Introduction La BPCO est une maladie influencée par l’environnement et les modifications épigénétiques qu’il génère. Cette pathologie pourrait être le résultat d’un profond dysfonctionnement épithélial, probablement au niveau des sous-types de cellules Club, en réponse à un environnement toxique. Notre objectif est d’améliorer la réparation épithéliale des voies respiratoires de patients atteints de le BPCO, en greffant des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) prédifférenciées, provenant du même patient. Méthodes Des cellules épithéliales provenant de biopsies bronchiques ont été cultivées en interface air-liquide (ALI) puis ces épithéliums pseudostratifiés ont été lésés mécaniquement. Les cellules épithéliales dérivées d’iPSC provenant du sang de patient [1] ont été modifiées pour exprimer la GFP et après différenciation jusqu’au stade de maturation précoce vAFE (ventral Anterior Foregut Endodermis) ont été ajoutées à l’épithélium natif directement après la lésion, pour simuler un protocole de thérapie cellulaire. L’expression de la GFP, la TEER et la fermeture de la lésion ont été quantifiées à partir du jour de la greffe et pendant 42jours. Des marquages par immunofluorescence (GFP, EpCAM, eCAD, p63, tubIV) et un scRNAseq ont été réalisé pour identifier les types cellulaires. Résultats Les cellules GFP dérivées d’iPSC au stade vAFE ont été greffées avec succès au niveau du site de la lésion épithéliale de l’ALI. Cela a été confirmé au microscope optique à fluorescence avec l’expression de la GFP dès le lendemain de la greffe, qui progresse puis se stabilise jusqu’à couvrir plus de 50 % du puits à J42, témoignant de la viabilité et de la stabilité des cultures. La fermeture de la lésion est plus rapide en présence de greffe, atteignant 50 % dès J1 (contre 20 % sans greffe) et plus de 60 % à J2 (contre 40 % sans greffe) (Figure 1). Les expériences ont porté sur des épithéliums bronchiques de 25 patients (sains et BPCO), avec plus de 220 puits greffés et une prise de greffe de 100 %. L’immunofluorescence (Figure 2) a montré qu’à J7, les cellules GFP+ formaient des jonctions intercellulaires (E-Cadherin) avec les cellules GFP−. À J42, certaines cellules GFP+ exprimaient également des marqueurs de cellules basales (p63+) et ciliées (tubIV). Ces résultats ont été confirmés par scRNAseq (Figure 3) où la proportion de cellules basales et ciliées issues de la greffe (GFP+) étaient de 90 et 73 % respectivement. Conclusion Il est possible de réparer l’épithélium pathologique d’un patient atteint de BPCO à l’aide d’un épithélium dérivé d’iPSC. Les mécanismes de réparation pourraient fournir des pistes thérapeutiques, en ciblant l’épigénétique, et pourquoi pas, la thérapie cellulaire ?

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic disease caused by mutations that alter cilia beating, including in the respiratory airways. This results in poor mucus clearance, severe morbidity, and increased mortality. We hypothesized that bronchial cilia beating can be restored using genetically corrected iPSC differentiated into air - liquid interface bronchial epithelium model (iALI) for autologous cell therapy. We have previously demonstrated that corrected cells derived from a PCD patient iPS line can be differentiated into iALI with functional ciliary beating. The current aim of the project is to evaluate the engraftment potential of these corrected cells and their ability to repair the pathological model post-engraftment. Several key issues need to be addressed identifying competent cells for bronchial engraftment, exploring various strategies to pre-treat the bronchial epithelium, and assessing the recovery of the ciliary beating recovery to assure bronchial repair.Our team has established the differentiation of iPSCs into iALI. We have generated a PCD patient iPSC line using Sendai viruses, a corresponding CRISPR/Cas9 corrected cell line, as well a wild-type iPSC line and its CRISPR/Cas9 mutated counterpart. We also generated a GFP-iPSC line that expresses the fluorescent GFP protein under the human elongation factor 1 alpha promoter (EF1a), which allows us to track the engraftment of GFP-labeled bronchial stem cells in both control and mutated iALI models. Our results suggest that lung progenitors at the ventralized anterior foregut endoderm stage could be the most efficient cells for engraftment. Their self-renewal capability and ability to differentiate into various cell types of the bronchial epithelium are promising for developing a long-term and effective therapy. Regarding bronchial erosion, we found that promoting cell engraftment is crucial due to the barrier function of the intact bronchial epithelium and the lack of selective advantage of corrected cells. Various chemical and enzymatic strategies have shown potential, but their safety for in-vivo use needs further assessment. Furthermore, GFP-expressing engrafted cells displaying cilia suggest successful differentiation into ciliated cells, though functional recovery still requires confirmation.In conclusion, the engraftment of corrected lung progenitors into eroded bronchial epithelium appears to be a promising therapeutic strategy to PCD. Next step of the project involves developing this therapy for in-vivo application, assessing its safety and efficacy in an immunodeficient mini-pig model.

IntroductionDespite the new biologics to treat inflammation in severe asthma, targeting persistent obstruction of the airways remains challenging. Galectin-10 eosinophil derived crystals, also known as Charcot-Leyden crystals (CLCs) have been described to be present in the mucus plugs in the airways of patients with severe asthma. However, a direct role for CLCs in mucus production has not been established. We hypothesize that plugged airways constitute a unique niche where type 2 immune cells communicate with structural cells to perpetuate disease. We aimed to set up a new model using induced pluripotent stem cells (iPSCs).MethodsThree human iPSCs lines from type 2 severe asthma patients have been derived (MOSAIC study, University Hospital of Montpellier, NCT05616338) and differentiated into airway epithelium in air–liquid interface (i-ALI). The healthy iPSC line UHOMi002-A was used as a control. At day 21 of ALI culture, iPSC derived-airway epithelia were stimulated at the apical side with either IL-13 every two days (10ng/mL) during one week, acute stimulation (24h) with recombinant Gal10 crystals (100ng/mL), both IL-13 and Gal10 crystals or PBS (vehicle). We aimed to evaluate the effect on i-ALI differentiation at day 30.ResultsWe successfully differentiated the iPSC lines generated from the T2 severe asthma patients, and achieving a high purity rate at each developmental stages. The mean cell purity at the definitive endoderm for each cell line was>80% assessed by flow cytometry quantification of C-X-C Motif Chemokine Receptor 4 (CXCR4)/c-KIT double positive cells and immunolabelling of Forkhead Box A2 (FOXA2)+/SRY-box transcription factor 17 (SOX17)+. Purity for ventral anterior foregut endoderm (vAFE) stage was evaluated at 70%, through Transcription Factor NK2 Homeobox 1 (NKX2.1) expression, Carboxy Peptidase M (CPM) by flow cytometry. vAFE cells from the hiPSC lines differentiated into bronchial epithelium in air–liquid interface conditions. Chronic IL-13 challenging and CLC were both able to induce an increasing of MUC5AC+ cells and also an increase of neuroendocrine cells in asthmatic iPSC lines.ConclusioniALI bronchial epithelium can recapitulate T2 severe asthma features in vitro, and highlighted a possible direct effect of the CLC on the airway epithelium.

IntroductionLes maladies respiratoires sévères, dont l’asthme, nécessitent de nouveaux traitements car les traitements actuels sont encore inefficaces chez un certain nombre de patients. Notre projet vise à obtenir un modèle d’épithélium bronchique innervé par une innervation sensitive in vitro à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC).MéthodesNous avons synthétisé une matrice extracellulaire composée d’un mélange de collagène bovin de type I et de chitosan. Cette matrice est d’abord colonisée par des fibroblastes bronchiques humains primaires et agit comme une muqueuse sous-épithéliale. Des neurones sensitifs dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont cultivés sur la face inférieure de la matrice et un épithélium bronchique dérivé d’iPSC provenant des mêmes sujets est cultivé sur la surface, en interface air/Liquide (ALI), selon notre protocole décrit précédemment [1].RésultatsNous avons obtenu un épithélium bronchique dérivé d’iPSC présentant les principaux types cellulaires. Il repose sur une matrice extracellulaire épaissie par le collagène sécrété par les fibroblastes et présentant une lame basale. La coloration HES des coupes en paraffine montre un épithélium pseudostratifié avec différents types cellulaires bronchiques, y compris des cellules ciliées, Club, à mucus et basales. La coloration à l’acide périodique Schiff - Bleu Alcian permet de visualiser les cellules à mucus. Ces résultats sont confirmés par l’immunofluorescence de MUC5AC+. Les cellules ciliées sont TUBULINE ß IV+, les cellules basales Kératine 5+, les cellules club CCSP+, et nous avons également observé des cellules neuroendocrines chromogranineÀ+. Une innervation partielle est démontrée à l’intérieur de la matrice par immunofluorescence des neurones sensoriels dérivés des iPSC (TUBß3+). Pour essayer d’améliorer cette innervation, nous avons différencié et ajouté des cellules de Schwann dérivées d’iPSCS dans ce modèle car elles pourraient permettre le guidage des fibres nerveuses [2]. Les résultats préliminaires montrent une amélioration de l’innervation avec la présence effective de fibres nerveuses PGP9,5+ et TUBß3+ dans la matrice. La maturation de ces fibres sensitives et attestée par la présence de neuropeptides (fibres CGRP +).ConclusionEn conclusion, nous avons obtenu avec succès un épithélium bronchique humain dérivé d’iPSC en 3D reposant sur une muqueuse sous-épithéliale. Des différenciations sont en cours pour confirmer les résultats obtenus avec l’innervation et la fonctionnalité de notre modèle complet.

L’asthme est une maladie chronique inflammatoire des voies aériennes hétérogène. Parmi les patients atteints d’asthme sévère, un tiers présente une obstruction fonctionnelle persistante en lien avec une obstruction des voies aériennes par des bouchons de mucus contenant des mucines, de la fibrine et des cristaux de Charcot-Leyden dérivés d’éosinophiles. Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent cet endotype ne sont pas clairement compris. Le développement de nouveaux outils afin de modéliser l’asthme chez l’Homme sont nécessaires, du fait notamment des différences considérables qu’il existe entre l’épithélium des voies aériennes de l’Homme et celui des rongeurs. Nous avons montré, avec d’autres équipes, qu’il est possible de reconstituer in vitro un épithélium bronchique fonctionnel et mature à partir de cellules souches humaines pluripotentes humaines (hiPSC). Notre objectif est de mettre au point un modèle in vitro humain d’asthme sévère à partir des hiPSC afin de modéliser les modifications de l’épithélium bronchique ainsi que les bouchons de mucus.

Severe asthma patients with persistent airflow obstruction are characterized by functional obstruction due to mucus plugs containing mucins, fibrin, and eosinophil derived Charcot- Leyden crystals. The molecular mechanisms underlying this endotype are not clearly understood. Developing new models is crucial to respiratory research insofar as critical differences exist between human and rodent airway epithelium. We (and other teams) have shown that it is possible to reconstitute in vitro a complex and functional airway epithelium displaying all the features described in vivo from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC). Our aim is to establish a human in vitro model of severe asthma that will recapitulate airway epithelium remodeling and mucus plugs. (c) 2024 SPLF. Published by Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

L’asthme est une maladie respiratoire fréquente, sévère dans 3 à 5 % des cas. L’inflammation chronique de l’épithélium bronchique joue un rôle clé dans sa physiopathologie. Le système nerveux sensitif périphérique contribue à cette inflammation des voies aériennes via une activation par l’environnement bronchique. Cependant les mécanismes d’action mis en jeu ne sont à ce jour pas bien connus, notamment par manque de modèles fiables. Nous avons mis en place, à partir de cellules souches pluripotentes induites reprogrammées à partir de cellules sanguines, un modèle d’épithélium bronchique innervé par des neurones sensitifs. Ce dernier permettra notamment de mieux comprendre les mécanismes d’action sous-jacents à l’inflammation neurogène.

Asthma is a frequent respiratory disease, with severe asthma occurring in 3 to 5% of cases. Chronic inflammation of the bronchial epithelium is essential to its pathophysiology. When activated by the bronchial environment, the peripheral sensory nervous system contributes to inflammation of the airways. However, due to a lack of reliable models, the mechanisms of action remain largely unknown. Using induced pluripotent stem cells reprogrammed from blood cells, we have set up a model of bronchial epithelium innervated by sensory neurons. This model will ensure better understanding of the mechanisms of action underlying neurogenic inflammation.

Asthma is a frequent respiratory disease, with severe asthma occurring in 3 to 5% of cases. Chronic inflammation of the bronchial epithelium is essential to its pathophysiology. When activated by the bronchial environment, the peripheral sensory nervous system contributes to inflammation of the airways. However, due to a lack of reliable models, the mechanisms of action remain largely unknown. Using induced pluripotent stem cells reprogrammed from blood cells, we have set up a model of bronchial epithelium innervated by sensory neurons. This model will ensure better understanding of the mechanisms of action underlying neurogenic inflammation. (c) 2023 SPLF. Published by Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Background: Induced pluripotent stem cells (iPSC) provide a new approach to model COPD. We have generated a functional air-liquid interface bronchial epithelium from human iPSC (iALI) and focus on the characterization of both mesenchymal and epithelial iALI compartments before and after pollution exposure. Objective/Methods: To modelize COPD and study epithelial-mesenchymal crosstalk, we performed single-cell mRNA sequencing before and after exposure to calibrated PM2.5 pollutants (City of Prague 2005) in EpCAM+ vs EpCAM- sorted cells. RT-QPCR and immunofluorescence were used to assess the exposure process. Results: iALI contains all the bronchial epithelial cell subtypes such as ciliated cells, basal cells, neuroendocrine cells, club cells and goblet cells. Furthermore, an EPCAM-COL1A1+DCN+ stromal compartment is identified below the bronchial epithelial layer of iALI. It contains several cell populations such as 1/myofibroblasts characterized by contractile genes such as CCN1 and TAGLN and 2/ a transition population expressing epithelial to mesenchymal transition transcription factor SNAI2 and ZEB1/2. This stromal cell compartment expressed FGF10 while its receptor FGFR2 was expressed on the adjacent epithelium suggesting an epithelial-mesenchymal crosstalk. Under PM2.5 exposure, MUC5B was induced in the EpCAM+ sorted epithelial cells, while CYP1B1 was induced in the EpCAM- mesenchyme, suggesting an adaptive response to exposome. Conclusion: These data suggest that an epithelial-mesenchymal crosstalk is essential to iALI differentiation and maintenance. Furthermore, we show that iALI is a promising tool to model the adaptive response to exposome.

Le projet vise à obtenir un modèle d’épithélium bronchique innervé pour une application à l’asthme sévère, pour lequel les traitements sont souvent inefficaces. En effet, la construction d’un épithélium bronchique innervé devrait permettre la recherche de nouveaux médicaments via la reprogrammation des cellules circulantes de patients en iPSC afin d’obtenir un modèle personnalisé, permettant le criblage et l’étude pharmacologique pour une médecine ultra personnalisée. Le projet comprend en parallèle i) la construction d’une muqueuse sous-épithéliale innervée par des neurones sensitifs dérivée d’iPSC et ii) la différenciation d’iPSC en épithélium bronchique. La construction de la muqueuse sous épithéliale comprend la fabrication d’une matrice extracellulaire composée d’un mélange de collagène et de chitosan, et infiltrée par des fibroblastes bronchiques humains. Des neurones immatures sont ensuite ensemencés sous cette matrice où leur maturation en neurones sensitifs matures est induite pendant 14 jours. La différenciation d’iPSC en épithélium bronchique est faite suivant le protocole publié par l’équipe (E. Ahmed et al., 2020). Les résultats d’ensemencement des fibroblastes bronchiques humains dans les matrices montrent une colonisation effective des matrices collagène-chitosan. Le phénotype des neurones obtenus après différenciation a été validé par immunofluorescence par la présence des marqueurs Tubuline ß3 (neurone), substance P et neurofilament M (neurone sensitif). Les résultats de différenciation d’iPSC en épithélium bronchique sur la matrice montrent l’obtention d’un épithélium bronchique fonctionnel comportant des cellules basales kératine 5+ et des cellules multiciliées Tubuline IV+, et présentant un battement ciliaire. Un épithélium bronchique dérivé d’iPSC sur matrice collagène-chitosan-fibroblastes a été obtenu. Il reste à coupler cette construction cellulaire aux neurones sensitifs matures pour obtenir notre modèle final. Celui-ci pourra par la suite être complexifié en rajoutant des cellules endothéliales et des cellules immunocompétentes.

A bronchial epithelium model innervated by sensory neurons will enable studying several respiratory diseases including severe asthma, for which current treatments are still ineffective in a number of patients with severe clinical features. We used an artificial matrix, composed of a mixture of collagen and chitosan, which was seeded with human bronchial fibroblasts, resulting in a subepithelial mucosa. Induced pluripotent stem cells (iPSC)-derived sensory neurons were then added under the matrix. Finally, iPSC-derived functional bronchial epithelium as described in our previously published protocol (E. Ahmed et al, BioRxiv 2020) was finally added on the other side. After 40 days of culture, we obtained a fully differentiated iPSC-derived bronchial epithelium, laid on a submucosa that was characterized by a thickened extracellular matrix and a basal lamina. Hematoxylin-eosin staining on paraffin sections showed a pseudo-stratified epithelium displaying physiological bronchial cell diversity, including tubulin IV+ ciliated cells, mucin 5AC+ mucus cells and basal Keratin 5+ cells. After 60 days of culture, partial sensory innervation was found within the matrix by immunofluorescent staining of the iPSCs-derived sensory neurons (ß3 Tubulin+; Neurofilament M+). In conclusion, we successfully obtained a 3D human iPSC-derived bronchial epithelium laying on a sub-epithelial mucosa. Developments are underway to obtain a fully innervated epithelial organoid.