Institute of Developmental and Molecular Biology of Plants, Plant Molecular Physiology and Biotechnology Group, Heinrich-Heine-Universität, and Cluster of Excellence on Plant Sciences, 40225 Duesseldorf, Germany (M.K.M.E., J.S., A.G., N.J., V.G.M.); Max-Planck-Institute of Molecular Plant Physiology, 14476 Potsdam-Golm, Germany (A.F., A.R.F.); and Institute of Biochemistry and Biology, University of Potsdam, 14476 Potsdam, Germany (M.A., S.B., B.M.-R.)

In roots of Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), L-lactate is generated by the reduction of pyruvate via L-lactate dehydrogenase, but this enzyme does not efficiently catalyze the reverse reaction. Here, we identify the Arabidopsis glycolate oxidase (GOX) paralogs GOX1, GOX2, and GOX3 as putative L-lactate-metabolizing enzymes based on their homology to CYB2, the L-lactate cytochrome c oxidoreductase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. We found that GOX3 uses L-lactate with a similar efficiency to glycolate; in contrast, the photorespiratory isoforms GOX1 and GOX2, which share similar enzymatic properties, use glycolate with much higher efficiencies than L-lactate. The key factor making GOX3 more efficient with L-lactate than GOX1 and GOX2 is a 5- to 10-fold lower Km for the substrate. Consequently, only GOX3 can efficiently metabolize L-lactate at low intracellular concentrations. Isotope tracer experiments as well as substrate toxicity tests using GOX3 loss-of-function and overexpressor plants indicate that L-lactate is metabolized in vivo by GOX3. Moreover, GOX3 rescues the lethal growth phenotype of a yeast strain lacking CYB2, which cannot grow on L-lactate as a sole carbon source. GOX3 is predominantly present in roots and mature to aging leaves but is largely absent from young photosynthetic leaves, indicating that it plays a role predominantly in heterotrophic rather than autotrophic tissues, at least under standard growth conditions. In roots of plants grown under normoxic conditions, loss of function of GOX3 induces metabolic rearrangements that mirror wild-type responses under hypoxia. Thus, we identified GOX3 as the enzyme that metabolizes L-lactate to pyruvate in vivo and hypothesize that it may ensure the sustainment of low levels of L-lactate after its formation under normoxia.

Hydrogen peroxide (H2O2) operates as a signaling molecule in eukaryotes, but the specificity of its signaling capacities remains largely unrevealed. Here, we analyzed whether a moderate production of H2O2 from two different plant cellular compartments has divergent effects on the plant transcriptome. Arabidopsis thaliana overexpressing glycolate oxidase in the chloroplast (Fahnenstich et al., 2008; Balazadeh et al., 2012) and plants deficient in peroxisomal catalase (Queval et al., 2007; Inzé et al., 2012) were grown under non-photorespiratory conditions and then transferred to photorespiratory conditions to foster the production of H2O2 in both organelles. We show that H2O2 originating in a specific organelle induces two types of responses: one that integrates signals independently from the subcellular site of H2O2 production and another that is dependent on the H2O2 production site. H2O2 produced in peroxisomes induces transcripts involved in protein repair responses, while H2O2 produced in chloroplasts induces early signaling responses, including transcription factors and biosynthetic genes involved in production of secondary signaling messengers. There is a significant bias towards the induction of genes involved in responses to wounding and pathogen attack by chloroplastic-produced H2O2, including indolic glucosinolates-, camalexin-, and stigmasterol-biosynthetic genes. These transcriptional responses were accompanied by the accumulation of 4-methoxy-indol-3-ylmethyl glucosinolate and stigmasterol.

H2O2 ist ein Signalmolekul in Eukaryoten, jedoch ist die spezifische Wirksamkeit der Signalwirkung bisher weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit haben wir analysiert, ob eine moderate Produktion von H2O2 in verschiedenen pflanzlichen Zellorganellen divergente Effekte auf das Transkriptom ausubt. A. thaliana Pflanzen, welche die Glycolat Oxidase1 in den Chloroplasten uberexprimieren (GO-Pflanzen) und Pflanzen, die einen Funktionsverlust der peroxisomalen catalase2 (cat2 Pflanzen) aufweisen, wuchsen unter nicht-photorespiratorischen Bedingungen an und wurden dann in photorespiratorische Bedingungen transferiert, um die H2O2 Produktion in den Chloroplasten und den Peroxisomen zu induzieren. Durch die Verwendung von existierenden quantitativen real-time PCR (qRT-PCR) Plattformen haben wir zunachst die Antwort von 187 ROS-antwortenden Genen und 1880 Transkriptionsfaktoren (TF) in GO-Pflanzen untersucht. Die Daten legen eine koordinierte Expressionsanderung von Genen eines spezifischen funktionellen Netzwerks, innerhalb von 0,5 Stunden nach Induktion der H2O2 Produktion in den Chloroplasten und Peroxisomen inklusive der Induktion von Indol Glukosinolat und Camalexin Biosynthese Gene, nahe. Die Analyse der TF zeigte eine Hochregulierung der Expression von speziellen entwicklungsbeeinflussenden Genen. Durch die Verwendung von Microarray Analysen, konnten wir zeigen, dass in spezifischen Organellen produziertes H2O2, zwei verschiedene Arten von Antworten induziert: Antworten, die unabhangig vom subzellularen Ort der Produktion agieren und Antworten, welche abhangig vom Ort der Produktion von H2O2 agieren. Wahrend in Peroxisomen produziertes H2O2 Antworten der Protein Reparatur induziert, induziert in den Chloroplasten produziertes H2O2 fruhe Signalantworten durch die Kontrolle der Gen Transkription und sekundare Signal Molekule. Der Vergleich zwischen cat2 und GO-Pflanzen zeigt, dass H2O2, welches in den Chloroplasten produziert wurde, speziell Gene, welche in der Antwort auf Verwundung und Pathogen Befall involviert sind, wie Camalexin, Indol Glukosinolat und Stigmasterol Biosynthese Gene, induziert. So konnte auch gezeigt werden, dass chloroplastidar produziertes H2O2 die Akkumulation von 4MO-I3M (Glukosinolat) und Stigmasterol induziert. Des Weiteren haben wir die Substratspezifitat der peroxisomalen H2O2 produzierenden (L)-2 Hydroxyacid Oxidasen analysiert. Es wurden die Enzymkinetiken von GO1, GO2 und GO3 bestimmt. Die Daten zeigen, dass GO1 und GO2 Glycolat und GO3 Glycolat und L-Laktat als Substrate verwenden konnen. Um das in vivo Substrat von GO3 bestimmen zu konnen, wurden Funktionsverlustmutanten der GO3 (go3) isoliert und GO3 Uberexpressionslinien generiert. Die Wurzelentwicklung auf MS-Medium, welches Glycolat enthalt, zeigte in allen analysierten Genotypen eine negative Beeinflussung. Im Gegensatz dazu, zeigten nur die go3 Linien, auf MS-Medium, welches mit L-Laktat versetzt war, im Vergleich zum Wild Typ kurzere Wurzeln, wahrend die Uberexpressionslinien der GO3 im Vergleich zum Wild Typ langere Wurzeln aufwiesen. Als nachstes wurde ein Komplementationsassay in Hefen mit einem Defekt in CYB2, ein L-Laktat metabolisierendes Protein, durchgefuhrt. Diese Hefen sind nicht in der Lage auf Medium mit L-Laktat als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Die Uberexpression von GO3 aus A. thaliana komplementiert diesen Phanotyp, was darauf hinweist, dass L-Laktat das in vivo Substrat von GO3 darstellt.

Glycolate oxidase (GO) catalyses the oxidation of glycolate to glyoxylate, thereby consuming O(2) and producing H(2)O(2). In this work, Arabidopsis thaliana plants expressing GO in the chloroplasts (GO plants) were used to assess the expressional behavior of reactive oxygen species (ROS)-responsive genes and transcription factors (TFs) after metabolic induction of H(2)O(2) formation in chloroplasts. In this organelle, GO uses the glycolate derived from the oxygenase activity of RubisCO. Here, to identify genes responding to an abrupt production of H(2)O(2) in chloroplasts we used quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to test the expression of 187 ROS-responsive genes and 1880 TFs after transferring GO and wild-type (WT) plants grown at high CO(2) levels to ambient CO(2) concentration. Our data revealed coordinated expression changes of genes of specific functional networks 0.5 h after metabolic induction of H(2)O(2) production in GO plants, including the induction of indole glucosinolate and camalexin biosynthesis genes. Comparative analysis using available microarray data suggests that signals for the induction of these genes through H(2)O(2) may originate in the chloroplast. The TF profiling indicated an up-regulation in GO plants of a group of genes involved in the regulation of proanthocyanidin and anthocyanin biosynthesis. Moreover, the upregulation of expression of TF and TF-interacting proteins affecting development (e.g., cell division, stem branching, flowering time, flower development) would impact growth and reproductive capacity, resulting in altered development under conditions that promote the formation of H(2)O(2).