为掌握四川某生猪核心育种场2023年主要疫病感染情况和疫苗免疫情况,更好地指导疫病净化工作,本研究对该场不同猪群的90份扁桃体样本采用实时荧光PCR(RT-PCR)方法进行非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)的病原核酸检测,对270份血清样本采用ELISA方法进行ASFV、PRRSV、CSFV、猪伪狂犬病毒PRV-gE(野毒)、PRV-gB的抗体检测和分析.结果显示:该核心育种场扁桃体样本中ASFV、PRRSV、CSFV病原核酸的检测结果均为阴性;各猪群ASFV、PRRSV、PRV-gE抗体阳性率均为阴性,各猪群CSFV免疫抗体平均合格率为80％,各猪群PRV-gB免疫抗体平均合格率为 93.70％.

为评估四川省兽医系统实验室检测能力,四川省动物疫病预防控制中心于2021年组织开展了全省市、县两级兽医系统实验室检测能力比对工作,共有21个市级和148个县级兽医系统实验室参与比对.结果显示,市级兽医系统实验室非洲猪瘟病毒核酸检测、口蹄疫病毒O型抗体检测、禽流感病毒H5亚型抗体检测项目结果正确率分别为100％、92.06％和93.65％;县级兽医系统实验室非洲猪瘟病毒核酸检测、口蹄疫病毒0型抗体检测、禽流感病毒H5亚型抗体检测、禽流感病毒H7亚型核酸检测、猪瘟抗体检测、布鲁氏菌病抗体检测、包虫病抗原检测项目结果正确率分别为99.19％、98.11％、96.68％、100％、96.99％、100％和97.50％.比对结果表明,四川省市、县两级兽医系统实验室检测能力总体较好,同时也反映出部分实验室在人员稳定和培训、设施设备等方面存在的问题,需进一步加强建设.

为了解四川省兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus type 2,RHDV2)的流行情况及分子遗传变异特征,采集全省范围内的7525份样品,其中发病兔场肝脏组织样品117份、环境拭子样品243份,受监测兔场血液样品3340份、环境拭子样品3825份,采用商品化荧光RT-PCR试剂盒,对以上样品进行RHDV2检测;对筛选出的12份肝组织阳性样品进行RHDV2 VP60基因RT-PCR扩增、测序和遗传进化分析.结果显示:RHDV2流行无明显季节性,各养殖品系家兔均有RHDV2感染,哺乳仔兔、幼兔、怀孕哺乳母兔死亡率分别为25％～60％、18％～45％、9％～30％.发病兔场肝脏样品RHDV2阳性检出率为88.89％(104/117),环境样品为46.09％(112/243);受监测兔场全血样品RHDV2阳性检出率为25.99％(868/3340),环境样品为16.29％(623/3825).12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列长度均为1740 bp,核苷酸序列同源性为98.4％～100％,在系统发生进化树上独成一簇;与国内外参照毒株的VP60基因序列核苷酸同源性为93.7％～100％,编码的氨基酸序列同源性为95.7％～99.8％.结果表明:RHDV2已开始在四川省流行,需要加强检疫,重视饲养管理工作;其VP60基因序列出现了一定程度的变异,但遗传演化相对稳定.本研究补充了国内RHDV2的分子流行病学信息,也为该病的相关防控研究和控制对策制定提供了参考.

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)又称兔瘟,是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)感染引起的兔(Oryctolagus cuniculus)急性出血性传染病.为制备RHDV2的特异性单克隆抗体(McAb),进而探索其与经典兔瘟病毒(RHDV)鉴别诊断技术,本研究原核表达纯化RHDV2 VP60蛋白(pET-32a-R2VP60蛋白)和RHDV VP60蛋白(pET-32a-R1VP60蛋白),以pET-32a-R2VP60蛋白免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),并分别以pET-32a-R1VP60蛋白与pET-32a-R2VP60蛋白为包被原建立特异性的RHDV2单克隆抗体筛选间接ELISA方法,采用常规杂交瘤细胞融合技术,通过克隆、亚克隆、腹水制备、效价测定、Western blot分析、血凝-血凝抑制试验以及亚型鉴定成功筛选出一株抗RHDV2的杂交瘤细胞株,命名为2A1.结果显示,2A1融合细胞的染色体约为100条,分泌IgG3亚型McAb,轻链为Kappa亚型;杂交瘤2A1的抗体分泌稳定,腹水纯化McAb效价高,特异性良好,其间接ELISA效价高达1:128000.Western blot分析显示McAb 2A1仅与RHDV2病毒粒子和pET-32a-R2VP60蛋白反应,与RHDV1病毒粒子和pET-32a-R1VP60蛋白反应阴性.血凝(hemagglutination,HA)与血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)实验表明2A1纯化McAb可有效抑制RHDV2的血凝作用,HI效价高达10log2.本研究制备的RHDV2特异性McAb 2A1,为RHDV2特异快速的血清学诊断方法建立和试剂盒研发提供了科学材料.

1 材料和方法 1.1 血清 采集某猪场保育猪、育肥猪、母猪、种公猪血样96份,并分离血清,-20℃保存待检. 1.2试剂 口蹄疫O型竞争ELISA抗体检测试剂盒;猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒、猪蓝耳病毒抗体ELISA检测试剂盒、伪狂犬病毒gB抗体ELISA检测试剂盒、伪狂犬病毒gE抗体ELISA检测试剂盒.

为评估四川省兽医系统实验室检测能力和水平,2018—2020年四川省动物疫病预防控制中心组织全省21个地市(州)级兽医实验室开展了检测能力比对.结果显示:2018—2020年全省整体平均正确率分别为95.59％、97.09％和97.88％,说明四川省地市(州)级兽医实验室检测能力处于较高水平,能满足非洲猪瘟、禽流感等重大动物疫病检测需要.同时,部分实验室也反映出一些问题,如设备差、检测水平不高、检测报告不规范等.建议加大兽医实验室建设力度,更新完善检测设施设备;加强实验室技术人员培训,提升其检测能力和水平;同时继续推进兽医系统实验室考核工作,加强比对考核.

为了解四川省主要养牛地区腹泻牛群中牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)感染情况,采集眉山、南充、达州、巴中、雅安、甘孜等6个市州53个场户的牛腹泻粪便样品共387份,采用荧光RT-PCR方法进行BCoV检测.结果显示:53个场点中,检出阳性场点11个,群体阳性检出率为20.8％;387份样品中,检出阳性样品65份,个体阳性检出率为16.8％.从群间分布看,规模场群体阳性检出率(72.7％)与个体阳性检出率(21.4％)均高于散养户(7.1％和3.1％),差异均极显著(P<0.01);牦牛个体阳性检出率为28.8％,高于黄牛(14.1％)和奶牛(11.1％),差异均有统计学意义,分别为P<0.01和P<0.05.结果表明,BCoV在四川省已形成一定的污染面,是造成牛腹泻的重要病原之一,需要加强对其流行的综合防控.

为评估微流控芯片法在非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸快速检测中的各项性能,验证该方法的敏感性、特异性、重复性和临床效果,本研究将ASFV VP72质粒标准物质、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)培养物各1份以及临床样本43份进行核酸提取,用ASFV微流控芯片快速检测试剂盒进行测试研究,并与市场上某品牌ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行比对.结果表明:微流控芯片法可以在15～30 min内,实现2.5 copies/μL的最低检出限,与荧光定量PCR具有相同的敏感性和重复性;同时该方法对CSFV、PEDV、TGEV、PCV2和PRV病毒培养物均无交叉反应,特异性良好;通过对43份临床样本测试显示,微流控芯片法与荧光定量PCR的临床符合率为97.67％(42/43).研究表明,微流控芯片法在ASFV核酸检测上性能良好.

为了解四川省2020年高致病性禽流感的免疫效果,在春、秋两防集中免疫后,从四川省21个市(州)共采集禽血清样品4053份,采用血凝抑制试验(HI)对H5和H7亚型禽流感分别进行抗体水平的检测.结果显示,禽流感H5亚型免疫抗体合格3745份,平均合格率为93.92％,其中,春季合格率为96.49％,秋季合格率为91.35％;禽流感H7亚型免疫抗体合格3782份,平均合格率为93.28％,其中,春季合格率为96.4％,秋季合格率为90.15％.数据表明,四川省2020年春、秋两防高致病性禽流感疫苗免疫取得明显效果.

为调查四川省猪群PRV野毒(也即流行株)的感染及其遗传进化情况,本实验对2019年～2020年来自四川省11个地区55个猪场的466份疑似PRV感染猪的不同组织样品进行了PRV gE基因的荧光定量PCR检测,并统计不同类型猪和不同地区猪PRV的感染情况.结果显示,当前四川省11个地区PRV总阳性率为10.94％(51/466),猪场阳性率为21.81％(12/55).其中,不同种类猪的阳性率分别为2.63％(2/76,公猪)、4.76％(2/42,哺乳仔猪)、11.26％(8/71,保育猪)、13.41％(11/82,妊娠母猪)、17.96％(23/128,育肥猪)、7.94％(5/63,后备猪).其中育肥猪PRV的阳性率极显著高于哺乳仔猪(p<0.01),妊娠母猪PRV阳性率显著高于公猪(p<0.05);不同地区PRV总阳性率为4％～21.21％.表明,PRV目前仍在四川多地区流行,且育肥猪较其他生长阶段的猪更易感.对其中12份gE基因阳性样品中PRV野毒的4个主要基因gB、gD、gC和gE进行克隆、测序和编码氨基酸序列的同源性分析,并构建gC和gE基因遗传进化树分析PRV的遗传进化特征.序列分析结果显示,12份PRV阳性样品中扩增的gB、gD、gC和gE全基因编码氨基酸序列之间的同源性分别为97.7％～98.9％(gB)、100％(gD)、99.2％～99.6％(gC)、98.4％～100％(gE);与NCBI已登录的所有PRV相应基因编码氨基酸的同源性分别为:95.31％～99.56％(gB)、98.8～100％(gD)、94.3％～99.8％(gC)、97.6％～100％(gE).上述结果表明,近年四川地区流行的PRV均发生了不同程度的变异;12株流行株的毒力蛋白出现多个独有氨基酸位点的突变或缺失;但gE蛋白仅有1～2个独有氨基酸位点突变,gD蛋白则无突变.表明,PRV流行株gE和gD蛋白相对较保守.gC和gE基因的遗传进化分析结果显示,本研究鉴定的PRV流行株均为基因Ⅱ型,与国内近年流行株及日本、韩国PRV株处于同一大分支,但与四川早期PRV流行株和欧美PRV株的遗传关系均较远,表明,近年该地区流行的PRV又出现了新的变异,且亚洲地区流行的PRV可能存在相似的遗传演化关系.本研究系统调查和分析了四川省11个主要地区PRV野毒感染情况和遗传进化特点,为四川省PR的防控和净化提供科学依据.

为了解四川省部分规模猪场伪狂犬病病毒(PRV)感染情况和疫苗免疫状况,采用ELISA方法,对四川省川东、川南、川西、川北、川中5个片区的17个规模猪场进行PRV血清流行病学调查.结果显示:采集的1388份血清样品中,PRV-gB抗体总阳性率为84.51％,PRV-gE抗体总阳性率为15.63％;17个规模猪场中,PRV-gB抗体场阳性率为100％,PRV-gE抗体阳性猪场10个,场阳性率为58.82％;哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、经产母猪、种公猪、后备猪PRV-gB抗体阳性率分别为79.52％、71.98％、77.58％、94.29％、88.33％、86.27％,PRV-gE抗体阳性率分别为30.12％、13.74％、21.71％、15.53％、1.67％、10.78％.结果表明,四川省规模猪场伪狂犬病总体免疫效果较好,但部分猪场免疫抗体水平不高,野毒感染情况也较严重,尤其是哺乳仔猪、育肥猪和经产母猪群.结果提示,四川省猪伪狂犬病流行形势仍然严峻,需要继续加强猪伪狂犬病的系统性防控,有计划开展猪群PRV净化.

为了解四川省部分规模猪场口蹄疫免疫效果,笔者从四川省内川东、川南、川西、川北、川中5个片区的17个规模猪场采集血清样品1454份,采用液相阻断ELISA方法进行口蹄疫O型和A型免疫抗体检测.结果显示:FMD-O型抗体总阳性率为83.29％,FMD-A型抗体总阳性率为80.26％;17个规模猪场的FMD-O型、A型抗体场群免疫合格率均为76.47％;哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、经产母猪、种公猪、后备猪的FMD-O型抗体阳性率分别为84.95％、68.67％、81.31％、94.23％、88.03％、100％,FMD-A型抗体阳性率分别为80.65％、60.96％、79.75％、93.53％、88.03％、100％.本试验表明,四川省规模化猪场口蹄疫免疫效果总体较好,但部分猪场的免疫抗体水平不高,因此规模猪场仍需加强监测和免疫,降低口蹄疫的发生风险.

猪腹泻相关的冠状病毒是可引起猪只呕吐、腹泻和脱水等相关症状的传染性疾病,仔猪感染后死亡率可达100％,对养猪业造成了巨大的经济损失,为此,众多学者对该病的诊断与检测方法进行了大量的研究,建立了临床诊断、病原分离等传统的诊断方法以及免疫学、分子生物学等新兴诊断方法.研究猪腹泻相关冠状病毒的诊断与检测方法对该类疫病的防控具有重要的意义.对猪腹泻相关冠状病毒的检测方法研究进展进行了综述.

兔病毒性出血症2型(RHD2)是由兔出血症病毒2型(RHDV2)引起的家兔和野兔的高度传染性、急性致死性疫病.RHDV2目前主要在欧洲流行,引起的临床症状与经典兔病毒性出血症(RHD)相似,但毒株特性差异较大.2020年4月四川省两个兔场的家兔同时出现了疑似RHD症状,但用经典RHDV疫苗免疫后家兔发病及死亡情况均无好转.分别采集两个兔场的病死兔组织样品进行实验室诊断,使用OIE推荐的RHDV2特异性引物进行RT-PCR检测,两个发病兔场的兔组织混合样品均扩增出大小约800bp的片段.进一步的测序和Blast比对分析发现来自两个发病兔场的2条序列均与RHDV2参考毒株的VP60部分序列高度同源,其中同源性最高的是荷兰RHDV2分离株RHDV2-NL2016,分别为98.01％和97.95％.分析结果表明,报告发病的两兔场的病死兔均为RHDV2感染,这是我国首次官方确诊RHD2疫情.分别将两个兔场组织病料中的RHDV2毒株命名为SCADC-JT01和SCADC-JT02,有关这2株新毒株的毒株特性和基因组特征还有待进一步研究.

目的 了解四川地区不同生猪养殖模式场点猪源戊型肝炎的流行情况.方法 于2019-2020年在四川21个市州的规模化养殖场、散户收集了猪肛拭子800份、血清1600份,荧光RT-PCR检测、ELISA检测.结果 四川生猪HEV总体带毒率较低(10.25％,82/800),总体感染率较高(41.06％,657/1600),散户带毒率、感染率均高于规模化养殖场;不同经济区域之间,带毒率为川西北最高、川东北最低,感染率为攀西最高、川西北最低.结论 HEV感染在四川各地区健康猪群广泛存在,不同经济区域间带毒率和感染率存在差异.

在2019年春、秋季集中免疫后,分别采集四川省21个市(州)被抽检县(区)的规模场、散养户、屠宰厂的猪血清共2306份,采用ELISA方法进行口蹄疫O型免疫抗体检测.结果显示,2019年全省猪O型口蹄疫免疫抗体的平均合格率为85.0％(1960/2306),其中春季检测1556份,合格1370份,合格率为88.05％;秋季检测750份,合格590份,合格率为78.67％.结果表明我省2019年春秋两季猪O型口蹄疫疫苗免疫均取得理想效果,能够对猪群提供免疫保护.

高致病性禽流感是严重危害养禽业的重要传染病之一,属于国家强制免疫病种.为了解四川省2018年高致病性禽流感疫苗的免疫效果,分别在春秋两次集中免疫后,从四川省21个市(州)共采集禽血清样品3667份,采用血凝抑制试验(HI)分别进行H5和H7亚型禽流感抗体水平检测.结果显示:禽流感H5亚型免疫抗体合格3553份,平均合格率为96.89％,其中,春季合格率为96.52％(1777/1841),秋季合格率为97.26％(1776/1826).禽流感H7亚型免疫抗体合格3515份,平均合格率为95.85％,其中,春季合格率为95.44％(1757/1841),秋季合格率为96.28％(1758/1826).表明四川省2018年高致病性禽流感疫苗免疫取得明显效果.

为了了解市场上不同毒株猪伪狂犬病活疫苗的稳定性和体液免疫效果,本试验对市场上销售的6种猪伪狂犬病活疫苗进行了稀释稳定性测试和免疫效力测试.结果显示:不同疫苗使用配套稀释液稀释后稳定性差异较大,稀释后常温放置1 h,有3种疫苗的病毒含量无变化,有2种疫苗的病毒含量下降约50％,稀释后常温放置4 h,稳定性差的疫苗的病毒含量仅为稀释前的14.79％,稀释后4 h 6种疫苗的病毒含量均高于疫苗参考标准;所有疫苗免疫后均能刺激仔猪产生特异性免疫抗体,不同疫苗间gB-ELISA抗体的产生规律基本一致;不同疫苗免疫后使用猪伪狂犬病毒2型XJ株测定中和抗体,发现仅1种疫苗的中和抗体较高,其余疫苗对猪伪狂犬病毒2型XJ株的中和能力较差,且中和抗体较差的疫苗在使用免疫增强剂后其中和抗体也无实质性提高.

兽医实验室样品的管理是实验室开展检测工作的重要环节,是实验数据准确和公正的基本条件.为保证检测样品的有效性和完整性,确保检测结果的准确,从检测样品的接收、标识、流转、贮存及样品的处置等环节对样品管理程序进行简要介绍.

于2018年春、秋季集中免疫后,从四川省21个市(州),每个市(州)随机抽取一个县(区)分别采集规模场和散养户的猪、牛、羊血清共4318份,采用ELISA方法进行口蹄疫O型、Asia 1型、A型免疫抗体监测.结果显示,全省O型口蹄疫免疫抗体平均合格率为88.81％,其中猪血清的合格率为90.82％,牛、羊血清的合格率为85.14％;全省Asia 1型口蹄疫抗体合格率为85.48％;全省A型口蹄疫合格率为98.03％.