The taxonomic species Palyam virus (PALV) comprises a group of widely distributed, Culicoides-borne arboviruses linked to bovine reproductive disorders, yet its genetic diversity and seroprevalence in China have not been fully characterized. To address this gap, we obtained 29 PALV isolates from sentinel cattle in southern China, performed whole-genome sequencing on 15 representative strains, and conducted a nationwide serosurvey of 4660 cattle using a newly developed c-ELISA. These genomic data were integrated with global datasets for comprehensive phylogenetic and phylogeographic analyses. By establishing a global VP2-based framework, the Chinese PALV isolates were assigned to the Chuzan, Bunyip Creek, and D’Aguilar genogroups. In the global context, Chinese PALV strains exhibited the closest genetic affinity with strains from Japan, while phylogeographic reconstruction suggests at least two independent introductions from Japan during the 1980s and 1990s. Our survey revealed a high overall seroprevalence of 46.5% (95% CI: 44.7–47.5%) in cattle, demonstrating a pronounced latitudinal gradient with a sharp ecological threshold at 32.5° N. The virus is hyperendemic in humid southern China, with seroprevalence ranging from 33.0% to 88.8%, but attenuated in northern regions with seroprevalence less than 8.0%. These findings redefine PALV as a widespread “silent threat” in the East Asian arbovirus ecosystem, highlighting the need for coordinated transboundary surveillance.

A pan-specific colorimetric reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay was developed to detect Chinese epizootic haemorrhagic disease virus strains (EHDVs) inaugurally. The assay could be completed in 45 min at 64 °C, and could detect as few as 15 copies of EHDV RNA, the coincidence rates of the established RT-LAMP assay and previously reported qRT-PCR were more than 86.7 % in the clinical evaluation.

A lytic Proteus mirabilis phage, PmP19, was isolated from sewage on a farm. PmP19 has an icosahedral head (60 ± 3 nm in diameter) and a short tail (15 ± 2 nm long). Its genome, a linear, double-stranded DNA molecule 44,305 bp in length with an average GC content of 51.93

东南亚十二节段RNA病毒属为呼肠孤病毒科中的一个新属,该属包括版纳病毒(BAV)、芒市病毒(MSV)、卡皮罗病毒(KDV)和辽宁病毒(LNV)四种病毒.为建立上述四种病毒的群特异性核酸检测方法,本研究根据BAV、MSV、KDV和LNV毒株VP12基因序列的保守区,设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量qRT-PCR和常规RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、灵敏性和重复性的检测.实验结果表明,两种检测方法分别对四种病毒均有特异性的扩增和荧光信号检出,而对流行性出血病病毒(EHDV)、蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)、广西环状病毒(GXOV)、阿卡斑病毒(AKAV)、云南环状病毒(YUOV)等病毒无扩增和无有效荧光信号检出,具有较好的特异性.灵敏性实验结果显示,荧光定量qRT-PCR检测四种病毒核酸的下限可达10 copies/μL,常规RT-PCR的检测下限为102 copies/μL,荧光定量方法灵敏度是常规方法的10倍.四种病毒荧光定量qRT-PCR方法的组内和组间重复试验标准差均小于0.8,变异系数均小于3％,表明该方法均具有良好的稳定性.以上结果表明,本研究建立的BAV、MSV、KDV和LNV四种病毒的荧光定量qRT-PCR和常规RT-PCR方法具有快速、准确、稳定等优点,可为四种病毒的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法.

Introduction bluetongue virus (BTV) infection triggers dramatic and complex changes in the host's transcriptional profile to favor its own survival and reproduction. However, there is no whole-transcriptome study of susceptible animal cells with BTV infection, which impedes the in-depth and systematical understanding of the comprehensive characterization of BTV-host interactome, as well as BTV infection and pathogenic mechanisms. Methods to systematically understand these changes, we performed whole-transcriptome sequencing in BTV serotype 1 (BTV-1)-infected and mock-infected sheep embryonic testicular cells, and subsequently conducted bioinformatics differential analyses. Results there were 1504 differentially expressed mRNAs, 78 differentially expressed microRNAs, 872 differentially expressed long non-coding RNAs, and 59 differentially expressed circular RNAs identified in total. Annotation from the Gene Ontology, enrichment from the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, and construction of competing endogenous RNA networks revealed differentially expressed RNAs primarily related to virus-sensing and signaling transduction pathways, antiviral and immune responses, inflammation, and development and metabolism related pathways. Furthermore, a protein-protein interaction network analysis found that BTV may contribute to abnormal spermatogenesis by reducing steroid biosynthesis. Finally, real-time quantitative PCR and western blotting results showed that the expression trends of differentially expressed RNAs were consistent with the whole-transcriptome sequencing data. Discussion this study provides more insights of comprehensive characterization of BTV-host interactome, and BTV infection and pathogenic mechanisms.

[目的]了解西南边境地区牛感染中山病病毒(Chuzan virus,CHUV)的情况.[方法]应用BHK21细胞对云南景洪、江城采集的312份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,对出现细胞病变的毒株进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S7、S2基因序列测定和比对分析.[结果]4份血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳发现,4株分离毒株基因组为10节段,带型为"3-3-4",与2012年云南师宗分离的CHUV SZ187毒株相似;4株病毒S7、S2基因核苷酸序列相似性分别为98.7％～99.7％和97.9％～99.1％;S2基因片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的SZ187、GHN-GS-16等毒株相似性最高;S7基因片段核苷酸和氨基酸序列与日本分离的ON-1/E/18、ON-3/E/17及中国本土的SZ187、GHN-GS-16等毒株的相似性最高.S7、S2基因遗传进化分析结果显示,4株新分离毒株亲缘关系最近;4株毒株的S7基因序列与中国本土和日本分离的已知帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)毒株位于同一分支,提示4株毒株为PALV,且形成一簇,有一定的地域性;4株毒株S2基因片段核苷酸序列与中国本土分离的CHUV位于同一分支,亲缘关系较近,进一步证实这4株毒株为CHUV.[结论]本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到CHUV毒株,为CHUV在中国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据.

目的 掌握云南省动物病毒的多样性和传播风险.方法 在云南省师宗县设立10头哨兵牛,定期采血接种细胞进行病毒分离.通过RT-PCR、电镜观察、高通量测序与血清中和试验进行分离病毒的鉴定、全基因组序列获取与流行病学调查.结果 2017年从采集的哨兵牛血液样本中分离出2株蓝舌病病毒、3株帕利亚姆病毒、2株流行性出血病病毒和1株待鉴定病毒(YNSZ/V 207/2017).电镜下YNSZ/V207/2017病毒粒子直径约80 nm,呈二十面体对称;全基因组序列分析显示其为哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus,MRV)血清1型毒株(MRV-1),病毒的不同基因节段分别与人、白尾鹿、水貂、果子狸和棕蝠上分离MRV的序列相似度最高;血清中和试验表明当地牛、羊和猪中MRV-1的抗体阳性率分别为32.5％、20.0％和42.5％.结论 在云南省牛血液标本中分离出1株MRV-1型毒株,该毒株可能为不同宿主来源的基因重配毒株,MRV-1在当地家畜中广泛流行.

为建立快速鉴别蓝舌病病毒血清29型(BTV-29)的方法,根据BTV-29型毒株基因节段2(Seg-2)的序列特征,分别设计用于RT-PCR与qRT-PCR方法的特异性引物与TaqMan探针,通过试验确定其敏感性,用BTV-1～BTV-24等核酸作为对照评价其特异性.对BTV-29感染动物血液样本中的病毒核酸进行监测,并用BTV群特异qRT-PCR方法验证其可靠性.结果 显示,建立的BTV-29特异RT-PCR的灵敏度是1.12×102 copies/μL,而BTV-29特异qRT-PCR的灵敏度是1.12×101 copies/μL,均与BTV-1～BTV-24、流行性出血病病毒、帕利亚姆病毒和阿卡斑病毒之间无交叉反应;用BTV-29特异qRT-PCR检测BTV-29型感染山羊血液中的BTV-29核酸的动态变化,结果与BTV群特异qRT-PCR检测结果基本一致.本研究建立的BTV-29特异RT-PCR和qRT-PCR方法均具有良好的特异性和较高的灵敏度,能快速鉴别BTV-29,为BTV-29的致病性、诊断与流行病学研究提供了技术保障.

Tibet orbivirus (TIBOV), a new candidate of Orbivirus genus, was initially isolated from mosquitoes in Tibet in 2009 and subsequently from both Culicoides and mosquitoes in several provinces of China and Japan. Little is known about the origin, genetic diversity, dissemination and pathogenicity of TIBOV, although its potential threat to animal health has been acknowledged. In this study, two viruses, V290/YNSZ and V298/YNJH, were isolated from the Culicoides and sentinel cattle in Yunnan Province. Their genome sequences, cell tropism in mammalian and insect cell lines along with pathogenicity in suckling mice were determined. Genome phylogenetic analyses confirmed their classification as TIBOV species; however, OC1 proteins of the V290/YNSZ and V298/YNJH shared maximum sequence identities of 31.5% and 33.9% with other recognized TIBOV serotypes (TIBOV-1 to TIBOV-4) and formed two monophyletic branches in phylogenetic tree, indicating they represented two novel TIBOV serotypes which were tentatively designated as TIBOV-5 and TIBOV-6. The viruses replicated robustly in BHK, Vero and C6/36 cells and triggered overt clinical symptoms in suckling mice after intracerebral inoculation, causing mortality of 100% and 25%. Cross-sectional epidemiology analysis revealed silent circulation of TIBOV in Yunnan Province with overall prevalence of 16.4% (18/110) in cattle, 10.8% (13/120) in goats and 5.5% (6/110) in swine. The prevalence patterns of four investigated TIBOV serotypes (TIBOV-1, -2, -5 and 6) differed from each one another, with their positive rates ranging from 8.2% (9/110) for TIBOV-2 in cattle to 0.9% (1/110) for TIBOV-1 and TIBOV-5 in cattle and swine. Our findings provided new insights for diversity, pathogenicity and epidemiology of TIBOV and formed a basis for future studies addressing the geographical distribution and the zoonotic potential of TIBOV.

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)为环状病毒属新成员,2009年首次在西藏墨脱县多斑按蚊中发现,目前该病毒对动物健康和公共卫生的危害尚不清楚,本文首次报道了牛体上一株新型TIBOV的分离.2019年在云南省景洪市设置哨兵牛3头,每周采血进行虫媒病毒的监测与病毒分离.监测期的第4周,其中一头牛采集的血液样本接种C6/36细胞盲传3代出现细胞病变,提取病毒核酸进行琼脂糖凝胶电泳,显示病毒基因组为10节段双链RNA,呈"3-3-3-1"的带型特征.电镜观察可见直径约70nm,具有环状病毒属病毒典型形态特征的病毒粒子,将分离的病毒命名为V298/YNJH/2019.对决定环状病毒种属的基因节段及其编码蛋白(Seg-3/T2)序列分析显示,分离毒株的Seg-3/T2与其它TIBOV毒株的核酸(nt)与氨基酸序列(aa)相似度分别在79.6％～79.9％与96.3％～96.4％之间,其T2蛋白在系统发生树上与其它TIBOV聚为一簇;对决定病毒血清型的基因节段及其编码蛋白(Seg-2/OC1)的序列分析显示,分离毒株与其它TIBOV毒株Seg-2/OC1的序列相似度分别在42.3％～43.4％(nt)与29.3％～31.7％(aa)之间,其OC1蛋白形成独立于其它TIBOV毒株的进化分支,以上结果提示V298/YNJH/2019为一种新血清型TIBOV.通过实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验,对病毒在牛上感染特征的回溯分析显示:在分离到病毒的前一周,动物血液中可检到低水平的病毒核酸,在分离到病毒的当周,血液中病毒核酸含量处于高峰,但两周后检测结果为阴性;动物在病毒感染后第2周开始产生中和抗体,在随后两周达到高峰,在感染后4个月仍保持较高水平.本研究首次报道了一种新型TIBOV在牛体上的分离,丰富了我国流行TIBOV多样性与感染特性的认知,为TIBOV的流行病学、致病性与诊断试剂的研究提供了基础.

研究旨在表达流行性出血病病毒(EHDV)VP7蛋白并制备其多克隆抗体,为EHDV检测方法的建立提供材料.试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达,通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体,通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验(IFA)分析多克隆抗体的效价与反应原性.结果显示,在37℃与IPTG(0.1 mmol/L)的诱导下,VP7重组蛋白(分子质量46 ku)以包涵体形式高效表达,纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52％,可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合.制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1:24000;以制备的多克隆抗体为一抗,通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达.本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达,制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性,为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料.

为分析云南省虫媒病毒的种类与遗传特征,在云南省师宗县采集库蠓进行病毒的分离与鉴定;通过全长cDNA扩增与高通量测序技术获取病毒全基因组序列,进行序列比对与系统发生树构建.结果显示,从采集的库蠓样本中分离出1株可在C6/36细胞上引起细胞病变的毒株(YNSZ043),病毒基因组为分节段双链RNA,琼脂糖凝胶电泳呈"2-4-3"的带型特征;电镜观察可见直径为70～80 nm,呈"指环状",表面具有纤维突起的病毒粒子.全基因组测序结果显示,YNSZ043毒株为版纳病毒(Banna virus,BAV),基因组大小为20683 bp,由Seg-1(3762 bp)至Seg-12(861 bp)12个基因节段组成,与中国BAV毒株各基因节段的核苷酸序列相似性在64.8％～99.6％之间,氨基酸序列相似性在58.8％～100％之间,在系统发生树上YNSZ043毒株与中国分离的BAV聚为一簇,形成独立的中国进化支系.对决定BAV基因型的Seg-12分析结果显示,YNSZ043毒株属于A2基因型,该毒株的Seg-5/VP5与越南分离BAV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性高达97.1％和97.6％,表明该毒株的Seg-5基因节段很可能与越南毒株之间发生了基因重配.研究结果丰富了中国BAV的基因组序列,为开展云南省BAV的流行病学研究提供了参考.

2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(B T V-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BT V-7型毒株并掌握其遗传特征.作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、B H K-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细胞上的感染特性,采用高通量测序获取分离毒株的全基因组序列,通过qRT-PCR与血清中和试验对哨兵牛血液中的病毒核酸与中和抗体变化进行回溯分析.结果表明:2020年5月,分离到1株能引起B H K-21细胞发生细胞病变的病毒(毒株号V303/YNJH/2020),经鉴定为BTV-7型.分离毒株的基因组全长19154 bp(GenBank收录号MW046280至MW046289),与广东省2014年分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,基因节段1至6,基因节段9与10的核酸与编码蛋白氨基酸序列(nt/aa)相似度分别大于98％、99％;V303/YNJH/2020毒株的基因的节段7和基因节段8属Western地域型,与广东GDST008毒株对应基因节段的nt/aa序列相似度仅为71.5％/81.6％、79.6/％84.4％.病毒蚀斑与增殖曲线比较显示,V303/YNJH/2020在BHK-21细胞的增殖能力明显强于GDST008.回溯分析显示,感染V303/YNJH/2020的哨兵牛未出现临床症状,血液中的病毒核酸持续存在长达12周;在病毒感染后第4～9周,血液中的中和抗体滴度水平维持在1:256.云南省2020年分离的B T V-7型V303/YNJH/2020毒株与广东省分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,在BHK-21细胞上的增殖能力强于GDST008毒株;V303/YNJH/2020虽未引起感染动物的临床症状,但病毒核酸与中和抗体在感染动物血液中长时间存在.研究结果为开展BT V-7型在我国的演化规律、病毒变异以及致病性等方面的研究奠定了基础.

蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)的VP6蛋白(viral structural protein 6)在病毒复制与基因组组装中发挥着重要作用,构建稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系,可为VP6蛋白功能研究及基因工程疫苗研制提供基础资料.本研究通过RT-PCR扩增BTV的VP6基因,分别构建出表达VP6蛋白的原核表达质粒pET32-BTV-VP6与真核表达质粒pCDH-BTV-VP6.将pET32-BTV-VP6转入大肠杆菌(Escherichia coli),在16℃进行诱导培养,VP6重组蛋白部分以可溶形式表达,表达量约为总菌体蛋白的24.5％.采用镍离子亲和层析对表达的VP6重组蛋白进行纯化并免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculu),制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,抗体效价可达1:12000;Western blot与免疫荧光染色证实,制备的多克隆抗体可与BTV感染细胞产生的VP6蛋白发生特异性结合.将真核表达质粒pCDH-BTV-VP6转染BHK-21细胞,使用嘌呤霉素对转染后的细胞进行连续筛选,构建稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系BHK-BTV-VP6;以兔抗VP6多克隆抗体为一抗,进行Western blot与免疫荧光检测,证实VP6蛋白在细胞中稳定表达.本研究实现了BTV VP6重组蛋白在大肠杆菌中的成功表达与纯化,构建了稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系,为BTV VP6蛋白功能研究以及新型基因工程疫苗研发提供物质基础.

[目的]掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险.[方法]在云南省景洪市设立哨兵牛3头,每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离.通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定,采用实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析.[结果]2019年,在监测期第13周,从1头哨兵牛的血液中分离出1株致C6/36细胞病变的病毒(V301/YNJH/2019),电镜观察可见直径约70 nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子,琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组为双链RNA,RT-PCR鉴定分离毒株为芒市病毒(MSV).测序显示,分离毒株的基因节段Seg-4和Seg-7长度为2055和1122 bp,编码病毒的外层衣壳蛋白VP4(628 aa) 和VP7(298 aa),基因节段Seg-2和Seg-9长度为3055和1076 bp,编码病毒的内层衣壳蛋白VP2(956 aa) 和VP9(283 aa);分离毒株与云南省芒市分离的MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系,核酸序列相似度在97.4％ (Seg-9)～98.5％ (Seg-2)之间,氨基酸序列相似度在96.4％(VP9)～98.4％(VP2)之间.病毒感染的回溯分析显示,监测期的第11周,牛血液中病毒核酸检测呈阳性,病毒核酸含量在第13周达到高峰,随后快速降低,在第18周转为阴性;感染哨兵牛在监测期的第13周已产生特异性中和抗体(1:14),在第16～18周处于高峰(1:226),至监测结束的第24周降低为1:57.[结论]本文从牛体中分离到了MSV,表明牛是MSV的易感动物之一,病毒在感染牛上呈"一过性感染"的特征.研究结果为进一步开展MSV的检测诊断、流行病学调查与致病性研究奠定了基础.

本试验旨在探明绵羊感染16型蓝舌病病毒(Bluetongue virus type 16,BTV16)后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的消长特点.用实时荧光定量PCR检测方法对感染BTV16后3只绵羊上述4种因子mRNA进行检测,同时设立阴性对照绵羊,并以0 d mRNA为基准,计算mRNA的相对表达量,同时检测病毒抗体效价、测量绵羊体温.结果显示,接种BTV16的3只绵羊均不同程度产生抗体和体温症状,4种细胞因子的mRNA在接种病毒2～4 d内均出现显著上升,其中IFN-γ峰值在2.58?27.84倍之间,IL-2峰值在5.24?17.19倍之间,IL-4峰值在2.16～3.43倍之间,IL-10峰值在15.78?48.77倍之间,个体上升幅度存在显著差异,4种细胞因子均在高水平持续6d左右后逐渐下降.对照绵羊上述参数在正常范围内波动.本研究阐明了接种BTV16后绵羊细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10在转录水平上的消长特点,为进一步深入开展BTV感染特征、宿主机体免疫机制研究提供参考.

BACKGROUND:Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) are vectors for many arboviruses. At least 20 species are considered as vectors or potential vectors of bluetongue virus (BTV) which cause bluetongue disease in ruminants. A BTV prevalence of 30-50% among cattle and goats in tropical southern Yunnan Province, China, prompted an investigation of the potential BTV vectors in this area. METHODS:Culicoides were collected by light trapping at three sites in the tropical region of Yunnan Province. Species were identified based on morphology and DNA sequences of cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1). PCR and quantitative PCR following reverse transcription were used to test for the presence of BTV RNA in these specimens. Phylogenetic analysis was used to analyze the cox1 sequences of Culicoides specimens infected with BTV. RESULTS:Approximately 67,000 specimens of Culicoides were collected, of which 748 were tested for the presence of BTV. Five specimens, including two of Culicoides jacobsoni, one of C. tainanus and two of C. imicola, were identified as infected with BTV. No specimens of C. (subgenus Trithecoides) or C. oxystoma tested were positive for BTV infection. CONCLUSIONS:To our knowledge this is the first report of C. jacobsoni as a potential BTV vector and the fourth report of an association between C. tainanus and BTV, as well as the first direct evidence of an association between BTV and C. imicola in Asia. A fourth potential cryptic species within C. tainanus was identified in this study. Further analysis is required to confirm the importance of C. jacobsoni and C. tainanus in BTV epidemiology in Asia.

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估.实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL(BTV-8)至57拷贝/μL(BTV-14)之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性.反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92％至1.96％之间,组间Ct值的变异系数在0.26％至1.62％之间.对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT-PCR可有效检测含50个PFU(噬斑形成单位)的BTV血液样本.本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT-PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断.

[背景]蓝舌病病毒(Bluetongue Virus,BTV)是一种侵染反刍动物的虫媒病毒,基因重配可引起病毒的快速变异.[目的]通过我国强致病性BTV-16型毒株与弱致病性BTV-4型毒株间Seg-2与Seg-6基因节段的重配,探讨病毒基因重配与表型变异之间的关系.[方法]采用全长cDNA扩增与高通量测序获取BTV-16/V158的全基因组序列,构建病毒的真核表达质粒,通过免疫荧光与Western Blot检测目的蛋白表达;通过RT-PCR、体外转录与细胞转染等方法建立BTV反向遗传体系并获取基因重配病毒;通过蚀斑分析、增殖曲线分析与血清中和试验,比较亲本毒株与基因重配病毒在生物学特性上的差异.[结果]获取的BTV-16/V158毒株基因组大小为19 186bp,与中国和印度BTV-16型毒株具有最近的亲缘关系;将表达BTVVP1、VP3与NS2的真核表达质粒转染细胞,检测到目的蛋白的表达;将BTV的7种真核表达质粒与基因组ssRNA共转染BHK-21细胞,成功拯救出与亲本毒株生物学特性一致的病毒;将BTV-16/V158毒株的Seg-2与Seg-6替换为BTV-4/YTS4毒株的对应基因节段,拯救出基因重配病毒BTV-16/V158-RG(BTV-4/S2,S6);与亲本病毒相比较,基因重配病毒在BHK-21细胞上形成的蚀斑变小,增殖能力减弱,血清型由BTV-16型转化为BTV-4型.[结论]建立了我国流行BTV-16型毒株的反向遗传体系,BTV Seg-2与Seg-6的基因重配可引起病毒在细胞上增殖能力的改变与血清型改变.研究结果为BTV基因重配致病毒变异与新型基因工程疫苗的研究提供了基础.

流行性出血病病毒(EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒.目前世界范围已发现9种血清型的EHDV,2018年笔者在云南芒市新分离到1株新血清型EHDV毒株(YNDH/V079/2018),但尚缺乏该血清型的特异性检测方法.本研究建立了新血清型EHDV核酸检测的实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和RT-PCR方法.试验结果显示,建立的两种方法均具有良好的特异性与灵敏度,与另外7种血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)、阿卡斑病毒(AKAV)和阴性对照均无交叉反应.对病毒核酸的检测下限分别达到10 copies/μL (qRT-PCR)与102 copies/μL(RT-PCR).临床样品检测显示,qRT-PCR能在动物感染EHDV早期检测鉴定出病毒,更适合应用于检测病毒载量较低的血液样品.RT-PCR的扩增产物可以胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息,两种方法辅助使用,为新血清型EHDV的早期快速诊断、流行病学调查和试验研究等提供了有效的技术方法.