Одним из принципиальных отличий многих типов опухолевых клеток от клеток нормальных тканей является транслокация на поверхность плазматической мембраны ряда внутриклеточных протеинов, в частности белка теплового шока 70 кДа (HSP70). Продемонстрировано, что такая необычная поверхностная локализация HSP70 распознается цитотоксическими эффекторами иммунной системы и приводит к усилению их цитолитического действия на данные клетки-мишени. Механизмы этого взаимодействия до конца не раскрыты, однако феномен поверхностной локализации HSP70 на раковых клетках может быть использован для разработки новых подходов к противоопухолевой иммунотерапии. В то же время известно, что присутствие HSP70 на клеточной поверхности не является универсальным признаком раковых клеток. Многие разновидности опухолевых тканей не экспрессируют мембрано-ассоциированные HSP70, что ограничивает потенциальные клинические возможности указанных подходов. В связи с этим в качестве одного из перспективных направлений противоопухолевой иммунотерапии можно рассматривать направленную доставку на поверхность раковых клеток экзогенных HSP70 с целью привлечения и активации цитотоксических эффекторов иммунной системы. Для осуществления адресной доставки HSP70 в опухолевые ткани можно использовать молекулярные конструкции, содержащие рекомбинантные мини-антитела к опухолеассоциированным антигенам, в частности, к HER2/neu-антигену и другим маркерам, высоко экспрессирующимся на поверхности широкого спектра раковых клеток. С целью оценки возможности и эффективности применения указанного подхода, в данном исследовании были созданы двухмодульные рекомбинантные конструкции, содержащие в первом модуле мини-антитела к HER2/neuантигену, а во втором модуле - молекулу HSP70 или ее фрагмент. Избирательное взаимодействие белковых модулей обеспечивалось состыковочным звеном, образуемым входящей в состав молекулярной конструкции парой барназа:барстар - гетеродимером с уникально высокой константой взаимодействия. Результаты, полученные при тестировании указанных препаратов в моделях in vitro, продемонстрировали селективное связывание разработанных конструкций с опухолевыми клетками, экспрессирующими HER2/neu-антиген, и достоверное стимулирующее действие этих препаратов на цитотоксическую активность клеток-эффекторов иммунной системы по отношению к соответствующим клеткам-мишеням.

Рекомбинантные иммунотоксины представляются исключительно перспективными соединениями с точки зрения развития таргетного лечения опухолей с определенным молекулярным профилем. В работе исследованы свойства нового рекомбинантного иммунотоксина, специфичного к онкомаркеру HER2, полученного на основе антитела формата scFv и фрагмента РЕ40 псевдомонадного экзотоксина А (4D5scFv-PE40). Показаны высокая аффинность иммунотоксина к онкомаркеру, избирательность токсического действия в отношении HER2-гиперэкспрессирующих клеток и стабильность иммунотоксина при хранении. Значение IC50 иммунотоксина 4D5scFv-PE40 в отношении раковых клеток, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2, на 2.5-3 порядка ниже, чем в отношении клеток СНО, не экспрессирующих этот онкомаркер, и на 2.5-3 порядка ниже, чем значение IC50 свободного PE40 в отношении раковых клеток, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2. Полученные данные позволяют рассчитывать в перспективе на высокие значения терапевтического индекса иммунотоксина 4D5scFv-PE40 при использовании in vivo.

Актуальным направлением в современной медицинской диагностике является создание нацеленных на патологические мишени конструкций на основе фотолюминесцентных наночастиц, обладающих высокой фото- и химической стабильностью, а также спектрами поглощения и испускания фотолюминесценции в области «окна прозрачности» биоткани. В работе получена двухкомпонентная конструкция на основе антистоксовых нанофосфoров (НАФ) и противоопухолевых мини-антител 4D5scFv для селективного мечения клеток, гиперэкспрессирующих опухолевый маркер HER2, характерный для целого ряда метастазирующих опухолей человека. Высокоаффинная белковая пара барстар : барназа (Bs : Bn), обладающая чрезвычайной устойчивостью в широком диапазоне pH и температур, использована в качестве молекулярного адаптера, обеспечивающего самосборку двухкомпонентной конструкции. На клетках аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, гиперэкспрессирующих HER2, показана высокая избирательность связывания полученной двухкомпонентной конструкции 4D5scFv-Bn : Bs-НАФ с опухолевыми клетками. Предложенный подход позволяет получать аналогичные конструкции для визуализации различных специфических маркеров в патогенных тканях, в том числе в злокачественных новообразованиях.

Получен новый HER2/neu-специфичный рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-PE40, в котором антитело 4D5scFv (направляющий модуль) соединено с фрагментом псевдомонадного экзотоксина А (эффекторный модуль) в единую полипептидную цепь с помощью гибкого линкера. Полученный иммунотоксин сохранил специфичность и аффинность, характерную для исходного антитела 4D5scFv, и продемонстрировал высокую избирательную цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам, гиперэкспрессирующим онкомаркер HER2/neu. Результаты экспериментов in vitro на культуре клеток, а также in vivo, на животных-опухоленосителях, свидетельствуют о высоком потенциале 4D5scFv-PE40 для таргетной терапии опухолей с гиперэкспрессией HER2/neu.

Photosensitizer-antibody conjugates are successfully used for targeted elimination of cancer cells bearing specific membrane markers. This method is known as photoimmunotherapy. However, chemical conjugation of photosensitizer and antibody poses a number of complications such as low reproducibility, aggregation and unconjugated photosensitizer impurities. Here we report a fully genetically encoded photoimmunosensitizer, consisting of an anti-HER2/neu miniantibody 4D5scFv and a phototoxic fluorescent protein KillerRed. Both domains in this photoimmunosensitizer retained their functional qualities - high affinity for HER2/neu antigen and phototoxicity respectively. 4D5scFv-KillerRed fusion protein showed high specificity for HER2/neu-over-expressing cells and effectively lowered their viability upon illumination.

A recombinant scFv antibody against human spleen ferritin was expressed as a barstar-fused protein in Escherichia coli and in Nicotiana tabacum plants and suspension cell cultures. As demonstrated by immunoblotting with antibarstar antibodies, direction of the recombinant protein to the endomembrane system of plant cells ensured its stability and solubility. Production of the recombinant protein did not differ between parental transgenic plants and their first-generation progeny. Fusion with barstar allowed not only immunochemical detection of the recombinant scFv antibody, but also their purification from the plant material by affinity chromatography with barnase-His6 immobilized on a metal-affinity carrier.

A recombinant scFv antibody against human spleen ferritin was expressed as a barstar-fused protein in Escherichia coli and in Nicotiana tabacum plants and suspension cell cultures. As demonstrated by immunoblotting with antibarstar antibodies, direction of the recombinant protein to the endomembrane system of plant cells ensured its stability and solubility. Production of the recombinant protein did not differ between parental transgenic plants and their first-generation progeny. Fusion with barstar allowed not only immunochemical detection of the recombinant scFv antibody, but also their purification from the plant material by affinity chromatography with barnase-His6 immobilized on a metal-affinity carrier.