The 5'-3' exoribonuclease Xrn2, known as Rat1 in yeasts, terminates mRNA transcription by RNA polymerase II (RNAPII). In the torpedo model of termination, the activity of Xrn2/Rat1 is enhanced by Rai1, which is recruited to the termination site by Rtt103, an adaptor protein binding to the RNAPII C-terminal domain (CTD). The overall architecture of the Xrn2/Rat1-Rai1-Rtt103 complex remains unknown. We combined structural biology methods to characterize the torpedo complex from Saccharomyces cerevisiae and Chaetomium thermophilum. Comparison of the structures from these organisms revealed a conserved protein core fold of the subunits, but significant variability in their interaction interfaces. We found that in the mesophile, Rtt103 utilizes an unstructured region to augment a Rai1 b-sheet, while in the thermophile Rtt103 binds to a C-terminal helix of Rai1 via its CTD-interacting domain with an cc-helical fold. These different torpedo complex assemblies reflect adaptations to the environment and impact complex recruitment to RNAPII.

AbstractDer synthetische Neomycin‐bindende Riboschalter interagiert mit seinem Liganden Neomycin sowie mit den verwandten Antibiotika Ribostamycin und Paromomycin. Die Bindung dieser Aminoglykoside induziert sehr ähnliche Grundzustandsstrukturen in der RNA, allerdings kann nur Neomycin die Initiierung der Translation effizient unterdrücken. Der molekulare Ursprung dieser Unterschiede wurde auf Unterschiede in der Dynamik der Ligand‐Riboschalter‐Komplexe zurückgeführt. In diesem Artikel kombinieren wir fünf komplementäre fluorbasierte NMR‐Methoden, um die Dynamik der drei Riboschalter‐Komplexe im Sekunden‐ bis Mikrosekundenbereich genau zu quantifizieren. Unsere Daten offenbaren komplexe Austauschprozesse mit bis zu vier strukturell unterschiedlichen Zuständen. Wir interpretieren unsere Ergebnisse in einem Modell, das ein Zusammenspiel zwischen verschiedenen chemischen Gruppen in den Antibiotika und spezifischen Basen im Riboschalter zeigt. Allgemeiner unterstreichen unsere Daten das Potenzial von 19F NMR‐Methoden, komplexe Austauschprozesse mit mehreren angeregten Zuständen zu charakterisieren.

The synthetic neomycin-sensing riboswitch interacts with its cognate ligand neomycin as well as with the related antibiotics ribostamycin and paromomycin. Binding of these aminoglycosides induces a very similar ground state structure in the RNA, however, only neomycin can efficiently repress translation initiation. The molecular origin of these differences has been traced back to differences in the dynamics of the ligand:riboswitch complexes. Here, we combine five complementary fluorine based NMR methods to accurately quantify seconds to microseconds dynamics in the three riboswitch complexes. Our data reveal complex exchange processes with up to four structurally different states. We interpret our findings in a model that shows an interplay between different chemical groups in the antibiotics and specific bases in the riboswitch. More generally, our data underscore the potential of 19 F NMR methods to characterize complex exchange processes with multiple excited states.

Nuclear magnetic resonance (NMR) methods that quantitatively probe motions on molecular and atomic levels have propelled the understanding of biomolecular processes for which static structures cannot provide a satisfactory description. In this work, we studied the structure and dynamics of the essential 100-kDa eukaryotic 5′→3′ exoribonuclease Xrn2. A combination of complementary fluorine and methyl-TROSY NMR spectroscopy reveals that the apo enzyme is highly dynamic around the catalytic center. These observed dynamics are in agreement with a transition of the enzyme from the ground state into a catalytically competent state. We show that the conformational equilibrium in Xrn2 shifts substantially toward the active state in the presence of substrate and magnesium. Finally, our data reveal that the dynamics in Xrn2 correlate with the RNA degradation rate, as a mutation that attenuates motions also affects catalytic activity. In that light, our results stress the importance of studies that go beyond static structural information.

Proteins and nucleic acids are highly dynamic bio-molecules that can populate a variety of conformational states. NMR relaxation dispersion (RD) methods are uniquely suited to quantify the associated kinetic and thermodynamic parameters. Here, we present a consistent suite of 19F-based CPMG, on-resonance R1ρ and off-resonance R1ρ RD experiments. We validate these experiments by studying the unfolding transition of a 7.5 kDa cold shock protein. Furthermore we show that the 19F RD experiments are applicable to very large molecular machines by quantifying dynamics in the 360 kDa half-proteasome. Our approach significantly extends the timescale of chemical exchange that can be studied with 19F RD, adds robustness to the extraction of exchange parameters and can determine the absolute chemical shifts of excited states. Importantly, due to the simplicity of 19F NMR spectra, it is possible to record complete datasets within hours on samples that are of very low costs. This makes the presented experiments ideally suited to complement static structural information from cryo-EM and X-ray crystallography with insights into functionally relevant motions.

Crystal structures of enzymes are indispensable to understanding their mechanisms on a molecular level. It, however, remains challenging to determine which structures are adopted in solution, especially for dynamic complexes. Here, we study the bilobed decapping enzyme Dcp2 that removes the 5' cap structure from eukaryotic mRNA and thereby efficiently terminates gene expression. The numerous Dcp2 structures can be grouped into six states where the domain orientation between the catalytic and regulatory domains significantly differs. Despite this wealth of structural information it is not possible to correlate these states with the catalytic cycle or the activity of the enzyme. Using methyl transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy, we demonstrate that only three of the six domain orientations are present in solution, where Dcp2 adopts an open, a closed, or a catalytically active state. We show how mRNA substrate and the activator proteins Dcp1 and Edc1 influence the dynamic equilibria between these states and how this modulates catalytic activity. Importantly, the active state of the complex is only stably formed in the presence of both activators and the mRNA substrate or the m7GDP decapping product, which we rationalize based on a crystal structure of the Dcp1:Dcp2:Edc1:m7GDP complex. Interestingly, we find that the activating mechanisms in Dcp2 also result in a shift of the substrate specificity from bacterial to eukaryotic mRNA.

The removal of the 5' 7-methylguanosine mRNA cap structure (decapping) is a central step in the 5'-3' mRNA degradation pathway and is performed by the Dcp1:Dcp2 decapping complex. The activity of this complex is tightly regulated to prevent premature degradation of the transcript. Here, we establish that the aromatic groove of the EVH1 domain of Schizosaccharomyces pombe Dcp1 can interact with proline-rich sequences in the exonuclease Xrn1, the scaffolding protein Pat1, the helicase Dhh1, and the C-terminal disordered region of Dcp2. We show that this region of Dcp1 can also recruit a previously unidentified enhancer of decapping protein (Edc1) and solved the crystal structure of the complex. NMR relaxation dispersion experiments reveal that the Dcp1 binding site can adopt multiple conformations, thus providing the plasticity that is required to accommodate different ligands. We show that the activator Edc1 makes additional contacts with the regulatory domain of Dcp2 and that an activation motif in Edc1 increases the RNA affinity of Dcp1:Dcp2. Our data support a model where Edc1 stabilizes the RNA in the active site, which results in enhanced decapping rates. In summary, we show that multiple decapping factors, including the Dcp2 C-terminal region, compete with Edc1 for Dcp1 binding. Our data thus reveal a network of interactions that can fine-tune the catalytic activity of the decapping complex.

Seeing the big picture: Asymmetric macromolecular complexes that are NMR active in only a subset of their subunits can be prepared, thus decreasing NMR spectral complexity. For the hetero heptameric LSm1-7 and LSm2-8 rings NMR spectra of the individual subunits of the complete complex are obtained, showing a conserved RNA binding site. This LEGO-NMR technique makes large asymmetric complexes accessible to detailed NMR spectroscopic studies.

Large asymmetric assemblies are difficult to prepare recombinantly and result in complicated NMR spectra that cannot be analyzed in detail. Both issues are addressed simultaneously in the LEGO-NMR method described by R. Sprangers and co-workers in their Communication on page 11401 ff. The method is based on sequential co-expression of NMR active and NMR invisible protein subunits of a large assembly and significantly simplifies both amide backbone and methyl side-chain spectra.

Das Große sehen: Eine neue Methode vereinfacht die Herstellung unsymmetrischer makromolekularer Komplexe, in denen nur ein Teil der Untereinheiten NMR-aktiv ist, was zu weniger komplexen Spektren führt. Für die heteroheptameren LSm1–7- und LSm2–8-Ringe wurden NMR-Spektren der einzelnen Untereinheiten im gesamten Komplex aufgenommen, wodurch eine konservierte RNA-Bindungsstelle identifiziert werden konnte. LEGO-NMR bildet die Grundlagen für die Analyse großer unsymmetrischer Komplexe. Kernspinresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie) zeichnet sich durch die Möglichkeit aus, Biomoleküle mit atomarer Auflösung in einem fast-natürlichen Milieu zu analysieren. Üblicherweise können aber nur Moleküle mit Gewichten unter 20 kDa auf Struktur, Wechselwirkungen und Dynamik untersucht werden. In den letzten Jahren wurde diese Grenze aber durch TROSY-Techniken,1 das Deuterieren von Proteinen2 und die gezielte Markierung von Methylgruppen3 deutlich erhöht. So konnten Komplexe von weit über 100 kDa detailliert untersucht4 und funktionelle Besonderheiten großer molekularer Maschinerien aufgeklärt werden.5 Oftmals wurden dabei hochsymmetrische Molekülkomplexe untersucht, da diese vergleichsweise einfach herzustellen sind und einfache NMR-Spektren aufweisen, in denen alle Untereinheiten zu identischen Signalen führen.5a Für diejenigen großen unsymmetrischen Komplexe, welche durch Koexpression aller Untereinheiten in E. coli produziert werden können,6 sind die resultierenden NMR-Spektren durch die Vielzahl der Resonanzsignale jedoch nicht vollständig auszuwerten. In wenigen Fällen konnte dieses Problem umgangen werden, indem der Komplex in vitro aus einzeln aufgereinigten, NMR-aktiven und NMR-inaktiven Untereinheiten rekonstituiert wurde.5b,5c,5h Diese Strategie ist allerdings nicht allgemein anwendbar. Dadurch bleiben die meisten eukaryotischen Systeme, welche deutlich komplexer als ihre bakteriellen und archaebakteriellen Gegenstücke sind, für die hochauflösende NMR-Spektroskopie unzugänglich. Wir stellen hier eine Methode zur schrittweisen Koexpression von großen unsymmetrischen Komplexen vor, welche die Vorteile von In-vivo-Rekonstitution und partieller Isotopenmarkierung zur Senkung der spektralen Komplexität kombiniert. E. coli wird dabei mit zwei Plasmiden mit unterschiedlichen Promotorsystemen transformiert, mit denen unabhängig voneinander die Proteinexpression induziert werden kann. Hierdurch ist es möglich die Synthese einer Gruppe von Proteinen in NMR-aktivem Medium (Stufe 1) zu starten, und anschließend eine zweite Gruppe von Proteinen in NMR-inaktivem Medium (Stufe 2) zu exprimieren (Abbildung 1 A). Durch die Expression aller Proteine in derselben E.-coli-Zelle wird der Komplex in einer zellulären Umgebung zusammengesetzt, was verhindert, dass einzeln unlösliche Untereinheiten aggregieren. Wir benennen diese Methode zum Markieren, Exprimieren und Generieren von Oligomeren für NMR als “LEGO-NMR” (“label, express, and generate oligomers” for NMR). Prinzip von LEGO-NMR. A) Dargestellt ist Methode A1 (Tabelle S2, Abbildung S1). In Stufe 1 wächst E. coli in einem NMR-aktiven Medium, die Proteinsynthese wird von Plasmid 1 induziert und LSm5, LSm6 und LSm7 werden NMR-aktiv exprimiert. In Stufe 2 werden die Zellen in ein NMR-inaktives Medium überführt und die Proteinsynthese von Plasmid 2 gestartet, wodurch die NMR-inaktiven LSm2, LSm3, LSm4 und LSm8 produziert werden. Durch die Fusion einer einzelnen Untereinheit mit einer Affinitätsmarkierung wird der gesamte Komplex direkt isoliert und bis zur Homogenität aufgereinigt. NMR-aktive Untereinheiten sind farbig, NMR-inaktive Untereinheiten grau dargestellt. B) 1H-15N-TROSY-Spektrum (grau) des komplett NMR-aktiven LSm2–8-Komplexes. Besonders in der zentralen Region überlagern sehr viele Resonanzsignale, was die Auswertung deutlich erschwert. C) Oben links: LEGO-1H-15N-NMR-Spektrum (schwarz) des LSm2–8-Komplexes, in dem LSm5, LSm6 und LSm7 NMR-aktiv und LSm2, LSm3, LSm4 und LSm8 NMR-inaktiv sind. Andere Felder: LEGO-1H-15N-NMR-Spektra des LSm2–8-Komplexes mit einzelnen NMR-aktiven Untereinheiten im ansonsten NMR-inaktiven Komplex. Die Resonanzen entsprechen einem Teil der Signale des komplett markierten LSm2–8-Komplexes (siehe Vergrößerungen). Die LEGO-Methode basiert auf strikt kontrollierbaren DNA-Promotoren, sodass der erste Promotor, welcher die Stufe 1 der Expression steuert, in Stufe 2 komplett inaktiv ist, und der zweite Promotor sich umgekehrt verhält. In LEGO-Methoden A1 und A2 (Abbildung S1) wird Stufe 1 durch einen Arabinose-induzierbaren araBAD-Promotor und Stufe 2 durch einen IPTG-induzierbaren T7-Promotor kontrolliert.7 Der araBAD-Promotor wird in Stufe 2 durch die im Medium vorhandene Glucose effektiv deaktiviert.8 LEGO-Methode B basiert auf einem neuartigen Drei-Promotor-System, in welchem in Stufe 1 die Proteinexpression von einem T7-Promotor und in Stufe 2 von einem araBAD-Promotor erfolgt. In Stufe 2 wird dann die T7-Expression durch ein drittes Plasmid mit einem Rhamnose-induzierbaren Promotor aktiv unterdrückt.9 Diese Hemmung ist notwendig, da sonst die Induktion durch den T7-Promotor auch nach dem Entfernen von IPTG für mehr als vier Stunden anhalten würde.7a Um das LEGO-NMR-Konzept zu etablieren, analysieren wir zwei verschiedene LSm-Komplexe des mRNA-Abbaus und mRNA-Spleißens. Die zwei Komplexe LSm1–710 (mit den LSm-Proteinen 1–7) und LSm2–811 (mit den LSm-Proteinen 2–8) enthalten je sieben verschiedene Proteine in definierter Anordnung.11b, 12 Da die meisten LSm-Proteine alleine unlöslich sind, können weder LSm1–7 noch LSm2–8 effizient in vitro aus einzeln aufgereinigten Untereinheiten rekonstituiert werden.13 Andererseits führt die Koexpression der verschiedenen Komplexe durch die Effizienz der Rekonstruktion in zellulärem Umfeld zu homogenen NMR-Proben (Abbildung 1 B). Aufgrund der großen Zahl an Resonanzsignale (649 erwartete, voneinander verschiedene Signale der Rückgrat-Amide) sind die resultierenden NMR-Spektren durch Signal-Überlappung allerdings deutlich verschlechtert und nicht exakt auszuwerten (Abbildung 1 B). Die LSm-Komplexe stellen daher ein geeignetes Beispiel eukaryotischer Proteinkomplexe dar, die derzeit für die hochauflösende NMR-Spektroskopie unzugänglich sind. Um die spektrale Überlappung um einen Faktor ≈2 zu reduzieren, markierten wir LSm5, LSm6 und LSm7 mit 15N in Stufe 1, und exprimierten anschließend LSm2, LSm3, LSm4 und LSm8 in Stufe 2 in NMR-inaktivem Medium. Das resultierende Spektrum des LSm2–8-Komplexes zeigt nur LSm5, LSm6 und LSm7 und ist deutlich vereinfacht (Abbildung 1 C, oben links). Wie erwartet überlagern die Resonanzsignale sehr gut mit einem Teil der Signale des vollständig NMR-aktiven LSm2–8-Komplexes. Dadurch sind die Signale der Proteine LSm5, LSm6 oder LSm7 im gesamten LSm2–8-Komplexes eindeutig zu identifizieren. Um die Leistungsfähigkeit der sequentiellen Koexpressionsstrategie weiter zu testen, erzeugten wir sieben verschiedene NMR-Proben des LSm2–8-Komplexes, in denen je nur ein einziges LSm-Protein in Stufe 1 mit 15N markiert und die übrigen sechs LSm-Proteine NMR-inaktiv in Stufe 2 exprimiert wurden (Abbildung 1 C). Die sieben resultierenden Spektren ermöglichen die eindeutige Identifizierung der Resonanzen, die jedem der einzelnen LSm-Proteine im LSm2–8-Komplex entsprechen. Somit konnte eine Vereinfachung von bis zu 89 % (74 erwartete Amidsignale im LSm6-LEGO-Spektrum) erreicht werden. Unser Ansatz ermöglicht also, die komplizierten Spektren des heteroheptameren Komplexes in sieben deutlich vereinfachte Teilspektren aufzuspalten. Gleichzeitig ergibt die Überlagerung der sieben NMR-Spektren, in denen je nur ein LSm-Protein markiert ist, das Spektrum des komplett markierten LSm2–8-Komplexes (Abbildung S2). Es ist bemerkenswert, dass die in Stufe 1 in deuterierter Form produzierten Proteine zu Beginn von Stufe 2 effektiv reprotoniert werden, bevor die Untereinheiten in den Komplex integriert werden. Damit werden (Rückfaltungs-)Protokolle zur Reprotonierung der Rückgrat-Amidgruppen (Abbildung S3) in LSm2–8 unnötig. LSm2–8 ist Teil des U6-RNPs, in dem es mit dem 3′-Ende der U6-snRNA wechselwirkt.11a, 14 Um festzustellen, welche Untereinheiten des LSm2–8-Komplexes das RNA-Substrat binden, verwendeten wir NMR-Titrationsexperimente mit LSm2–8-LEGO-Komplexen, die entweder LSm2, 3, 4 und 8 (Abbildung S4A) oder LSm5, 6 und 7 (Abbildung S4B) in einem ansonsten NMR-inaktiven Hintergrund enthielten. In beiden Komplexe führte die RNA-Bindung zu deutlichen Änderungen der chemischen Verschiebungen. Interessanterweise zeigen die LEGO-Spektren mit je einer markierten Untereinheit (Abbildung 1 C), dass alle sieben Untereinheiten an der RNA-Bindung beteiligt sind (Abbildung S4A,B), da Signale aller LSm-Proteine durch die Interaktion mit RNA veränderte chemische Verschiebungen aufweisen. Um die verbleibende spektrale Überlappung aufzulösen, führten wir ein RNA-Bindungsexperiment mit einem LSm2–8-Komplex, in dem nur LSm5 markiert ist, durch (Abbildung 2 A). Anschließend kombinierten wir Daten des bereits zugeordneten LSm657-Komplexes,13a das LSm5-LEGO-Spektrum (Abbildung 1 C) und ein HNCA-Spektrum des vollständig 2 H, 13C, 15N-markierten LSm2–8-Komplexes (Abbildung 2 B), um diejenigen Reste von LSm5 in LSm2–8 zuzuordnen, die an der RNA-Bindung beteiligt sind. Hierbei war von Nutzen, dass wir die LSm5-Resonanzsignale im HNCA-Spektrum des komplett markierten LSm2–8-Komplexes auswählen konnten, um damit die Zahl der erwarteten Resonanz-Streifen von 649 auf 77 zu reduzieren und den Zuordnungsvorgang deutlich zu vereinfachen. Dadurch konnten wir zeigen, dass sich die Reste, deren chemische Verschiebungen sich durch die Bindung der U6-snRNA am stärksten verändern, in der Schleife 5 von LSm5 befinden (Abbildung 2 C). Diese Schleife verbindet die β-Stränge 4 und 5 in der LSm-Faltung und kleidet die zentrale Pore des LSm-Ringes aus. Da die von uns verwendete RNA aus 9 Basen bestand und alle LSm-Proteine an der RNA-Wechselwirkung beteiligt sind (Abbildung S4), deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass sich die RNA-Bindungsstelle an der zentralen Pore befindet. Zusätzliche Informationen, um diese Beobachtung zu stützen, kann durch die Resonanzzuordnung der anderen LSm-Proteine im LSm2–8-Komplex auf vergleichbarem Weg erhalten werden. Interessanterweise wurde für den eukaryotischen Sm-Komplex,15 den archaebakteriellen LSm-Komplex16 und den Hfq-Komplex17 bereits gezeigt, dass sie ebendiese Region zur RNA-Bindung nutzen. Dies deutet darauf hin, dass die Bindungsstelle in den eukaryotischen LSm-Komplexen konserviert ist. Zuordnung von LSm5 im LSm2–8-Komplex. A) LSm5 in LSm2–8 vor (schwarz) und nach (pink) Zugabe des 3′-Fragments der U6-snRNA. B) LSm5-Resonanzstreifen in einem HNCA-Spektrum des komplett markierten LSm2–8-Komplexes. Die Streifen konnten auf Grundlage des Lsm5-LEGO-NMR-Spektrums (A und Abbildung 1 C) ausgewählt werden. (C) Die LSm5-Reste mit den größten Veränderungen der chemischen Verschiebungen nach Zugabe der U6-snRNA sind im Modell von LSm2–8 als pinke Kugeln dargestellt. Methyl-TROSY-Spektroskopie ist hervorragend geeignet um supramolekulare Komplexe zu analysieren, welche für Rückgrat-basierte TROSY-Spektroskopie unzugänglich sind. Um die Integration von ε-1H-13C-Methylmarkierung von Methioninresten bei LEGO-NMR zu etablieren, verwendeten wir den heteroheptameren LSm1–7-Komplex, dessen 1H-15N-TROSY-Spektren von schlechterer Qualität sind als die des LSm2–8-Komplexes (Abbildung S5). Die Methionin-Methylspektren des vollständig Methionin-markierten LSm1–7-Komplexes weisen viele gut vereinzelte Resonanzsignale und eine Region mit starker spektraler Überlappung auf (Abbildung 3 A, oben links). Um diese Überlappung zu vermeiden und die gut vereinzelten Signale den entsprechenden LSm-Proteinen zuzuweisen, stellten wir sieben LEGO-NMR-Proben von LSm1–7 her. In jeder waren die Methioninreste eines einzeln LSm-Proteins markiert, und alle anderen 6 LSm-Proteine NMR-inaktiv. Die Methyl-TROSY-Spektren dieser hetero-heptameren Komplexe ermöglichen die eindeutige Zuordnung der Signale zu den einzelnen LSm-Proteinen (Abbildung 3 A). Die genaue Zuordnung der Resonanzen zu den entsprechenden Methioninresten kann durch gezielte Mutationen erhalten werden.5a, 18 Des Weiteren verminderten diese einzelmarkierten LSm1–7-Komplexe das Problem spektraler Überlappung deutlich. Methionin-Methyl-TROSY-Spektroskopie ist also vollständig kompatibel mit der LEGO-NMR-Methode, und bietet hochauflösende Spektren für Komplexe, welche nicht mit 1H-15N-basierter TROSY-Spektroskopie analysiert werden können. Hierzu wurde kürzlich gezeigt, dass Methionin-Methylgruppen exzellente Sonden für molekulare Wechselwirkungen sind.19 Methylgruppen-Markierung. A) Methionin-Methylgruppen-Spektrum des LSm1–7-Komplexes. Das obere linke Feld zeigt das Methyl-TROSY-Spektrum des komplett markierten Komplexes. Das Spektrum kann in sieben vereinfachte Teilspektren aufgespalten werden, die nur ein einzelnes NMR-aktives LSm-Protein enthalten (andere Felder). (B) Methyl-TROSY-Spektrum des Ile-δ1-markierten LSm2–8-Komplexes. Das Spektrum des vollständig markierten Komplexes (grau) wird durch Markierung nur von LSm5, 6 und 7 (schwarz) oder nur von LSm5 (oliv) vereinfacht. Neben Methionin-Methylgruppen wird Methyl-TROSY-Spektroskopie oft mithilfe isotopenmarkierter Methylgruppen von Isoleucin-, Leucin-, Valin-20 und Alaninresten21 durchgeführt. Im Gegensatz zur Methionin-Markierung werden diese Methylgruppen in das Protein durch die Verstoffwechslung spezieller Vorstufenmoleküle in E. coli eingebracht. Für Isoleucin-Reste ist dazu Glucose im Medium vonnöten, da hierdurch durch Katabolit-Repression Stoffwechselwege gehemmt werden, durch die ansonsten α-Ketobuttersäure abgebaut würde.22 Stufe 1 im Protokoll A1, welches zur Stickstoff- und Methioninmarkierung verwendet wurde (Abbildung S1, Tabelle S2), basiert auf Glycerin als Kohlenstoffquelle und kann deswegen nicht zum Markieren von Isoleucinen genutzt werden. Um einzelne Untereinheiten mit Isoleucin zu markieren, verwenden wir Protokoll A2 (in dem die NMR-aktive Markierung erst in Stufe 2 geschieht) oder Protokoll B (in welchem ein Arabinose-induzierbarer Promotor erst in Stufe 2 zum Einsatz kommt; Abbildung S1). Die hohe spektrale Qualität bei vollständiger Isoleucin-δ1-Markierung unterstreicht, dass Methylgruppen-TROSY-NMR für Komplexe mit hohem Molekulargewicht gut geeignet ist (Abbildung 3 B, grau). Wir nutzten anschließend Protokoll B, um einen “halb” markierten LSm2–8-Komplex mit NMR-aktiven Isoleucin-δ1-Methylgruppen in LSm5, LSm6 und LSm7 herzustellen (Abbildung 3 B, schwarz). Ebenso wie in den 1H,15N-basierten Spektren (Abbildung 1 C) können die Resonanzen der markierten Proteine eindeutig identifiziert werden. Für die 17 Isoleucin-Reste in LSm5, LSm6 und LSm7 werden 16 gut vereinzelte Resonanzsignale im Spektrum beobachtet. Im nächsten Schritt verwendeten wir Protokoll A2 zur Herstellung eines LSm2–8-Komplexes, in dem nur LSm5 NMR-aktiv ist (Abbildung 3 B, oliv). Das resultierende HMQC-Spektrum zeigt sechs einzelne Resonanzen, die den sechs Isoleucinresten in LSm5 entsprechen. In den beschriebenen Experimenten wurde ausschließlich ein Teil des Komplexes isotopenmarkiert, wohingegen die restlichen Untereinheiten NMR-inaktiv waren. Es ist allerdings ebenfalls möglich, mehrere Markierungsstrategien für die verschiedenen Untereinheiten anzuwenden. Dazu stellten wir einen vollständig 1H-15N-markierten LSm2–8-Komplex her, dessen Untereinheiten LSm2, 3, 4 und 8 ε-1H-13C-Methyl-Methionin-markiert und LSm5, 6 und 7 δ1-1H-13C-Isoleucin-markiert sind (Abbildung 4). Weil die Methylgruppen von Methionin- und Isoleucin-Resten spektral getrennt sind, können mit diesem Ansatz mehrere NMR-Parameter von verschiedenen Teilen eines großen Komplexes gleichzeitig und unabhängig voneinander erfasst werden. Gemischte 15N-,ε-1H,13C-Methyl-Methionin- und δ1-1H,13C-Methyl-Isoleucin-Markierung von LSm2–8. Das 1H-15N-TROSY-Spektrum (links) zeigt alle Untereinheiten des Komplexes (siehe Abbildung 1 B). LSm2, 3, 4 und 8 sind an Methionin-Resten markiert (siehe Abbildung 3 A, welche die Methionin-Methylgruppen von LSm1–7 zeigt). LSm5, 6 und 7 sind an Isoleucin-Resten markiert (siehe Abbildung 3 B). NMR-Studien von großen und unsymmetrischen Komplexen sind erheblich erschwert durch schwierige Probenherstellung und spektrale Überlappung aufgrund der Vielzahl verschiedener Resonanzsignale. Wir führen hier eine Strategie der sequentiellen Koexpression ein, welche beide Probleme gleichzeitig angeht. Am Beispiel der LSm1–7- und LSm2–8-Komplexe zeigen wir, dass höchst homogene NMR-Proben direkt hergestellt werden können, die nur eine NMR-aktive Untereinheit enthalten. Es ist zu betonen, dass unsere Strategie die Isotopenmarkierung sowohl von Rückgrat-Amidgruppen als auch von Seitenketten-Methylgruppen ermöglicht. LEGO-NMR ist daher gut geeignet für Experimente an großen unsymmetrischen Komplexen wie eukaryotischen Systemen, welche im Moment für detaillierte NMR-Studien nicht zugänglich sind. Im Hinblick darauf ist anzumerken, dass circa 50 % der Komplexe in der PDB mit drei oder mehr verschiedenen Untereinheiten in E. coli exprimiert wurden, was die weitreichenden Anwendungsmöglichkeiten unserer Methode unterstreicht. As a service to our authors and readers, this journal provides supporting information supplied by the authors. Such materials are peer reviewed and may be re-organized for online delivery, but are not copy-edited or typeset. Technical support issues arising from supporting information (other than missing files) should be addressed to the authors. Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article.

Große unsymmetrische Aggregate können nur schwer auf rekombinantem Weg erzeugt werden und ergeben komplizierte NMR-Spektren, die nicht im Detail zu analysieren sind. Beide Probleme zugleich nimmt die LEGO-NMR-Methode in Angriff, die R. Sprangers und Mitarbeiter in ihrer Zuschrift auf S. 11612 ff. beschreiben. Die Methode beruht auf der sequenziellen Koexpression von NMR-aktiven und nicht durch NMR erkennbaren Proteinuntereinheiten des riesigen Aggregats und vereinfacht die Teilspektren des Amidrückgrats und der Methylseitenketten erheblich. Große unsymmetrische Aggregate können nur schwer auf rekombinantem Weg erzeugt werden und ergeben komplizierte NMR-Spektren, die nicht im Detail zu analysieren sind. Beide Probleme zugleich nimmt die LEGO-NMR-Methode in Angriff, die R. Sprangers und Mitarbeiter in ihrer Zuschrift auf S. 11612 ff. beschreiben. Die Methode beruht auf der sequenziellen Koexpression von NMR-aktiven und nicht durch NMR erkennbaren Proteinuntereinheiten des riesigen Aggregats und vereinfacht die Teilspektren des Amidrückgrats und der Methylseitenketten erheblich. Wasserspaltung In der Zuschrift auf S. 11462 ff. stellen K. Domen et al. Kern-Schale-Photokatalysatoren mit getrennten Cokatalysatoren vor. Die aktive Verbesserung des Elektronen- und Löchertransports in diesen Katalysatoren gewährt eine hohe Aktivität in der Wasserspaltung.1 Nanostrukturen Kristalline Halbleiter-Nanobänder wurden durch “Ausrollen” von Kern-Schale-Nanodrähten erhalten, wie F. Patolsky et al. in der Zuschrift auf S. 11508 ff. beschreiben. Ein Beispiel für ein so zugängliches Material sind technologisch wichtige Ge-Nanobandstrukturen.1 Sauerstoffaktivierung In ihrer Zuschrift auf S. 11595 ff. berichten N. Nilius et al., dass chemisch inerte, Mo-dotierte CaO-Filme adsorbiertes O2 durch Ladungstransfer aktivieren. Die resultierenden Oberflächen-Sauerstoffspezies dissoziieren dann in Form atomaren Sauerstoffs.1