸和氨基酸变异特点,主要与国内变异株亲缘关系较近;广西地区PRV流行毒株主要为国内变异株.本研究结果丰富了广西PRV检测数据资料,为深入评估和预测广西PRV疫病的流行情况提供了可靠的数据基础.

本研究采用超高速离心法从人胚胎干细胞培养液上清分离提纯出外泌体,应用透射电镜、免疫印记和RT-PCR方法检测其生物学特性.结果 表明,在透射电镜下观察到人胚胎干细胞外泌体呈茶盏状,大小不均匀,直径30～100 nm,有完整的膜结构,内含低密度物质;人胚胎干细胞外泌体表达外泌体标志抗原CD63、TSG101和多能性转录因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4;干细胞外泌体呈剂量性依赖方式促进小鼠胚胎成纤维细胞增殖.本研究为进一步研究人胚胎干细胞外泌体的生物学特征和功能提供有价值的生物学信息.

Astroviral infection is considered to be one of the causes of mammalian diarrheal diseases. It has been shown that astrovirus infections cause varying degrees of diarrhea in turkeys and mice. However, the pathogenesis of porcine astrovirus is unknown. In this study, the virulence of a cytopathic porcine astrovirus (PAstV) strain (PAstV1-GX1) isolated from the PK-15 cell line was tested using seven-day-old nursing piglets. The results showed that PAstV1-GX1 infection could cause mild diarrhea, growth retardation, and damage of the villi of the small intestinal mucosa. However, all the above symptoms could be restored within 7 to 10days post inoculation (dpi). To evaluate the innate immunity response of PAstV in vivo, the alteration of inflammatory cytokine expression in piglets infected with PAstV1-GX1 was determined using quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The mRNA expression levels of the IFNβ and ISG54 were found to be significantly elevated in virus-infected piglets. In contrast, expression of IFNλ was downregulated in piglets infected with PAstV1-GX1. In addition, the mRNA expression of the tight junction protein 1 and 2 and zonula occludin 1, which are associated with the intestinal barrier permeability, were affected after PAstV1 infection. The present study adds to our understanding of the pathogenic mechanism of PAstV and has established an animal model for further study of pig astrovirus infection.