Амидазу Rhodococcus rhodochrous 4-1 иммобилизовали, используя ковалентное присоединение к активированному хитозану, физическую сорбцию на углеродсодержащих адсорбентах и образование поперечно-сшитых агрегатов фермента в отсутствие носителя. Проведен сравнительный анализ некоторых каталитических свойств свободной и иммобилизованной на хитозане амидазы. Показано, что фермент, ковалентно иммобилизованный на хитозане, сохранял 5060% исходной активности и обладал более высокой термостабильностью по сравнению с растворимой амидазой, а также сохранял более 20% активности на протяжении пяти 24-часовых циклов трансформации акриламида. Изучено влияние способов иммобилизации на стереоселективные свойства амидазы в модельной реакции трансформации рацемического лактамида до D- и L-молочной кислоты. Показано, что поперечно-сшитые агрегаты амидазы обладали высокой D-стереоселективностью (до 7794%). Максимальная энантиоселективность иммобилизованного фермента наблюдалась при 60°С.
Исследовано видовое разнообразие бактерий активного ила биологических очистных сооружений (БОС) г. Перми, трансформирующих цианопиридины и амиды пиридинкарбоновых кислот. Методом накопительных культур на минеральной среде с 3-цианопиридином как единственным источником углерода и азота выделены 32 клона грамотрицательных гетеротрофных бактерий, дающих умеренный рост при пересевах на жидкой и плотной синтетической минеральной среде с 3- и 4-цианопиридином. По результатам анализа секвенированых фрагментов гена 16S рРНК клоны с не менее, чем 99% гомологией отнесены к родам Acinetobacter, Alcaligenes, Delftia, Ochrobactrum, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Xanthobacter. Посредством ПЦР анализа было выявлено, что 13 из 32 изолятов имеют последовательности размером около 1070 п.н., гомологичные генам нитрилаз, ранее обнаруженным у Alcaligenes faecalis JM3 (GenBank, D13419.1). Способность трансформировать нитрилы и амиды при росте на минимальной солевой среде обнаружена у 9 клонов; Acinetobacter sp. 11h и Alcaligenes sp. osv трансформировали 3-цианопиридин до никотинамида, а подавляющее большинство клонов обладали амидазной активностью, которая составляла от 0.5 до 46.3 ммоль/г ч по ацетамиду и от 0.1 до 5.6 ммоль/г ч по никотинамиду. Подтверждена утилизация никотинамида штаммом A. faecalis 2, сопровождающаяся выделением в среду вторичного метаболита, с вероятностью 91% идентифицированного как додецил акрилат.
Изучено влияние адгезии клеток нитрилутилизирующих бактерий Rhodococcus ruber gt1 и Pseudomonas fluorescens C2 на содержание внутриклеточного АТФ сразу после адсорбции и через 2 и 2448 ч после перенесения адгезированных на углеродных носителях клеток в свежую питательную среду. Показано, что адгезия приводит к уменьшению концентрации АТФ в клетке на порядок и более, продолжающемуся в первые часы в свежей питательной среде, что может быть обусловлено энергетическими затратами на инициацию образования биопленки. Отмечено, что в суточных и двухсуточных биопленках происходит постепенное нарастание количества АТФ, рассчитанного на 1 мг адсорбированных клеток, что подтверждает их жизнеспособность.
The transformation dynamics of 2- and 4-cyanopyridines by cells suspended and adsorbed on inorganic carriers has been studied in the Rhodococcus ruber gt 1 strain possessing nitrile hydratase activity and the Pseudomonas fluorescens C2 strain containing nitrilase. It was shown that both nitrile hydratase and nitrilase activities of immobilized cells against 2-cyanopyridine were 1.5-4 times lower compared to 4-cyanopyridine and 1.6-2 times lower than the activities of free cells against 2-cyanpopyridine. The possibility of obtaining isonicotinic acid during the combined conversion of 4-cyanopyridine by a mixed suspension of R. ruber gt 1 cells with a high level of nitrile hydratase activity and R. erythropolis 11-2 cells with a pronounced activity of amidase has been shown. Immobilization of Rhodococcus cells on raw coal and Pseudomonas cells on china clay was shown to yield a heterogeneous biocatalyst for the efficient transformation of cyanopyridines into respective amides and carbonic acids.
Исследовано разнообразие бактерий, метаболизирующих нитрилы карбоновых кислот, в антропогенно-измененных почвах Пермского края. Разработаны эффективные способы селективного выделения культур, обладающих нитрилгидратазной и нитрилазной активностями. Установлено, что основная часть микроорганизмов, способных утилизировать нитрилы, представлена грамположительными нокардиоформными бактериями рода Rhodococcus. Изоляты, обладающие детектируемой нитрилазной активностью, были представлены также и грамотрицательными формами (грам-отрицательные аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки, роды Pseudomonas, Azomonas, Azotobacter, Acidovorax). Две ферментные системы гидролиза нитрилов имели 27% культур. Нитрилгидратазная и нитрилазная активности исследованных штаммов превышали аналогичную ферментативную активность бактерий, выделенных из почв естественной среды, что свидетельствует о процессах естественной селекции сапрофитной микрофлоры, проходящих в химически измененной почве.
