958 lung tissue samples of swine influenza were collected in Guangxi from 2013 to 2014 to further study the pathogenic mechanism and prevention and control technology of influenza virus, and influenza virus isolation and biological characteristics analysis of Eurasian avian influenza (ER-H1N1) were performed. The positive rate of the 14 strains of ER-H1N1 swine influenza virus isolated was 1.46%, with 8 gene pieces all from avian sublineages, followed by recombinant Pdm/09 H1N1 fragments. Although their HA cleavage site is PSIQSR↓GLF or GIF, which has typical low-pathogenicity characteristics, the isolated virus strain grows well on the cell, and after the BALB/c mouse challenge experiment, the evidence of the isolated strain multiplying in the respiratory tract of mice is obvious, and the mice lose weight quickly, all die within a week and are accompanied by severe systemic infection. Based on changes in the amino acid residues of the A/swine/Guangxi/6/2013 (No.6) strain, it is thought that the NA protein E119G mutation is the main site where highly dangerous changes happen. D N mutations in the PB2 strains G2, g14, g21, g30, S2, 32, 7, and 8 show that these strains are gradually adapting to human sources. According to the traits of strains 30, G2, G14, and G21, NP develops 375 , which boosts pathogenicity. In summary, the ER-H1N1 subtype influenza virus is widespread in the Guangxi swine herd, and it is pathogenic to mice, with the trend of genomes derived from Pdm/09 H1N1 fragments increasing.

目的 利用定点突变技术突变Pdm/09 H1N1流感病毒的NA基因119位点并拯救,研究其生物特性.方法 利用重叠PCR的方法进行定点突变,再应用反向遗传学体系中的pBD-NA质粒后在293T细胞中转染拯救流感病毒,通过血凝试验和RT-PCR方法鉴定病毒拯救结果,通过细胞学和攻毒试验研究该位点变异的生物学意义.结果 定点突变测序结果显示,突变的pBD-NA质粒核苷酸第336位由A突变为G,使氨基酸位点发生E(核苷酸:GAA)到G(核苷酸:GGA)的变化,而其他位置的氨基酸均未发生改变.拯救的病毒转染后的细胞悬液接种MDCK细胞连续传代3代后突变毒株(rMT)血凝效价为27,亲本毒株(rWT)为26.神经氨酸酶的二级结构预测结果显示,rMT与rWT相比,Alpha Helix分值明显下降,均值同比下降约为10.62％,经突变后的rMT Alpha Helix结构分值表现为下降趋势.用rWT和rMT病毒攻毒BABL/c小鼠后第3天的小鼠肺组织、鼻甲骨、脾和肾的病毒滴度,rMT攻毒组均比rWT攻毒组高,鼻甲组织与肺脏中的病毒滴度相比差异不显著,脾和肾的差异显著.结论 NA119位点的定点突变对病毒的复制能力没有明显影响,突变株对BABL/c小鼠的致病力有一定增强,临床症状明显,神经氨酸酶活性下降.

为了解广西地区口蹄疫(FMD)、猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪伪狂犬病(PR)、布鲁氏菌病和小反刍兽疫(PPR)等重大动物疫病的免疫动态、疫情流行风险,按照国家动物疫病定点监测实施方案相关要求,2016—2018年运用ELISA和实时荧光定量PCR方法,对玉林市和百色市20个定点监测场点的猪、牛、羊开展病原学监测和抗体监测.病原监测结果显示:2016—2018年,未在牛羊群中检出FMD、PPR病原;2016年和2017年CSF病原检出率均为0.38％;3年内均有PRRS病原检出,检出率介于1.89％～6.32％.抗体检测结果显示:2016—2018年,猪O型FMD、CSF、PRRS和PR-gB抗体阳性率均在70％以上,A型FMD抗体阳性率逐年上升,NSP抗体和PR-gE抗体阳性率呈波动状变化;牛O型FMD抗体阳性率分别为94.78％、18.26％、71.11％,亚洲I型分别为76.52％、25.22％、27.78％,NSP抗体阳性率在22.61％～41.74％之间波动;仅2016年检出1份牛布鲁氏菌抗体阳性;3年间,羊O型、亚洲I型FMD和PPR免疫抗体阳性率都很低,未达到70％,且呈下降趋势,NSP抗体阳性率在0.95％～7.62％之间波动,未检出羊布鲁氏菌抗体.结果表明,广西玉林市和百色市的猪群O型FMD、CSF、PRRS、PR免疫效果较好,但牛羊群FMD和PPR免疫效果较差,猪群中仍有CSF、PRRS、PR等疫病流行,牛羊群中存在FMD流行的风险,但牛羊布鲁氏菌病得到有效控制.结果提示,应继续加强上述疫病的免疫和监测,针对免疫效果较差、病原流行率偏高的疫病,要重点做好防控和净化.

目的 对广西犬只尤其是宠物犬中携带H9N2亚型流感病毒进行全基因组序列特征分析以及小鼠的致病性研究,为流感病毒疫情的防控提供科学依据.方法 采用RT-PCR的方法扩增、测序全基因组,DNAStar和MEGA6.0软件分析氨基酸同源性和进化树,通过小鼠感染实验探究其致病性.结果 13株H9N2毒株8个基因节段来源于5个不同谱系的毒株,属于新基因型,氨基酸同源性与广西分离株A/equine/Guangxi/3/2011≥99.0％,6个内部基因与2013年自人流感病毒分离株H7N9亲缘关系密切.毒株HA的裂解位点均为RSSR↓ GLF,表明低致病力.氨基酸位点HA226、NA119、NP375和PB2的701位等有变化,其中HA226位为亮氨酸L,具有与人SAα2,6-Gal结合的特性.BALB/c小鼠感染健康犬只中分离的H9N2病毒未在体内复制,而源自感冒犬只的毒株Ca/GX/8和Ca/GX/10能够在体内复制,临床症状明显但不致死.病毒经小鼠体内传代后致病力增强,推测是PB2的611位和PA623位氨基酸改变导致.结论 从广西各地犬只中获得的13株H9N2亚型流感病毒株经分析发现虽源于禽源,但具备和人源受体特异性结合的能力,且内部基因遗传进化关系复杂,对哺乳动物及人类存在较大威胁,亟需加强防控.

目的 对一株分离自广西兴安的猪源A(2009/H1N1)流感病毒进行遗传演化分析及致病性研究,为流感疫情防控提供科学依据.方法 通过SPF鸡胚进行流感病毒分离,对8个基因进行RT-PCR扩增、测序及进化分析;以6周龄雌性BALB/c小鼠为感染模型进行病毒滴定,分析临床数据评估病毒致病性.结果 分离的甲型H1N1病毒株A/swine/Guangxi/18/2013(H1N1) HA、NS和NP基因属于古典型H1N1,NA和M基因源于类禽型H1N1,PA和PB2基因归属禽源,PB1基因来自人源H3N2.HA裂解位点序列为PSIQSR↓ GLF,具有低致病性特征.以50μl 106 TCID50感染小鼠后其体重发生明显变化,最高体重平均变化率为86.98％,死亡率为12.5％;感染第3d测定肺、鼻甲病毒滴度(Log10 TCID50/ml)分别为5.25±0.28和3.89±0.47.结论 A/swine/Guangxi/18/2013(H1N1)为2009/H1N1流感病毒,能感染小鼠而造成体重下降并产生明显的临床症状.该病毒能在小鼠肺与鼻甲中进行复制,具有低致病性特征.

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD 19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析.结果 显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×101～6.26×108 copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×101 copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0％;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6％.结果 表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础.

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验.结果 显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×109～7.58×102 copies/μL范围内呈良好线性关系,R2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性.临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高.结果 表明,建立的痘苗病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段.

根据GenBank上已发表的PCV3毒株序列设计1对检测引物和2对扩增全长引物.应用检测引物对广西地区的犬血清样品进行PCR检测,应用扩增全长引物对检测阳性样品进行PCR扩增、克隆和测序,并对其全基因序列进行分析,绘制遗传进化树.结果 显示,广西地区147份犬血清样品中,阳性样品为36份,感染率为24.3％.本试验成功扩增1株2 000 bp的PCV3毒株的全基因核苷酸序列,并命名为PCV3/Guangxi-5.将PCV3/Guangxi-5序列与NCBI公布的PCV3的参考序列进行同源性比对,结果显示PCV3/Guangxi-5与参考序列的全基因序列同源性为98.9％～100.0％,其中与DE27.16同源性最低,与PCV3/CN/Chongqing-148/2016同源性最高.应用MEGA7.0对PCV3进行ORF2基因的氨基酸序列进行比对发现,第24位至第27位氨基酸存在6种形式,分别为VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK.利用MEGA7.0软件中Maximum Likelihood (ML)法p-distance模式构建基于ORF2基因和PCV3全基因的系统发育分析表明,PCV3可分为PCV3a和PCV3b等2种基因型,本试验获得的PCV3/Guangxi-5为PCV3a亚型,其ORF2基因与PCV3/CN/Liaoning-23/2016亲缘关系最近,与NWHEB21、毒株亲缘关系相距最远;其全基因组与CN/Jiangxi-62/2016毒株亲缘关系最近,与CNFJ-1毒株亲缘性最远.结果 表明,广西地区犬群普遍存在感染PCV3的情况,理论上丰富了广西地区PCV3的流行病学资料,为PCV3的防治措施的制定和流行病学研究提供一定的参考依据.

[目的]明确广西猪源H9N2亚型流感病毒的遗传特征及分子生物学特性(抗原性、耐药性和致病性),为广西猪源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据.[方法]以分离自广西百色地区的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)为研究对象,运用RT-PCR扩增其全基因组的8个基因片段(HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因),经克隆测序后进行核苷酸序列及氨基酸位点分析.[结果]2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列开放阅读框(ORF)分别是PB2:2280 bp、PB1:2274 bp、PA:2151 bp、HA:1683 bp、NP:1497 bp、NA:1410 bp、M:982 bp和NS:838 bp.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组仅M基因核苷酸序列与猪源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均与禽源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,在基因型分类上属于G57基因型,为我国广泛流行的H9N2亚型基因型.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的HA蛋白发生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突变,NA蛋白抗原决定簇S331V、W403S和Q431K也发生突变;NA蛋白在N2亚型的耐药性关键位点119E、151D、292R、276E和294N位点未发生突变,但在NA蛋白抗原区存在S331V、K367E和Q432K突变,且M2氨基酸位点发生S31N突变.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒HA蛋白连接HA1和HA2的氨基酸均为RSSR↓GLF;HA蛋白存在1个因P315S突变而新增的潜在糖基化位点(NCS);NA蛋白未缺失NA潜在糖基化位点,也未出现NA蛋白颈部杆状结构63～65 aa缺失现象,在NA潜在糖基化位点中69、86、146、200和234 aa处非常保守,但发生W402S突变.[结论]从广西百色分离获得的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)虽为低致病力毒株,但在流感病毒基因重组过程中发挥重要作用,且其致病性有增强趋势,已对金刚烷胺类药物产生耐药性.因此,应加强广西地区哺乳动物H9N2亚型流感病毒的监控,并警惕其跨种间传播.

为了解广西地区规模种猪场接种口蹄疫O型和猪瘟疫苗的免疫情况以及更好地指导规模种猪场的生产实践工作,广西壮族自治区动物疫病预防控制中心在2016～2018年期间运用ELISA抗体检测试剂盒检测方法,对4200份广西地区各规模种猪场送检的免疫猪只血清样品进行口蹄疫O型和猪瘟免疫抗体水平检测.结果显示:广西规模场口蹄疫O型免疫抗体合格率分别为84.07％,86.00％,92.37％;猪瘟免疫抗体合格率分别为97.36％,99.08％,95.38％,免疫抗体平均合格率均达到农业农村部对猪群的群体抗体免疫效价70％以上的要求.广西规模猪场口蹄疫O型免疫抗体水平在2016～2018年呈持续上升趋势,这说明通过抗体水平持续跟踪监测、不断优化免疫程序、调整疫苗种类,广西规模猪场的口蹄疫得到了良好的控制.而广西规模猪场猪瘟免疫抗体合格率在2017年后有明显下降,这可能与2017年猪瘟退出强制免疫接种有关,但在各年份免疫抗体平均合格率均保持在95％以上,说明广西规模种猪场对猪群的猪瘟免疫管控到位.

[目的]了解广西H9 N2亚型猪源流感病毒的分子流行病学特征并揭示其遗传变化规律,为有效防控猪流感提供参考依据.[方法]运用PCR方法扩增广西2株H9N2亚型猪源流感病毒(A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011)的HA基因,并进行克隆测序及序列比对分析,绘制遗传进化树.[结果]2株H9N2亚型猪流感分离株的HA基因全长1701 bp,开放阅读框(ORF)全长1683 bp,编码560个氨基酸;与参考毒株核苷酸的同源性在83.7％～98.3％,推导氨基酸同源性在86.6％～98.2％.遗传进化树分析结果显示,2株分离株与A/Duck/HongKong/Y280/97病毒同属欧亚谱系的Y280亚系,其HA基因的裂解位点序列均为RSSR↓GLF,具有低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HA1区,2个位于HA2区;HA受体结合位点均具有人流感病毒和猪流感病毒特征.[结论]分离获得的广西2株H9N2亚型猪源流感病毒A/Swine/Guangxi/P2/2011和A/Swine/Guangxi/P3/2011,其HA基因属于欧亚普系的Y280亚系,均具备典型的低致病性和与人流感受体结合特征.

1 猪流感及其防控意义 猪流感(swine influenza,SI)呈世界性分布,各地均有流行,发病率高[1]. 猪流感能直接引起患病猪的死亡,并使患病猪的生长或生产不良,对养猪业的危害极大,研究表明康复猪和隐形感染猪是以后猪流感的传染源,猪流感作为一种主要的免疫抑制疾病,在猪场中普遍存在且难以根除[1,2].

[目的]了解广西贵港地区猪繁殖与呼吸障碍综合征的感染情况,为广西贵港地区猪繁殖与呼吸障碍综合征的监督及防控工作提供参考.[方法]通过对Nsp2基因的分析,合成新的特异性诊断引物,并利用RT-PCR的方法对广西贵港地区111个规模猪场采集的1865份扁桃体同时进行高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征和经典猪繁殖与呼吸障碍综合征的分子流行病学调查.[结果]25个猪场检出92份猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒,场点总阳性率为22.5％,样品总阳性率为4.93％.其中9个猪场检测出24份高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒,场点阳性率为8.10％,样品阳性率为1.29％;18个猪场检测出68份经典猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒,场点阳性率为16.2％,样品阳性率为3.65％;2个猪场同时检测出高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和经典猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒.[结论]广西贵港地区规模猪场感染猪繁殖与呼吸障碍综合征的现象较为严重.