Ген антимикробного пептида цекропина Р1 (СP1) встраивали в векторную плазмиду pPCV91 под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S), содержащего 4 энхансерных последовательности CaMV 35S и нетранслируемую лидерную последовательность РНК вируса табачной мозаики. С помощью полученного рекомбинантного вектора проведена агробактериальная трансформация растений табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун. Присутствие гена СР1 в геноме растений подтверждено методом полимеразной цепной реакции. Экспрессия гена СР1 в трансгенных растениях доказана вестерн-блот анализом и тестированием антибиотической активности растительных экстрактов. Уровень синтеза цекропина Р1 в различных линиях составлял 0.02–0.2% от общего растворимого белка листьев растений. Трансгенные растения проявляли по сравнению с контрольными растениями повышенную устойчивость к фитопатогенным микроорганизмам и к окислительному стрессу. Показано, что способность трансгенных растений экспрессировать цекропин Р1 передавалась потомству.

Получены и исследованы трансгенные растения рапса масличного (Brassica napus L.) с искусственным геном антимикробного пептида цекропина Р1 (сесР1). Агробактериальную трансформацию проводили методом вакуумной инфильтрации семян агробактериями GV3101(pMP90RK), содержавшими бинарный вектор pGA482::сесР1. Экспрессия гена сесР1 в канамицин-устойчивых растениях показана вестерн-блот анализом и подтверждена определением антимикробной активности растительных экстрактов. Полученные растения проявляли устойчивость к бактериальным и грибным фитопатогенам Erwinia carotovora и Fusarium sporotrichioides. Проведено сравнительное исследование фотосинтетической активности контрольных и трансгенных растений в условиях биотического стресса при заражении фитопатогеном E. carotovora. Установлено меньшее снижение скорости фотосинтеза у цекропин Р1-экспрессирующих растений в условиях заражения. Показана повышенная устойчивость сесР1-растений к окислительному стрессу, вызванному действием параквата. Полученные результаты указывают на возможность включения гена цекропина Р1 в интегральную антистрессовую защитную систему растений.

Transgenic plants of camelina (Camelina sativa (L.) Crantz) with the synthetic gene of antimicrobial peptide cecropin P1 (cecP1) were obtained. Agrobacterium-mediated transformation is performed using the binary vector pGA482::cecP1 by vacuum infiltration of flower buds. The presence of the cecP1 gene in the genome of plants was confirmed by PCR. cecP1 gene expression in transgenic plants was shown by Western blot analysis and by antimicrobial activity of plant extracts against the bacterial phytopathogene Erwinia carotovora. The plants of F0 and F1 generations had the normal phenotype and retained the ability to form viable seeds in self-pollination. cecP1 plants exhibit enhanced resistance to bacterial and fungal phytopathogens: Erwinia carotovora and Fusarium sporotrichioides. The increased sustainability of cecropin P1-expressing plants against salt stress is shown. The possibility of the integration of the cecP1 gene into the overall protective system of plants against biotic and abiotic stresses is discussed.

В обзоре рассмотрены основные стратегии получения биологически безопасных безмаркерных трансгенных растений и проанализированы их достоинства и недостатки. Кратко описаны системы позитивной и негативной селекции как более безопасные подходы выявления трансформантов. Описано использование методов ко-трансформации, транспозиции и сайт-специфической рекомбинации для получения безмаркерных растений. Особое внимание уделено новым подходам к созданию безмаркерных растений, изначально не содержащих селективных генов в своем геноме.

Исследовано взаимодействие растений табака (Nicotiana tabacum L.), томата (Lycopersicon esculentum Mill.), капусты (Brassica oleracea var. capitata L.), рапса (B. napus L.) и хрустальной травки (Mesembryanthemum crystallinum) с бактериями Pseudomonas aureofaciens, P. putida и Methylovorus mays in vitro и in vivo. Показана стабильная ассоциация этих микроорганизмов с растениями. Колонизированные растения отличались ускоренным ростом, лучшим укоренением, адаптацией к условиям in vivo и повышенной устойчивостью к бактериальным и грибным фитопатогенам Erwinia carotovora, Sclerotinia sclerotiorum и Phytophthora infestans. Растения, колонизированные бактериями с устойчивостью к канамицину и нафталину, проявляли стабильный рост на среде с этими соединениями. Полученные результаты указывают на перспективность использования полезных ассоциативных микроорганизмов для разработки методов защиты растений от биотических и абиотических стрессовых факторов.

Получены безмаркерные трансгенные растения табака с синтетическим геном антимикробного пептида цекропина Р1 (cecР1) под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Для трансформации был использован бинарный вектор pBM, не содержащий селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам для отбора трансгенных растений. Скрининг трансформантов проводили на неселективной среде методами детектирования цекропина Р1 в клетках растений, основанными на анализе антибактериальной активности растительных экстрактов и иммуноферментном анализе. Эффективность выявления трансформированных регенерантов двумя использованными методами составляет около 2%. Полученные безмаркерные растения проявляют значительное повышение устойчивости к микробным фитопатогенам – бактерии Erwinia carotovora и грибу Sclerotinia sclerotiorum. Таким образом, ген cecР1 можно использовать одновременно в качестве целевого гена и скринингового маркера. Обсуждается возможность применения гена cecР1 в качестве селективного гена для прямого отбора трансформированных растений.

Получены растения табака (Nicotiana tabacum L.) с геном HBsAg под контролем гибридного промотора (Aocs)3AmasPmas с регуляторными элементами агробактериальных генов октопинсинтазы и маннопинсинтазы и этого же промотора с интроном гена алкогольдегидрогеназы кукурузы adh1. Присутствие интрона гена adh1 не приводило к существенному изменению экспрессии гена НВsАg в растениях. Проведено сравнение уровня синтеза поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs-антигена) в трансгенных растениях, экспрессирующих ген НВsАg под контролем различных промоторов. Количество HBs-антигена в растениях с геном НВsАg под контролем агробактериальных гибридных промоторов (Aocs)3AmasPmas было максимальным в корнях растений и достигало 0.01% от общего количества растворимого белка. Количество HBs-антигена в растениях с геном НВsАg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты оставалось одинаковым во всех органах растений и достигало 0.06% от общего количества растворимого белка. На основе растений с геном НВsАg получены культуры каллусов и “косматых корней”, синтезирующие HBs-антиген.

В условиях солевого стресса при переключении С3-фотосинтеза на САМ-путь ассимиляции углекислого газа у факультативных галофитных растений Mesembryanthemum crystallinum уровень CpNpG-метилирования (N - любой нуклеозид) их ядерного генома в последовательностях CCWGG (W = А или Т) повышается в два раза и связан с гиперметилированием сателлитной ДНК. При этом картина метилирования последовательностей CCWGG в 5'-промоторной области гена фосфоенолпируваткарбоксилазы, ключевого фермента С4-фотосинтеза и САМ, и в ядерной рибосомной ДНК не изменяется. Таким образом, обнаружено специфическое CpNpG-гиперметилирование сателлитной ДНК в условиях экспрессии новой метаболической программы. Функциональная роль CpNpG-гиперметилирования сателлитной ДНК, по-видимому, связана с формированием специализированной структуры хроматина, одновременно регулирующей экспрессию множества генов в клетках растений Mesembryanthemum crystallinum при их адаптации к солевому стрессу и переключении на САМ-метаболизм.

HpaII/MspI blot-hybridization analysis of the 5'-end region of the calcitonin (CT) gene methylation in cells of bone marrow and peripheral blood of patients with acute lymphoblastic leukemias (ALL) has been carried out. ALLs are accompanied by hypermethylation of the inner cytosine in the CCGG sequences of this region of the CT gene. The level of hypermethylation of the CT gene corresponded to the degree of disease progression and malignancy. At a long-term remission, hypermethylation of the CT gene is not observed. In case of primary resistance or if the complete remission has not been achieved the CT gene remained hypermethylated. It has been shown that in relapse the normal CT gene methylation pattern reversed to hypermethylation. This phenomenon was detected 1-8 months before the obvious clinical and laboratory signs of the disease progression (relapse). The large size of abnormal HpaII-fragments of the 5'-end region of the calcitonin gene had a direct correlation with the malignancy status of ALL.