Транспортная РНК играет ключевую роль в жизнедеятельности клетки, обеспечивая процесс декодирования генетической информации в белковом синтезе. Как показывают последние исследования, молекула тРНК может выполнять другие функции благодаря процессингу. Расщепление пре-тРНК и зрелой тРНК приводит к образованию различных некодирующих РНК, среди которых так называемые половинки тРНК (tRNA halves), также известные как индуцированные стрессом РНК (stress-induced tRNA), tRNA-derived или tiRNA. Описаны также меньшие фрагменты тРНК (tRFs). Характерным примером «двойного назначения» тРНК является разрезание активируемой при клеточном стрессе нуклеазой ангиогенин тРНК в антикодоновой петле с генерацией половинок, из которых 5’-фрагменты опосредуют временное выключение трансляции при стрессе. Ранее нами было впервые показано увеличение содержания tiRNA при остром стрессе эндоплазматического ретикулума и способность хронического стресса ЭПР приводить к формированию фенотипа клеточного старения. В работе с помощью высокопроизводительного секвенирования впервые анализируется профиль фрагментов тРНК при ЭПР-стресс-индуцируемом старении и сопоставляется с профилем при репликативном старении. Обнаружен ряд общих фрагментов тРНК для этих двух состояний. Они потенциально могут использоваться в качестве маркеров процессов клеточного старения. Transfer RNA plays a key role in the cell, providing the process of decoding genetic information. Recent research shows that the tRNA molecule can perform other functions due to processing. Cleavage of pre-tRNA and mature tRNA leads to the formation of various non-coding RNAs, among which are so-called tRNA halves, also known as stress-induced tRNA, tRNA-derived or tiRNA. Smaller tRNA fragments (tRFs) have also been described. A typical example of «dual purpose» tRNA is the cutting of tRNA in the anticodon loop by cellular stress-activated nuclease angiogenin, generating halves, of which the 5’ fragments mediate temporary translation shutdown under stress. Previously, we demonstrated an increase in tiRNAs during acute endoplasmic reticulum stress and the ability of chronic ER stress to lead to the formation of a cellular senescence phenotype. In this work, using high-throughput sequencing, the profile of tRNA fragments during ER stress-induced cellular senescence is analyzed for the first time and compared with the profile during replicative senescence. A number of common tRNA fragments have been found for these two conditions. They can potentially be used as markers of cellular senescence.

Стрессорные гранулы (СГ) - цитоплазматические рибонуклеопротеиновые ассоциаты, формирующиеся при остановке кеп-зависимой трансляции в эукариотических клетках под действием стрессорных факторов, таких, как повышенная температура, гипоксия, ультрафиолет и др. СГ могут также спонтанно собираться при повышении экспрессии их белковых компонентов. В данной работе были экспрессированы в клетках FRSN и EA.hy926 компоненты СГ - белки TIA1 и G3BP1, в виде слитых с флуоресцентным EGFP белком гранул, что позволило визуализировать динамику СГ. Нами обнаружена спонтанная сборка и стабильная персистенция СГ после трансфекции. Однако частота диссоциации СГ возрастала с увеличением времени от трансфекции. При стрессе ЭПР, индуцированном дитиотреитолом, число клеток с СГ возрастало, однако, как правило, это была поздняя нуклеация СГ, что мы предполагаем связанным с присоединившимися вторичными стрессовыми факторами на фоне стресса ЭПР. С учетом важной роли СГ в выживании клеток мониторинг СГ дает дополнительную информацию о механизмах клеточного стрессового ответа в культурах клеток FRSN и EA.hy926. Stress granules (SGs) are cytoplasmic ribonucleoprotein associates that are formed when the cap-dependent translation is attenuated in eukaryotic cells during cellular stress caused by elevated temperature, hypoxia, ultraviolet light, etc. SGs can also spontaneously assemble upon overexpression of their protein components. In this work, the SG components, TIA1 and G3BP1 proteins, were expressed in FRSN and EA.hy926 cells as a fusion protein with fluorescent EGFP, which enabled visualization of artificial SGs. We found spontaneous assembly and stable persistence of SG following the transfection. However, the frequency of SG dissociation increased with increasing time after the transfection. Under the ER stress induced by dithiothreitol, the number of cells with SGs increased. However, that was a generally late nucleation of SGs. This we assumed was related to secondary stress factors that had joined during oER stress. Given the important role of SGs in cell survival, monitoring of SGs provides additional information on the mechanisms of cellular stress response in FRSN and EA.hy926 cells.

Введение. Гипергомоцистеинемия (Ггц) - повышение уровня гомоцистеина в плазме крови выше 12 мкмоль/л - независимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний. Гипергомоцистеинемия, являясь сравнительно распространенным состоянием, ассоциирована также с рядом других патологий, таких как болезнь Альцгеймера, шизофрения, заболевания почек, остеопороз, инсулиннезависимый диабет. Повышенные концентрации гомоцистеина (Гц) способны вызывать клеточный стресс (окислительный, стресс эндоплазматического ретикулума), что может приводить к эндотелиальной дисфункции и клеточной гибели. Ггц может отягощать течение инфекционных заболеваний, но механизмы такой модуляции изучены недостаточно. Предполагается, что Ггц является одним из факторов неблагоприятного прогноза SARSCoV-2 инфекции. Цель исследования - изучение в эндотелиальных клетках механизмов действия гомоцистеина, липополисаридов, их комбинации, а также модулирующего действия фолиевой кислоты и витамина В12. Методика. Эндотелиоцитоподобные клетки EA.hy926 подвергали действию дитиотрейтола, гомоцистеина, липополисаридов, гомоцистеина в комбинации с липополисахаридами, с дополнительной инкубацией с витамином В12 и фолиевой кислотой или только фолиевой кислотой. Использовали ДНК-цитометрию для подсчета процента гиподиплоидных клеток, а также МТТ-тест для оценки цитотоксических эффектов. Методом ПЦР-РВ оценивали уровни экспрессии мРНК генов, вовлеченных в ответ клетки на стресс эндоплазматического ретикулума: BiP, XBP1 (общего и сплайсированной формы), IRE1, ATF6 в двух временных точках после воздействия - 6 ч и 24 ч. Результаты. Впервые показано, что совместное действие липополисахаридов и гомоцистеина приводит к увеличению активности пути IRE1-XBP1 - сигнальной ветви ответа на стресс эндоплазматического ретикулума. Являясь слабыми индукторами стресса ЭПР, липополисариды значимо потенцируют активированный гомоцистеином сигнальный путь IRE1-XBP1, что мы связываем с взаимодействием сигнальных путей врожденного иммунитета и ответа на стресс. Обнаруженное потенцирование может объяснять небольшое увеличение цитотоксичности при сочетанном действии Гц и ЛПС в связи с тем, что пролонгированная активность IRE1 обладает проапоптотическим действием. Впервые показано, что фолиевая кислота и витамин В12 снижают активность пути IRE1-XBP1 при действии гомоцистеина и ЛПС, а также дитиотрейтола. Заключение. В ходе исследования установлено значимое стимулирование сигнального пути IRE1-XBP1 комбинацией ЛПС и Гц, а также атеннюация этого пути фолиевой кислотой и витамином В12. Однако, потенцирование гомоцистеином цитотоксического эффекта ЛПС невелико. Хотя полученные в ходе данного in vitro исследования результаты не позволяют в полной мере рассматривать Ггц как фактор, усложняющий течение инфекционных заболеваний, состояние сосудистой системы и возрастающий риск ее дисфункции должны приниматься во внимание при выборе методов профилактики, терапии и прогноза течения инфекционных заболеваний на фоне гипергомоцистеинемии. Introduction. Hyperhomocysteinemia (HHcy) is a pathological condition described with high levels in plasma of homocysteine (Hcy), a nonprotein α-amino acid homologue of cysteine. It might cause oxidative and endoplasmic reticulum stress with resultant endothelial dysfunction and cell death. HHcy, that is a widespread condition, is associated with a number of other pathologies, such as Alzheimer’s disease, schizophrenia, kidney disease, osteoporosis, and diabetes. Early studies emphasize HHcy as one of the crucial and independent risk factors for development of cardiovascular disorders. Moreover, hyperhomocysteinemia can escalate the severity of infectious diseases and even appears as a potential marker for forecasting the course of SARSCoV-2 infection, as many patients are currently at risk for major clotting events once the infection is established. However, the mechanisms of these processes were poorly studied previously. Therefore, the major focus of this work is to study the mechanisms of actions of homocysteine and lipopolysaccharides (LPS) separately and combined together, and modulating actions of them by folic acid and vitamin B12 in endothelial cells. Methods. Endotheliocyte-like EA.hy926 cells were exposed to dithiothreitol, homocysteine, LPS, and Hcy in combination with LPS, with additional incubation with vitamin B12 and folic acid or folic acid alone.The DNA cytometry was performed to calculate the percentage of hypodiploid cells, and the MTT test was conducted to assess cytotoxic effects. RT-qPCR was done in order to evaluate the mRNA expression of the genes involved in the cell response to endoplasmic reticulum stress: BiP, XBP1 (common and spliced form), IRE1, ATF6 at two time points after exposure, 6 h and 24 h. Results. During our research, it was discovered that the coaction of LPS and Hcy increased the activity of the IRE1-XBP1 pathway, a signaling branch of ER stress. LPS, as weak inducers of ER stress, significantly potentiates the Hcy-activated IRE1-XBP1 signaling pathway. We interpret this event as the interaction of signaling pathways of innate immunity and stress response. The observed potentiation may explain the elevated cytotoxicity under the coaction of Hcy and LPS due to the proapoptotic effect of IRE1prolonged activity. In this paper, our research demonstrated that folic acid and vitamin B12 restrict the activity of the IRE1-XBP1 pathway under the action of Hcy and LPS as well as of dithiothreitol. Conclusion. A significant stimulation of the IRE1-XBP1 signaling pathway by a combination of LPS and Hcy, as well as attenuation of this pathway by folic acid and vitamin B12 have been shown. However, the potentiation of the cytotoxic effect of LPS by homocysteine is relatively small. Although the results obtained during this in vitro study do not let us to fully consider HHcy as a factor aggravating the course of infectious diseases, the state of the vascular system and the increasing risk of its dysfunction should be taken into account while choosing methods for the prevention, treatment and forecasting of the infectious diseases course against the background of hyperhomocysteinemia.

Эндотелиальные клетки, выстилающие стенки сосудов, преобразовывают деформацию собственных структур, вызванную током крови, в химические сигналы, одним из которых является важный регулятор просвета сосуда - оксид азота (NO). К настоящему моменту накоплен большой объём данных о клеточных механизмах активации продукции NO, однако сведений о динамике генерации оксида азота эндотелиальными клетками в зависимости от гидродинамических условий недостаточно. В этой связи разработка микрофлюидных систем in vitro, имитирующих кровеносное русло, и изучение в них эндотелия в сложных гидродинамических условиях является актуальной задачей. В данной работе для создания контролируемых гидродинамических условий для монослоя эндотелиоцитоподобных клеток EA.hy926 была спроектирована и разработана микрофлюидная система, имитирующая линейные участки микрососудистого русла. Методом непрямого определения содержания оксида азота (II) NO с использованием флуоресцентного зонда 4,5-диаминофлуоресцеина DAF-2 впервые получены данные об увеличении продукции NO клетками EA.hy926 при механическом стрессе, создаваемом потоком ростовой среды. Представлены расчетные гидродинамические характеристики микрофлюидной системы, а также методика измерения продукции NO. Возможность исследования функциональной активности эндотелия позволяет использовать разработанную микрофлюидную модельную систему как для изучения клеточно-автономных регуляторных свойств эндотелия при действии ряда вазоактивных фармакологических препаратов и других методов воздействия на эндотелий, так и при моделируемой дисфункции эндотелия. Endothelial cells lining vascular walls transform the flow-induced deformation of their own structures into chemical signals, one of which, nitric oxide (NO), is an important regulator of the vascular lumen diameter. By present, a large amount of data on cellular mechanisms for activation of NO production has been accumulated. However, there is insufficient information on changes in endothelial NO generation under different hydrodynamic conditions. Therefore, development of microfluidic systems that model blood vessels in vitro and using them to study the endothelium under complex hydrodynamic conditions are relevant tasks. In this study, a microfluidic system was developed to create controlled hydrodynamic conditions for a monolayer of endotheliocyte-like cells EAhy.926. This system simulates linear sections of the microvasculature. By indirect measurement of NO (II) content with a fluorescent 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) probe, we showed an increase in the NO production by EAhy.926 cells under mechanical stress generated by the medium flow. The article presents the method for measuring NO production and the calculated hydrodynamic characteristics of the microfluidic system. The results showed that the developed microfluidic model system is promising for studying cell-autonomous regulatory properties of the endothelium both under the action of vasoactive agents and in simulated endothelial dysfunction.