В работе представлен новый тип гибридных молекул, включающих красный флуоресцентный белок mCherry и 10-й домен фибронектина человека типа III (10Fn3) – один из альтернативных каркасных белков, на основе которого могут быть получены рекомбинантные аналоги антител различной специфичности. Сконструированы различные варианты гена, кодирующего гибридный флуоресцентный белок, и изучена их экспрессия в клетках Escherichia coli. Установлено, что расположение mCherry на N-конце гибридного белка и предложенная нами модификация его N-концевой аминокислотной последовательности способствуют увеличению выхода продукта экспрессии в растворимой форме. На основе предложенной конструкции получен гибридный флуоресцентный белок ChIBF, содержащий -интегринсвязывающий вариант 10Fn3, и продемонстрирована возможность его использования для визуализации -интегрина на поверхности эпителиальных клеток MDCK методом конфокальной микроскопии.

In the current paper we describe a new type of hybrid molecules including red fluorescent protein mCherry and 10th type III human fibronectin domain (10Fn3) - one of the alternative scaffold proteins which can be used for the construction of antibody mimics with various binding specificity. We have constructed different gene variants encoding for the hybrid fluorescent protein and studied their expression in Escherichia coli cells. It was shown that N-terminal position of mCherry and modification of its N-terminal amino acid sequence promotes efficientbacterial expression of the hybrid protein in the soluble form. On the basis of the proposed construction we have obtained the hybrid fluorescent protein ChIBF, containing alphaVbeta3-integrin binding vari- ant of 10Fn3, and demonstrated the possibility of its utilization for the visualization of alphaVbeta3-integrin at the surface of MDCK epithelial cells by confocal microscopy.

Получена и детально охарактеризована панель из 10 моноклональных антител против афлатоксинов B1, B2 и G2. Методами прямого, непрямого и конкурентного иммуноферментного анализа определены аффинность и кросс-реактивность этих антител. Проведено подробное изучение структуры генов моноклональных антител, клонированы и секвенированы вариабельные и константные участки их генов. Анализ нуклеотидных последовательностей подтвердил результаты изотипирования легких и тяжелых цепей антител, полученных методом ИФА. Получена бицистронная конструкция для экспрессии одного из антител в виде Fab-фрагмента в клетках Escherichia coli. Осуществлен биосинтез и проведено выделение рекомбинантного Fab-фрагмента из культуральной жидкости. Таким образом, в работе представлены и систематизированы данные, открывающие возможности как для создания систем детекции афлатоксинов с помощью полученных моноклональных антител, так и для получения рекомбинантных антител с измененными параметрами специфичности, с использованием методов белковой инженерии.

The tumor necrosis factor (TNF) is a proinflammatory cytokine that plays a pivotal role in the regulation of the human immune system. Studies of the TNF functional topography are a challenging task in bioengineering. We have produced genes encoding the peptides Dl (3-30), D2 (31-85), D3 (86-114), and D4 (115-157), which correspond to isolated fragments of the informational structure of TNF. These genes were expressed in E. coli cells at a high level in a soluble form. We have shown that hybrid proteins SD2 and SD4 tend to form soluble aggregates, which can be destroyed by urea treatment. Purified peptides Dl, D3, and D4 possess a similar secondary structure with dominating beta-structural elements. The analysis of the biological activity of these peptides has shown that they do not exhibit cytotoxic properties on L929 murine fibroblasts. The simultaneous addition of Dl with full-length TNF results in the concentration dependent suppression of TNF activity.

A panel of ten monoclonal antibodies to aflatoxins B1, B2, and G2 was produced and comprehensively characterized. The affinity and cross reactivity of these antibodies were determined using the methods of direct, indirect, and competitive ELISA. The structures of monoclonal antibody genes were comprehensively studied and the variable and constant domains of the antibody genes were cloned and sequenced. Sequencing analysis confirmed the results of isotyping the light and heavy antibody chains obtained by ELISA. Variable and constant fragments of the antibody genes were cloned into a bicistron expression vector for the recombinant Fab' fragment for one of the antibodies expressed in Escherichia coli and purified. Thus, data were obtained that can be useful for the development of an aflatoxin detection system on the basis of the described monoclonal antibodies and the creation of recombinant antibodies with changed parameters of specificity using protein engineering methods.