Chikungunya virus (CHIKV) is an arbovirus that can lead to chronic arthritis and significantly diminish the quality of life of patients. Given the expanding global prevalence of CHIKV and the absence of specific antiviral therapies, there is an urgent need to explore effective treatment options. This study aimed to evaluate the antiviral effects of shikimic acid (SA) against CHIKV through a combination of network pharmacology, molecular docking, and in vitro assays. Network pharmacology analysis identified 26 potential targets through which SA could inhibit CHIKV, including key pathogenic targets such as TNF, IL-6, and MAPK3. This hypothesis was further supported by molecular docking. The molecular docking analysis revealed that SA could interact with multiple CHIKV-related targets, including EGF, with vina scores generally lower than −6, indicating a high propensity for stable complex formation. The results also suggested that SA could potentially disrupt the IL-17 signaling pathway by engaging with various targets to form complexes. In vitro experiments confirmed that SA significantly enhanced the viability of 293T and BHK-21 cells infected with CHIKV by ~25% and reduced viral load by over 20% at concentrations ranging from 1,000 to 31.25 μM. Additionally, SA was found to markedly downregulate the expression of CHIKV-related attachment factors ACTG1, TSPAN9, and TIM-1 in 293T cells infected with CHIKV. Furthermore, RT-qPCR analysis demonstrated that SA effectively decreased the expression of NFKB1, PTGS2, RELA, and EGF related to the IL-17 signaling pathway. In conclusion, these findings indicate that SA is a promising candidate for developing treatment strategies targeting CHIKV with good clinical application value.

IntroductionSalmonella, Escherichia coli, Lawsonella intracellularis, and Brachyspira hyodysenteriae are the primary pathogens responsible for gastrointestinal diseases in pigs, posing a significant threat to the health and productivity of pig production systems. Pathogen detection is a crucial tool for monitoring and managing these infections.MethodsWe designed primers and probes targeting the invA gene of Salmonella, the 23S rRNA gene of Escherichia coli, the aspA gene of Lawsonella intracellularis, and the nox gene of Brachyspira hyodysenteriae. We developed a quadruplex TaqMan real-time quantitative PCR assay capable of simultaneously detecting these four pathogens.ResultsThis assay demonstrated high sensitivity, with detection limits of 100 copies/μL for the recombinant plasmid standards pEASY-23S rRNA, pEASY-aspA, and pEASY-nox, and 10 copies/μL for pEASY-invA. The standard curves exhibited excellent linearity (R2 values of 0.999, 0.999, 1, and 0.998, respectively) and high amplification efficiencies (93.57%, 94.84%, 85.15%, and 81.81%, respectively). The assay showed high specificity, with no cross-reactivity detected against nucleic acids from Streptococcus suis, porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV), porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Pasteurella multocida, Clostridium perfringens, Gracilaria parapsilosis, porcine delta coronavirus (PDCoV), porcine group A rotavirus (GARV), and porcine teschovirus (PTV). The assay also exhibited excellent repeatability, with inter- and intra-assay coefficient of variation (CV) ranging from 0.15% to 1.12%. High concentrations of nucleic acids did not interfere with the detection of low concentrations, ensuring robust performance in complex samples. Among 263 diarrhoeic samples, the assay detected Salmonella in 23.95%, Escherichia coli in 26.24%, Lawsonella intracellularis in 33.84%, and Brachyspira hyodysenteriae in 22.43%.DiscussionThis quadruplex TaqMan qPCR assay offers a rapid, sensitive, and specific tool for the simultaneous detection of Salmonella, Escherichia coli, Lawsonella intracellularis, and Brachyspira hyodysenteriae in pigs.

旨在建立一种简便、高效的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检测方法.本研究针对TGEV N基因设计了特异性的引物和探针,并构建重组质粒标准品TGEV-N,经过筛选及优化后建立TGEV 荧光逆转录重组酶介异等温扩增(reverse-transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)检测方法.结果显示,该方法在42℃恒温条件下进行,20 min即可完成检测,与猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒、猪肠道α冠状病毒等猪源病毒均无交叉反应;将TGEV-N稀释后,以100～106拷贝·μL-1作为模板,进行敏感性试验,结果表明,该方法最低检出限可以达到6.62×101拷贝·μL-1;采用该方法对50份猪源样品进行检测,阳性率为6％(3/50),检测结果与RT-PCR一致.本试验建立的TGEV荧光RT-RAA检测方法简便、高效、特异、灵敏,为TGEV的临床筛查提供可行技术.

Chikungunya virus (CHIKV) is a mosquito-borne virus. The emergence of CHIKV infection has raised global concern, and there is a growing need to develop safe and effective vaccines. Here, adenovirus 5 was used as the vaccine vector to construct recombinant adenoviruses expressing CHIKV E2, E1, and E2-6K-E1, respectively. And then the immunogenicity and protective efficiency against CHIKV were evaluated in BALB/c mice. Compared to the ad-wt control group, all three vaccines elicited significant humoral and cellar immune responses. The levels of neutralizing antibodies in the rAd-CHIKV-E2-6K-E1 and rAd-CHIKV-E2 groups both reached 1:256, which were 3.2 times higher than those in the rAd-CHIKV-E1 group. Furthermore, the levels of lymphocyte proliferation in rAd-CHIKV-E2-6K-E1 group were the highest. Besides, the concentrations of IFN-γ and IL-4 in mice immunized with rAd-CHIKV-E2-6K-E1 were 1.37 and 1.20 times higher than those in ad-wt immunized mice, respectively. After the challenge, mice in the rAd-CHIKV-E2-6K-E1 and rAd-CHIKV-E2 groups lost 2% of their body weight compared with 5% in the ad-wt control group. And low viral loads were detected in the heart, kidney, and blood of mice immunized with rAd-CHIKV-E2-6K-E1 and rAd-CHIKV-E2 at 3–5 dpc, which decreased by 0.4–0.7 orders of magnitude compared with the ad-wt control. Overall, these data suggest that the recombinant adenovirus is a potential candidate vaccine against CHIKV.

为建立一种高效、简便的犬圆环病毒(CCV)的检测方法,本研究针对CCV Rep基因设计了特异性引物和探针,同时构建了基于该病毒Rep基因的重组质粒标准品pCCV-Rep,经过优化后确定了CCV重组酶介导核酸等温扩增(RAA)检测方法引物、探针的最适浓度均为10μmol/L,在39℃恒温条件下20 min即可完成检测.利用该方法检测犬圆环病毒、狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒等其他常见的犬源病毒,结果显示除CCV外,该方法对其他病毒均无交叉反应,特异性较强;将pCCV-Rep分别稀释为106拷贝/μL～100拷贝/μL后作为模板,进行敏感性试验,结果显示该方法最低检出限可达102拷贝/μL,敏感性较高;批内批间重复性试验结果均表明该方法具有良好的重复性.采用该方法与常规PCR方法同时检测82份犬粪便拭子,结果显示,该RAA方法检出阳性样品5份,检测结果与常规PCR一致.本实验首次建立的CCV荧光RAA检测方法简便、高效、特异、灵敏,为CCV的临床筛查与流行病学研究提供了可行技术.

为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3'端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法.结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×101～1.41×1010 copies/μL具有良好的线性关系,相关性为1,斜率为-3.502;灵敏性结果显示,该方法的检测限度为1.41×101 copies/μL,是普通PCR的10000倍;特异性结果显示,对CHIKV、DENV和JEV无特异性扩增,特异性强;重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于1％,重复性好.本研究建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法,可用于寨卡病毒感染的快速诊断.

研制具有广谱作用的新型纳米重组亚单位疫苗,为新型流感纳米疫苗的研发奠定基础.将跨膜蛋白M2的胞外域(M2e)和H1、H3、B亚型流感血凝素的第2亚单位的保守区域通过4GS蛋白Linker连接至铁蛋白,将M2e-HA2-Ferrtin基因(MHF基因)克隆至原核表达载体pET32a,将重组质粒转化到感受态细胞BL21(DE3),经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)体外诱导表达,通过镍柱纯化,利用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白产物.经透射电子显微镜和纳米粒度仪观察其构象及大小.结果表明成功构建表达纯化重组流感蛋白,经PCR扩增出MHF为1 071 bp大小片段,经SDS-PAGE和Western blot检测蛋白产物,重组流感蛋白以可溶性形式存在,大小为61 kDa且具有生物学活性,电子透射显微镜观察其构型,可见pET32a-M2e-HA2-Ferrtin融合蛋白形成类病毒样颗粒,大小均一.经纳米粒度仪分析,平均粒径Xav=61.58 nm.本研究成功表达纯化并验证多表位流感纳米蛋白,为新型流感纳米疫苗的研制奠定了基础.

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD 19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析.结果 显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×101～6.26×108 copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×101 copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0％;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6％.结果 表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础.

为建立检测山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)的快速诊断方法,本研究根据CAEV甘肃株Gag基因设计1对引物,并以含有CAEV甘肃株全基因组序列的质粒pUC57-CAEV为模板,建立CAEV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性.结果 显示,本研究所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.19×109～1.19×101copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997,斜率为-3.74,检测下限为1.19×101 copies/μL,且对痘苗病毒、山羊痘病毒均无扩增.重复性试验结果显示,批间与批内变异系数均小于1％,重复性好.本研究首次建立了CAEV Gag基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,为CAEV的快速检测和病毒感染预防提供了技术手段.

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断.为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分别设计2对特异性引物,以阳性质粒为模板,对二重RT-PCR反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性试验.结果 显示,所建立的方法能够扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段,大小分别为690 bp和208 bp,且对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)无扩增条带;对PDCoV和PEAV的最低检测量分别为5.13×102 copies/μL、4.73×101 copies/μL.对60份临床腹泻样本病料进行检测,结果PDCoV的检出率为21.6％,未检测出PEAV.本研究所建立的二重RT-PCR方法可用于临床流行病学监测,为快速诊断PDCoV和PEAV提供理论依据和技术支持.

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验.结果 显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×109～7.58×102 copies/μL范围内呈良好线性关系,R2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性.临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高.结果 表明,建立的痘苗病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段.

根据GenBank上已发表的PCV3毒株序列设计1对检测引物和2对扩增全长引物.应用检测引物对广西地区的犬血清样品进行PCR检测,应用扩增全长引物对检测阳性样品进行PCR扩增、克隆和测序,并对其全基因序列进行分析,绘制遗传进化树.结果 显示,广西地区147份犬血清样品中,阳性样品为36份,感染率为24.3％.本试验成功扩增1株2 000 bp的PCV3毒株的全基因核苷酸序列,并命名为PCV3/Guangxi-5.将PCV3/Guangxi-5序列与NCBI公布的PCV3的参考序列进行同源性比对,结果显示PCV3/Guangxi-5与参考序列的全基因序列同源性为98.9％～100.0％,其中与DE27.16同源性最低,与PCV3/CN/Chongqing-148/2016同源性最高.应用MEGA7.0对PCV3进行ORF2基因的氨基酸序列进行比对发现,第24位至第27位氨基酸存在6种形式,分别为VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK.利用MEGA7.0软件中Maximum Likelihood (ML)法p-distance模式构建基于ORF2基因和PCV3全基因的系统发育分析表明,PCV3可分为PCV3a和PCV3b等2种基因型,本试验获得的PCV3/Guangxi-5为PCV3a亚型,其ORF2基因与PCV3/CN/Liaoning-23/2016亲缘关系最近,与NWHEB21、毒株亲缘关系相距最远;其全基因组与CN/Jiangxi-62/2016毒株亲缘关系最近,与CNFJ-1毒株亲缘性最远.结果 表明,广西地区犬群普遍存在感染PCV3的情况,理论上丰富了广西地区PCV3的流行病学资料,为PCV3的防治措施的制定和流行病学研究提供一定的参考依据.

为填补国内外水禽源痘病毒培养特性和理化特性研究方面的空白,对国内检测并鉴定的鹅源禽痘病毒,用鸡胚进行分离培养和病毒理化特性研究.将鹅皮肤痘疹样本研磨后,接种SPF鸡胚进行连续传代培养.病理检查和PCR检测证实,病毒可在鸡胚中增殖,且经连续5轮传代后,鸡胚病变及病毒滴度趋于稳定.鸡胚中可以观察到绒毛尿囊膜水肿增厚及白色痘斑等禽痘特征性病变.对采集病变的绒毛尿囊膜进行电子显微镜观察,可见病毒包涵体和典型禽痘病毒粒子.利用建立的鸡胚培养体系,对该病毒理化特性进行鉴定,发现病毒对热(55℃)、酸(pH3)、碱(pH11)、胰蛋白酶、乙醚和氯仿敏感.本研究首次建立了鹅源禽痘病毒鸡胚培养体系并对其理化特性进行了鉴定,从而为系统开展该病毒生物学特性和防控技术研究提供了必要的技术基础.

目的 建立一种基孔肯雅病毒的快速诊断方法. 方法 采用基孔肯雅病毒E1基因的重组质粒作为阳性标准品.优化反应条件,建立针对基孔肯雅病毒的SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价. 结果 建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的Ct值与阳性标准品在6.94×100～6.94×108 copies/μl范围内呈良好的线性关系,相关性为0.997,斜率为—3.571;其检测下限为0.694 copies/μl,且对ZIKV、DENV和JEV等均无特异性扩增;所有稀释倍数的标准品在84.0℃出现特异性熔解峰;组内和组间变异系数均小于2％.采用该方法对93份蚊虫样品进行检测,基孔肯雅病毒核酸阳性率为2.15％,普通PCR核酸阳性率为1.07％. 结论 成功建立了针对基孔肯雅病毒E1基因的SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法.该方法灵敏、特异,可用于基孔肯雅病毒感染的快速诊断.

为了解广西壮族自治区是否存在猪细小病毒6型(PPV6)毒株,分析其分子特征和遗传进化,本研究利用PCR技术对广西壮族自治区的猪血清临床样本进行检测.结果 表明,广西壮族自治区猪群有PPV6的存在,感染率为18.5％(25/135),与PCV2的共感染率为24.0％％(6/25).与参考毒株的NS1核苷酸同源性为99.4％～99.6％;NS1遗传进化分析表明,GX44毒株和GX3-3毒株与中国参考毒株TJ株、韩国KSU1-AZ-2014株、波兰P15-1株同处一个亚群,而美国U18-9株属于另一个亚群.这一研究结果将为中国PPV6毒株的流行病学调查与分析提供最基础的研究资料.

为了解广西PDCoV流行毒株在猪群中的感染和流行特点,用设计的25对特异性引物从腹泻样本中检测获得1株PDCoV全基因组序列.结果 显示,CHN-GX01-2018株基因组全长25 406 bp,与美国毒株比较存在3处基因缺失,分别位于ORF1a/1b第400～403aa、第756～759aa位置及S基因存在1个氨基酸的缺失.全基因组与S基因遗传进化分析结果显示,CHN-GX01-2018与代表株CHN-AH-2004(安徽株)同源性为97.4％.然而,同源性分析显示中国PDCoV株也存在不同的进化分支,表明PDCoV在中国猪群中不断进化.

为建立灵敏、高效的登革病毒检测方法,本试验拟以包含登革病毒3'端保守序列的质粒pUC57-DENV为模板,建立检测DENV的荧光定量PCR方法.结果 显示,该检测方法在4.88×101～4.88×109copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.653.最低检测限度为4.88 copies/μL,对照组未出现特异性扩增,所有稀释度的标准品在80.20℃出现特异性熔解峰.组内和组间试验的变异系数均小于1％.本试验建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,可为登革病毒早期检测提供技术支持.

本试验旨在调查近年来新发的犬圆环病毒(canine circovirus,CCV)在重庆地区的流行情况,探索重庆流行毒株的特性.本研究利用PCR方法对2017年采集于重庆地区的100份犬血清样品进行CCV核酸检测,对所得CCV阳性样品进行全基因组扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 6.0和RDP4等软件对分离到的重庆CCV毒株进行分析.结果 显示,重庆地区100份犬血清中共有4份为CCV阳性,阳性率为4％,从4份阳性样品中共获得3株不同的CCV基因组(CQ76、CQ79和CQ82),全长基因组序列均为2 062 nt,与此前报道长度为2 063 nt的CCV基因组相比缺少了一个碱基,该碱基位于5'-基因间隔区内茎环结构的下游.3个毒株的两个ORF之间5'末端间隔区和3'末端间隔区长度分别为134(1 929-2 062 nt)和203 nt(913-1 115 nt).CQ76、CQ79和CQ82的同源性在99.8％～100％之间,其中CQ76与CQ82仅在第2 019位点存在同义突变;所获得的3个重庆毒株与国内外报道的其他CCV基因组序列同源性为82.7％～97.1％,其中,ORF2的变异程度大于ORF1.基于病毒ORF2序列和全基因组分别构建NJ进化树中,CQ76、CQ79和CQ82均属于同一亚群,与属于基因Ⅱ型的中国毒株204株遗传距离较近,同源性为96.5％～96.7％.RDP4重组分析发现,CQ76、CQ79和CQ82毒株基因组均为广西毒株204株和388株的重组序列,重组区域坐落于ORF2.本研究为丰富CCV流行病学和遗传进化信息,以及进一步防控研究提供基础数据.

犬圆环病毒(CanineCV)是近年被发现的圆环病毒属新成员,获取CaineCV Cap蛋白,为研究Cap蛋白的功能以及抗原表位奠定了基础.本研究以CaineCV GX2017株基因组作为模板,使用PCR方法扩增出Cap蛋白的基因序列,对其进行生物信息学分析,并克隆至pET-28a原,进行原核表达.结果表明:GX2017的N端2～26位氨基酸存在一个核定位信号,同时含有3个B细胞表位(aa7～aa14;aa150～aa174;aa233～aa253);第134位氨基酸为N-糖基化位点,第169和第238位氨基酸为O-型糖基化位点;进化分析表明,本研究的CanineCV Cap蛋白基因序列与欧美株同源性较低,且处在不同的分支;SDS-PAGE结果显示,重组Cap蛋白在E.coli BL21(DE3)中不能正确表达,切除了NLS的d(1-26)Cap蛋白能在E.coli BL21(DE3)中大量表达;Western blot分析表明,该重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应.本研究成功构建了pET-d(1-26)Cap重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得高水平表达,为进一步制备Cap蛋白的抗体奠定了基础.

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证.结果,建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×108～6.57×101copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2％;灵敏度可达6.57×101copies/μ L;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0％.上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断.