为了建立一种能快速鉴别猪日本脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的准确、高效的多重常规PCR检测方法,针对JEV、PRRSV、PPV、PRV基因保守区域合成特异性引物,优化后获得最优反应条件,对该方法特异性、敏感性、重复性进行了测定,并应用该方法对临床样品进行初步应用.结果显示,该方法对JEV、PRRSV、PPV、PRV可进行特异性扩增,对混合阳性质粒检测下限达2×106 copies/μL,对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒等相关病毒均无扩增,且重复性良好.用该方法检测51份2021年采集的广西区内组织样品,检出JEV、PRRSV、PPV、PRV阳性率分别为7.84％、50.98％、5.88％、23.53％,且存在多重混合感染的情况.所建立的多重PCR方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,可应用于临床常见猪繁殖障碍性病毒病的快速诊断和监测预警,为猪繁殖障碍性病毒病提供了诊断技术支持.

旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据.试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经诱导表达获得重组N蛋白,纯化后经Western blot方法检测其反应原性,免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法).结果显示:重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量,该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;Western blot结果显示,纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.制备的多克隆抗体的效价可达1:64 000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性.提示:PDCoV N蛋白抗原性好,可作为诊断试剂盒的候选抗原.

Pseudorabies virus (PRV) is an important pathogen that can cause harm to the pig population. Since 2011, there have been a number of large-scale outbreaks of pseudorabies on Chinese farms where animals had been vaccinated with the Bartha-K61 vaccine. In order to understand the epidemiological trend and genetic variations of PRV in Guangxi province, China, 819 tissue samples were collected from swine farms where PRV infection was suspected from 2013 to 2019, and these were tested for infectious wild strains of PRV. The results showed a positive rate of PRV in Guangxi province of 28.21% (231/819). Thirty-six wild-type PRV strains were successfully isolated from PRV-positive tissue samples, and a genetic evolutionary analysis was performed based on the gB, gC, gD, gE, and TK genes. Thirty of the PRV strains were found to be closely related to the Chinese variant strains HeN1-China-2012 and HLJ8-China-2013. In addition, five PRV strains were genetically related to Chinese classical strains, and one isolate was a recombinant of the PRV variant and the vaccine strain Bartha-K61. Amino acid sequence analysis showed that all 36 PRV strains had characteristic variant sites in the amino acid sequences of the gB, gC, gD, and gE proteins. Pathogenicity analysis showed that, compared to classical PRV strains, the PRV variant strains were more pathogenic in mice and had a lower LD50. Taken together, our results show that wild-type PRV infections are common on pig farms in Guangxi province of China and that the dominant prevalent strains were those of the PRV variants. The PRV variant strains also had increased pathogenicity in mice. Our data will provide a useful reference for understanding the prevalence and genetic evolution of PRV in China.

为了解广西猪群中猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫、猪圆环病毒病和伪狂犬病5种疫病的免疫水平及伪狂犬病病毒(PRV)感染状况,对2015—2021年广西地区1012个猪场送检的24263份血清样品进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)以及PRV-gB、PRV-gE抗体检测,并对这5种病毒的抗体阳性率按照不同年份、不同季节、不同地市和不同生长阶段进行统计分析.结果显示:2015—2021年送检猪场的CSFV、PRRSV、FMDV、PCV2、PRV-gB和PRV-gE抗体的场总阳性率分别为99.19％、96.09％、99.48％、99.71％、100％和49.87％,个体总阳性率分别为81.22％、76.51％、84.53％、89.43％、94.67％和20.58％.不同季节和不同生长阶段的抗体阳性率存在一定差异,其中CSFV、PRRSV、FMDV抗体春季的个体阳性率高于其他季节,PCV2和PRV-gB抗体个体阳性率夏秋季最高,保育猪的CSFV、PRRSV和FMDV抗体个体阳性率未达到70％.结果表明,广西猪群上述5种疫病的免疫效果总体较为理想,但PRRSV免疫合格率有待提高,猪群中仍存在一定的PRV野毒感染,且不同生长阶段、不同季节的免疫水平有一定差异.因此,应制定科学的免疫程序,持续加强免疫和监测,及时淘汰PRV野毒感染猪,降低上述5种疫病的发生风险.

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达纯化的PEDV S2重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PEDV重组S2蛋白的间接ELISA抗体检测方法.结果显示,重组蛋白抗原最佳包被量0.8 μg/孔;血清最佳稀释倍数为1 ∶40,最佳血清孵育时间为120 min;酶标二抗最佳工作浓度为1 ∶4000,最佳二抗反应时间为45 min;最佳底物显色时间为15 min;待检血清样品S/P值＞0.212时判定为阳性,待检血清样品S/P值＜0.188时判定为阴性,当0.188≤待检血清样品S/P值≤0.212时判定为可疑.以S2蛋白作为包被抗原建立的PEDV抗体间接ELISA方法仅对PEDV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪丁型冠状病毒等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性.该方法检测灵敏度较高、重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于10％.利用本研究建立的PEDV S2蛋白间接ELISA抗体检测方法对广西地区不同阶段猪群血清样品共计622份进行检测,总体样品阳性率为76.05％,不同阶段阳性率相差较大.本实验建立的ELISA方法可应用于临床样品PEDV抗体检测以及PEDV血清流行病学调查.

2020年10月份—2021年2月份,广西某养鸽场鸽群陆续出现乳鸽及种鸽死亡、鸽胚孵化率降低、部分种鸽有神经症状等情况,为了查找病因、确定诊治方案、降低经济损失,通过病史及用药史询问了解鸽群基本情况,采用临床检查、RT-PCR、血凝抑制试验、显微镜镜检及细菌分离鉴定等方法对病鸽进行综合诊断,并采用药敏试验选择有效药物,根据综合诊断及试验结果,对鸽场患病鸽群进行针对性防治并提出鸽场合理化防控建议.结果表明:该鸽场患病鸽确诊感染鸽Ⅰ型副黏病毒(pi-geon Paramyxo virus Ⅰ,PPMV-Ⅰ),并发感染大肠杆菌、沙门氏菌和毛滴虫,分离菌株的混合菌液对亚胺培南、头孢替坦、多黏菌素B、米诺环素、美罗培南、链霉素、阿米卡星高敏.通过对鸽群进行新城疫疫苗紧急免疫,对发病鸽群进行敏感药物系统治疗并辅以鸽舍消毒和杀菌,鸽群恢复正常,鸽场疫情得到有效控制.说明该鸽场鸽群感染了 PPMV-Ⅰ、大肠杆菌、沙门氏菌和毛滴虫,提示鸽场需提高生物安全意识,做好各类病原的防控措施及免疫程序.

为建立快速、准确的猪丁型冠状病毒(PDCoV)抗体ELISA检测方法,本研究以重组蛋白N作为包被抗原,建立了 PDCoV间接ELISA抗体检测方法.结果显示,经条件筛选,确定了该ELISA最佳反应条件:重组蛋白每孔包被0.2 μg;待检血清1:80稀释,孵育60 min;酶标二抗1:4 000稀释,反应30 min;底物显色10min.待检血清样品S/P值＞0.200时判定为阳性,S/P值＜0.173时判定为阴性,S/P值介于0.173和0.200之间则判为可疑.特异性试验结果表明,该检测方法不与HCV、FMDV、PRRSV、PRV、TGEV和PEDV的阳性血清发生交叉反应;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.79％～4.75％,批间变异系数在1.92％～6.60％之间,表明重复性良好;敏感性试验结果显示,该方法可检测到血清最大稀释度为1:320.符合率试验结果显示,本方法与中和试验检测结果符合度高,阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为86.36％、96.43％和92.00％.利用本研究建立的ELISA方法对456份采自广西地区不同阶段猪群的血清样品进行检测,结果显示,总体样品阳性率为40.40％,不同阶段猪群抗体阳性率有较大区别,后备母猪的阳性率可高达100％,保育猪阳性率最低仅为3.90％.

为了解广西猪场伪狂犬病毒(PRV)感染和免疫状况,2017年1月—2020年12月,对部分猪场随机采样送检的血清样品,应用ELISA方法开展PRV血清抗体检测,并对检测结果进行不同年份、不同季节、不同地区、不同生长阶段猪群的统计分析.结果显示:从时间分布上看,2018年PRV gE抗体场阳性率(57.71％)和个体阳性率(24.75％)均最高,此后呈逐年下降趋势,其中个体阳性率下降明显(P<0.05),2020年下降至6.14％;各年间的PRV gB抗体场合格率差异不显著(P>0.05),均在90％以上,而2019年的个体阳性率(88.71％)最低,与其他年份差异显著(P<0.05).冬季PRV gE和gB抗体个体阳性率最低,分别为14.96％和89.35％,与其他季节差异明显(P<0.05);冬季gE抗体场阳性率(42.97％)最低,与春季、秋季差异不显著(P>0.05),但显著低于夏季(P<0.05),而gB抗体场合格率一年四季差异不显著(P>0.05),均在95％以上.从空间分布上看,广西14个地市猪场均存在不同程度的PRV野毒感染,其中玉林市最严重,场阳性率和个体阳性率分别为69.51％和35.86％,而钦州市最轻,分别为16.67％和4.07％;PRV gB抗体个体合格率普遍较高,均在84％以上.从不同生长阶段猪群上看,后备母猪、育肥猪PRV gE和gB抗体个体阳性率均显著低于其他生长阶段猪群(P<0.05),其中gE抗体个体阳性率在13％以下,而gB抗体个体阳性率不足80％.结果表明,近年广西规模猪场PRV野毒感染率较高,而疫苗免疫并不能完全阻止野毒株感染.建议通过PRV净化和提高规模猪场生物安全水平等措施来控制其流行.本研究为制定合理的猪伪狂犬病防控与净化策略提供了依据.

2018年5月,广西某县某猪场突然有70多头35日龄猪发病,病猪症状为消瘦、腹泻、气喘、腹式呼吸,其中20多头猪病死.病死猪剖检病变为淋巴结肿大、出血;肺充血、出血,与胸膜粘连;肝充血;脾有梗死点;肾充血,表面有散在的出血点;膀胱黏膜有散在的出血点.应用抗生素对病猪进行治疗无效.该猪场将其中5头病死猪每头分别采取淋巴结、肺、肝、脾、肾等病料送实验室检测.

为了解2017-2019年广西猪伪狂犬病病毒(PRV)的流行和遗传变异情况,对2017年1月至2019年8月于广西各地区采集的284份疑似伪狂犬病发病猪临床样品进行检测和病毒分离,对分离毒株的gC、gG基因进行克隆、测序、遗传变异分析.被测样品中有85份阳性,阳性率为29.9％,从中共分离到10株PRV毒株,其中9株为国内变异毒株,1株为国内经典毒株.结果显示:广西地区流行的不同亚型PRV毒株在gC、gG基因上均存在相似的核苷酸和氨基酸变异特点,主要与国内变异株亲缘关系较近;广西地区PRV流行毒株主要为国内变异株.本研究结果丰富了广西PRV检测数据资料,为深入评估和预测广西PRV疫病的流行情况提供了可靠的数据基础.

为了查清引起母猪流产的原因,从送检流产胎儿的内脏组织中分离培养细菌,对分离菌株进行革兰氏染色镜检、药敏试验、生化试验、16S rDNA基因序列测定、同源性分析及系统进化树构建.结果表明,分离菌株为革兰氏阳性球菌,其生长特性、菌落特征、生化试验鉴定结果基本符合《常见细菌系统鉴定手册》中溶血葡萄球菌的生化特性;但在血琼脂培养基上并未出现溶血现象.药敏试验结果表明,分离菌株仅对新生霉素、利福平和米诺环素敏感,对青霉素类、头孢类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等药物严重耐药.分离菌株16S rDNA基因与12株不同来源的溶血葡萄球菌同源性在99.8％～99.9％之间,与溶血葡萄球菌MER TA39菌株(KT719446.1)遗传进化距离最相近.小鼠致病性试验表明,分离菌株能导致小鼠出现行动迟缓、扎堆和被毛燥乱等临床症状,并能从小鼠体内分离出相同形态特征和菌体特征的菌株.表明从猪流产胎儿体内分离到的菌株是存在多重耐药性的γ-溶血葡萄球菌.

为进一步了解近年广西猪场蚊媒携带乙型脑炎病毒(JEV)情况,采用套式RT-PCR(RT-nPCR)检测方法,于2016年—2019年间对猪乙型脑炎(JE)确诊阳性病例的部分猪场进行蚊子携带JEV情况初步检测调查.对抽选16个有JE阳性病例的猪场捕捉的蚊子进行JEV检测,结果均为阳性.表明广西猪JE确诊阳性病例猪场的蚊子携带JEV的几率很高.

为掌握广西地区导致猪群腹泻的主要病毒性病原的流行态势,为养殖场猪病毒性腹泻的综合防控提供依据,用实时荧光RT-PCR检测方法,对2017年1月—2021年6月广西14个地市489个猪场1206份临床腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)等病原检测,并分析其阳性检出率在不同年份、季节、地区、年龄段猪群之间的差异以及病原混合感染情况.结果显示,2017—2021年,PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV样品阳性检出率分别为49.67％、7.63％、4.56％和0.33％,场阳性检出率分别为53.37％、8.18％、8.18％和0.61％;病毒性腹泻病原有一定的季节性流行特征,多表现为冬、春季流行加重;PEDV、PDCoV普遍流行,PoRV局部流行,TGEV散发流行;4种病原对不同年龄段腹泻猪群的感染率存在差异,其中对哺乳仔猪危害最为严重;猪群以单一感染为主,主要为PEDV单一感染,阳性检出率为47.93％,混合感染均为二重感染且感染率较低.结果表明,导致广西地区猪群腹泻的主要病毒性病原主要为PEDV、PDCoV和PoRV,其中PEDV为最主要病原,其他病原也呈流行加重趋势,需进一步加强病原监测和疫病综合防控.

试验研究精准饲养对生长育肥猪生长性能和血液指标的影响.试验共120头生长育肥猪,分为4组,每组3个重复,每个重复10头猪.1、2组按三阶段模式饲喂,3、4组采用精准饲养模式,试验期136 d.结果 显示,精准饲养组体重、背膘、平均日增重均极显著提高(P＜0.01),料重比极显著降低(P＜0.01),血清尿素氮含量显著降低(P＜0.05).4组育肥猪的碱性磷酸酶(ALP)活性显著高于1组(P＜0.05).各组间育肥猪总蛋白、磷、甘油三酯、血糖、免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量差异不显著(P＞0.05).每千克增重成本分别降低0.256、0.487、0.681元.研究表明,精准饲养可以改善生长育肥猪的生长性能,提高饲料转化率,降低生产成本.

筛选优质鸡源益生菌菌种,为畜禽微生态制剂的研发提供优质的菌株来源,为开发禽用微生态制剂提供安全高效菌种资源和理论支撑.试验以健康鸡肠道为分离材料,使用MRS培养基(乳酸菌细菌培养基)进行分离培养,并对分离菌株进行形态特征、生理生化鉴定及分子生物学鉴定.试验研究发现在鸡盲肠中分离获得一株细菌,鉴定为发酵乳杆菌,编号为J4.分离获得的菌株具有耐热、耐酸、耐胆盐等特点,同时对动物机体安全无毒,可作为鸡源发酵乳杆菌益生菌的优良候选株.

为了解广西近年猪伪狂犬病（PR）流行情况及猪伪狂犬病病毒（PRV）流行株gB、gE、TK基因的遗传变异特点,于2013—2018年采集广西各地区疑似PR发病猪靶组织714份,进行PRV的PCR检测及病毒分离鉴定,并运用DNAStar、MEGA 6.0等生物学软件对分离毒株gB、gE、TK基因进行遗传变异分析。结果显示:样品检测阳性率为24.5%（175/714）,共分离获得PRV流行株38株。受检猪群普遍存在PRV感染,经典毒株及变异毒株并存,而且以变异毒株为主。广西流行株不同亚群PRV在gB、gE、TK基因上均存在相同的氨基酸变异特点,与国内变异株亲缘关系较近。推测广西流行株存在两种不同重组变异形式产生的PRV重组毒株,分别为疫苗株gB基因和变异株gE基因重组产生的重组毒株,以及经典株的TK基因被疫苗株（HB98）的TK基因替换而产生的重组毒株。近年广西受检猪场较普遍存在PRV感染,而且PRV流行株以变异毒株为主,可能存在两种不同重组变异形式产生的重组毒株,猪场需重视及实施针对性PR免疫防控计划。

为建立一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)G1型/G2型感染的RT-PCR方法,基于PEDV的S基因和E基因序列分别设计了PEDV的分型引物和鉴别引物,经过敏感性试验、重复性试验等一系列反应条件的优化,成功建立了鉴别PEDV G1/G2型感染的双重RT-PCR方法;通过目的片段的数量来判断PEDV的感染类型,其中,PEDV G1型感染可扩增得到一条目的片段(249 bp),G2型感染扩增得到两条目的片段(840 bp和249 bp).利用该方法对采自广西不同地区的92份临床样品进行检测,结果显示,阳性样品55份,其中,G2型样品53份,G1型样品2份.结果表明该方法操作简易,具有良好的敏感性和特异性,能快速鉴别PEDV G1/G2型的感染.

为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为阳性标准品,通过优化反应条件,建立了检测PTV的RT-qPCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验.结果表明,该方法仅对PTV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒等常见猪病毒均无交叉反应.该方法的标准曲线Ct值与4.6×108～4.6×102拷贝/μL的质粒浓度范围具有良好线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.201 x logX+40.527,线性相关系数(R2)为0.996,检测下限为4.6 x 101拷贝/μL.对不同浓度的pMD18-PTV进行组内与组间重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于4.0％,具有良好的重现性.应用所建立的方法对235份临床猪腹泻样品进行检测,PTV阳性样品32份,样品阳性率为13.62％.本试验建立的RT-qPCR方法为PTV实验室检测及病毒研究分析提供了可靠的技术手段.

本研究旨在了解引起仔猪腹泻的主要病毒性病原感染情况及流行特点,为有效防控广西仔猪腹泻提供科学依据.试验采用RT-PCR/PCR检测方法对2016年3月至2019年2月广西14个地级市366个规模猪场送检的914份仔猪腹泻病料样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)检测,并分析其阳性率在不同年份、季节、地区之间的差异及病原混合感染情况.调查结果显示,PEDV、PDCoV、PRRSV、PoRV、PCV2、CSFV、PRV均存在不同程度的感染,其样品平均阳性率分别为59.74％、8.32％、7.77％、4.92％、3.72％、3.28％和2.08％,未检测出TGEV;PEDV已无明显季节性,一年四季均高发,即使在炎热的夏季,在感染猪群中也持续存在,PDCoV有明显的季节性,多发生在冬春寒冷季节;广西仔猪腹泻PEDV阳性率高,单一感染高达50.55％,仔猪腹泻混合感染情况也较多,其中以二重感染情况较为常见,同时也存在四重感染现象.结果 表明,广西腹泻仔猪存在7种病毒性病原不同程度感染情况,其中以PEDV导致的仔猪病毒性腹泻尤为严重,新发PDCoV阳性率仅次于PEDV,需重视并加强对新发PDCoV的防控.

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件,为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑.试验以10 L转瓶培养病毒,对接毒时细胞维持液中胰酶浓度(0、2、4、6、8和10 μg/mL)、细胞密度(40％、60％、80％、100％、200％)、接毒剂量(MOI分别为1、0.1、0.01和0.001)、吸附时间(0、30、60、90、120、240 min)、收毒时间(接毒后12、24、36、48、60、72 h)、维持培养温度(35、36、37和38℃)和转瓶转速(6、8、10、12、14、16 r/h)7个条件进行优化.结果 显示,PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为:细胞刚铺满单层时接毒,接毒量为MOI=0.01,维持液(无血清DMEM培养液)中胰酶质量浓度为6 μg/mL,不需吸附,维持培养温度为37℃,12 r/h旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液,效价可稳定达到106.50TCID50/0.1 mL.本试验为PEDV变异株大量培养提供了参考,为变异株疫苗研发奠定了基础.