本研究旨在对人激肽释放酶7(KLK7)基因进行原核与真核表达,研究其功能,并为后续KLK7新型生物抑制剂的研制提供基础材料.采用PCR扩增KLK7基因,将其克隆至原核表达载体pGEX4T-1和真核表达载体pEGFP-C1,构建重组表达质粒pGEX4T-1-KLK7和pEGFP-C1-KLK7,分别转化Transetta(DE3)和DH5α感受态细胞,筛选阳性菌株,用IPTG诱导重组KLK7蛋白(rKLK7)表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况.将pEGFP-C1-KLK7转染人角质形成细胞HaCaT,观察KLK7在细胞中的定位,检测KLK7基因过表达对角质化细胞增殖的影响.KLK7基因开放阅读框为762 bp,编码254个aa.原核系统表达的rKLK7分子量为53.5 kDa.EGFP-KLK7融合蛋白定位在细胞质.KLK7的过表达对HaCaT细胞的增殖有一定的抑制作用,但差异不显著(P>0.05).DNA检测表明,KLK7过表达可促进HaCaT细胞的凋亡.KLK7在原核表达系统和真核细胞中均成功表达,KLK7蛋白过表达对HaCaT细胞的增殖有一定的抑制作用,而对细胞凋亡有一定的促进作用.

三环己基氢氧化锡与4-吡啶甲酸按物质的量比1:1在乙醇溶剂中反应,合成了水合三环己基锡4-吡啶甲酸酯配合物.采用元素分析、红外光谱、核磁共振、差热分析和X-射线单晶衍射等对配合物进行了结构表征,并对配合物进行量子化学计算和体外抗癌活性研究.结果表明:配合物中心锡原子为五配位畸变三角双锥构型;配合物对人肝癌细胞(HUH7)、人肺腺癌细胞(A549)、人表皮癌细胞(A431)和人结肠癌细胞(HCT-116)的抑制活性高于顺铂.

为了探讨KLK7小分子抑制剂G284-1264对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭和转移的影响,采用MTT法检测G284-1264处理后细胞的存活率;钙黄绿素-AM/PI活细胞/死细胞双染和流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布,同时用细胞划痕实验检测G284-1264对SKOV3细胞侵袭与转移的影响.结果显示:相同时间作用下,随着G284-1264浓度增大,SKOV3细胞存活率逐渐降低,24 h、48 h和72 h的IC50分别为110.0、48.62和39.64μmol/L,相比5-FU,G284-1264对SKOV3细胞表现出更强的抗增殖能力;钙黄绿素-AM/PI对细胞进行双染后,G284-1264作用组细胞活力明显降低;流式细胞术分析发现,G284-1264作用组G1期的细胞数目增加,G2期明显降低,且凋亡率高于空白组和阳性对照组;划痕实验表明G284-1264处理细胞36 h后,细胞迁移率降低16.49％.以上结果表明KLK7小分子抑制剂G284-1264能明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖、侵袭与转移.

以红心火龙果果皮、果肉为材料,采用超声辅助法探讨果皮及果肉中原花青素的最优提取条件,结果表明:果皮与果肉中原花青素的最佳提取组合是乙醇体积分数分别为70％和50％,料液比1:40,超声时间40 min,温度40℃.在最优条件下,果皮与果肉中原花青素的提取含量分别为(1.42±0.04)mg/gDF和(1.00±0.02)mg/gDF.利用氧化自由基吸收能力法(ORAC法)对果皮和果肉中原花青素粗提物进行抗氧化性分析得知,果皮中原花青素粗提物的ORAC值为(60.62±4.48)μmol TE/g,果肉的ORAC值为(40.63±2.64)μmol TE/g,果皮的抗氧化性能比果肉要强,是果肉的1.49倍.

对一例疑似伪狂犬病毒(PRV)感染病例进行实验室检测和病原的分离培养.采集病猪的脏器,进行PRVgE基因的PCR检测,病料接种非洲绿猴肾细胞(Vero)并传代培养,观察细胞病变效应(CPE),PCR监测第3代、第5代和第7代培养物PRV的gE和gG基因核酸,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒在Vero细胞中的增殖动态.结果表明,病猪心脏、肺脏和脾脏为PRVgE基因核酸阳性,Vero细胞在接种病毒48 h,变圆、融合;第3代、第5代和第7代培养物中gE和gG基因核酸均为阳性,第7代培养物与PRV阳性血清呈特异性反应,病毒感染后第6 h、Vero细胞中即可检测PRV抗原,第24 h绝大部分细胞呈PRV抗原阳性.该病例为PRV野毒株感染,所分离的PRV毒株对Vero细胞适应力强.

本研究旨在对临床1份腹泻病料进行病原的分离培养并探究该病原编码的主要抗原蛋白的生物学特点.采用巢式PCR检测病料猪腺病毒3型(Porcine adenovirus type 3,PADV3)核酸并进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPM A)进行病毒血清学鉴定,PCR扩增fiber基因,将其ORF区克隆至pET-28a(+)载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组fiber蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体并测定抗体免疫活性.结果表明,病料为PADV3核酸阳性,感染ST细胞产生典型的"葡萄串"细胞病变效应(CPE),P5?P11代次中的PADV3核酸稳定,分离的毒株P5代为PADV3型血清学阳性,fiber基因开放阅读框(ORF)为1 296 bp(GenBank登录号:MT774498),与PADV3毒株的核苷酸相似性最高(86.1％),与其他毒株相似性均低于40％;原核表达的重组fiber蛋白分子质量为45.2 ku,fiber蛋白多克隆抗体与PADV3感染的细胞呈特异性的细胞核染色.本试验成功分离得到1株PADV3毒株,命名为PADV3-HY1812,所制备的fiber蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性.

研究旨在克隆猪流行性腹泻病毒(PEDV)HuN-HY1902毒株N、sM、ORF3基因并进行序列分析,为PEDV的临床防控提供依据.采用Vero细胞进行病毒分离培养,免疫过氧化酶单层细胞染色法进行病毒鉴定;RT-PCR扩增PEDVHuN1902毒株N、S、sM、ORF3基因,经纯化后进行序列测定,利用DNAStar、Mega等生物信息学软件进行序列分析.RT-PCR扩增得到PEDV ORF3、N、sM片段大小依次为744bp、1400bp、和1100 bp.该毒株ORF3基因核苷酸序列与PEDV/USA/Missouri130/2015毒株相似性最高,为99.7％;sM基因核苷酸序列与CH/SCMY/2018和BJ-2011-1相似性最高毒株,为96.3％;N基因核苷酸序列与CH/SCMY/2018毒株相似性最高,为98.6％;ORF3、N和sM基因核苷酸序列与疫苗毒株CV777依次为96％、95.1％和93.9％.进化分析显示,该毒株的ORF3、sM和N基因的核苷酸序列与2018年流行毒株CH/SCMY/2018处于同一分支,而与经典毒株CV777、SM98的亲缘关系较远.所分离培养的毒株命名为PEDV HuN-HY 1902毒株,为新流行的变异毒株.

本研究旨在探究不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白免疫原性的影响.IPGT诱导重组表达菌株Rosetta(DE3)-pET28a-TGEV-S2/3和BL21 (DE3)-pET28a-PEDV-S 1/2/3,制备重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,将重组蛋白等量混匀分别与3种佐剂ISA 71VG、ISA 201VG和ISA 15AVG进行乳化制备免疫原免疫蛋鸡;Western blot检测蛋鸡血清抗体效价,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体与病原的反应活性;监测鸡群平均日增重.结果 显示,重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3的分子量依次为25 ku、28 ku、26 ku、24 ku和21ku.Western blot分析显示,5种蛋白均具有良好的免疫原性;疫苗二次免疫后7天抗体效价达到高峰,ISA 201VG佐剂组、ISA 71VG佐剂和ISA 15AVG佐剂组组最高抗体效价依次为64000倍、32000倍和8000倍,对照组未检测到特异性抗体;ISA 71VG和ISA 201VG组对产蛋率下降相对较大,ISA15AVG佐剂疫苗免疫组对产蛋率影响相对较小,免疫后7天后试验组产蛋率恢复正常.ISA71VG佐剂组蛋鸡平均日增重显著降低,ISA 201VG和ISA 15AVG佐剂组蛋鸡平均日增重与对照组无显著差异;ISA 201VG佐剂组血清抗体与病毒反应活性良好,中和效价可达1:256.ISA 201VG佐剂配伍的疫苗免疫效果优于其他两种佐剂疫苗.

[目的]探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据.[方法]采用RT-PCR扩增pCyclin和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株.设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA) CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率.流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响.将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度.[结果]pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1 299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2.荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达.构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P＜0.01).pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P＜0.01或P＜0.05).pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P＜0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P＜0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P＜0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P＜0.05).PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P＜0.01).低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P＜0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P＞0.05).[结论]pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例.

近年来,慕课浪潮席卷全球,国内各顶尖大学纷纷加入慕课建设的大浪潮.那么,各高校在这场大浪潮中表现得怎么样呢?文章将以湖南省三十二所普通本科院校为例,从慕课建设与慕课应用两个立足点出发,广泛收集数据,多视角、多维度地对这些数据进行全面解读.

Objective To investigate the knowledge for hepatitis C and willingness to receive antiviral therapy among hepatitis C virus (HCV) infected individuals in Hunan province of China. Methods A total of 430 HCV infected individuals from 14 cities in Hunan province were recruited for a questionnaire survey from January 2017 to March 2018.Demographic characteristics, behavioral characteristics, HCV knowledge, willingness to receive direct-acting antivirals (DAAs) and payment were included in the investigation. Results Of all individuals, the proportion of willingness to participate in treatment was 96.98％ (417/430).The reasons for untimely treatment were economic burden (260/430, 60.46％), low awareness of HCV infection (30/430, 6.98％), no time (40/430, 9.30％), and lack of family support (0.93％).Only 19.3％ (83/430) knew about HCV; 98.60％ (424/430) wished the insurance to pay for their treatment.There were not statistically difference in age, gender, occupation, ethnicity, marital status, personal economic income, family economic income, and knowledge awareness for direct-acting antiviral therapies.Significant differences were seen by educational levels (χ2=0.02, P<0.05) and economic burden (χ2=0.02, P<0.05). Conclusions Overall, the HCV knowledge is poor among HCV infected individuals, but the willingness to receive anti-HCV therapies is strong.

以全校任意选修课的形式开展公共艺术教育是目前各地方本科院校落实教育部《全国普通高等学校公共艺术课程指导方案》文件精神的普遍做法.在课程实施的过程中,我们发现公共艺术课程开课能力有限与学生难以预测的选课需求始终是一对比较激烈的矛盾.课题组以湖南省某普通本科学校为例,在尊重该校选课规则的前提下,仔细分析了艺术课程整体选课需求、单门艺术课程选课需求及在适当引入网络课程的情况下选课需求的变化规律,通过科学、有效的数学分析方法,准确估算出艺术课程的选课需求数据,从而指导学校更加科学、有序地规划艺术课程建设,提高艺术教育教学质量.

为给Ⅰ型犬腺病毒(CAV-Ⅰ)后续研究提供基础材料,采集疑似犬传染性肝炎患犬粪便,用PCR方法进行CAV-Ⅰ核酸检测,并运用犬肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离培养,采用PCR和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒在细胞内的繁殖状态.结果显示:患犬粪便样品PCR检测为CAV-Ⅰ核酸阳性,病料接种MDCK细胞培养24h后出现明显的“葡萄串样”细胞病变效应(CPE);培养物血清学鉴定为CAV抗原阳性,不同代次病毒培养物均为CAV-Ⅰ核酸强阳性;第9代病毒核酸序列与GenBank中CAV-Ⅰ毒株核苷酸相似性在99.0％以上,与CAV-Ⅱ相似性仅为65.3％;该病毒与CAV-Ⅰ毒株处于同一遗传分支1;病毒接种MDCK后8h内均无抗原检出,12h后细胞核中分布大量的CAV抗原,24h后细胞出现典型的“葡萄串样”病变,抗原在细胞中呈弥散分布.上述结果表明,分离到的毒株为CAV-Ⅰ,命名为CAV-ZY 180711.

试验旨在研究猪腺病毒3型(PADV3) Protease蛋白在大肠杆菌中的表达,并制备该蛋白的多克隆抗体.利用PCR扩增PADV3 Protease基因,构建重组原核表达载体pET28a-PADV3-Protease和真核表达载体pEGFP-PADV3-Protease,采用双酶切和测序鉴定;将原核表达载体pET28a-PADV3-Protease转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组原核表达菌株,经IPTG诱导收集蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定,将目的蛋白纯化后与佐剂乳化制备免疫原免疫家兔,制备Protease蛋白多克隆抗体;将真核表达载体pEGFP-PADV3-Protease转染HEK293细胞经G418筛选建立稳定表达EGFP-Protease融合蛋白的细胞系,以该稳定表达细胞系为包被抗原,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性与抗体滴度.结果 显示,Protease基因开放阅读框(ORF)为615 bp,原核表达系统中Protease蛋白以包涵体形式存在,分子质量大小为23 ku,与真核细胞表达的Protease蛋白分子质量一致,该蛋白在细胞核与细胞质中均有分布,制备的Protease蛋白多克隆抗体能与EGFP-Protease融合蛋白稳定表达真核细胞系发生特异性的反应,与对照细胞无反应.本试验构建了Protease蛋白原核表达菌株和真核表达细胞株,制备的PADV3-Protease蛋白多克隆抗体免疫活性良好,为进一步研究Protease蛋白的生物学功能和PADV3的血清学诊断提供了基础材料.

目的 了解湖南省美沙酮门诊就诊者感染丙型肝炎病毒(HCV)基因型特征. 方法收集湖南省内14个市州18岁以上、未接受抗病毒治疗、既往HCV抗体阳性的美沙酮门诊患者的血浆样本,每市州样本15份,共210份.对收集到的血浆样本分别进行HCV抗体EHSA复检、荧光PCR法定量HCV-RNA检测和基因分型检测. 结果在210名调查对象中,ELISA法复检HCV抗体阳性标本202例,阳性率96.19％;荧光PCR法检出HCV-RNA病毒载量＞15 IU/ml标本181例,阳性率86.19％.HCV基因型分别为1型18例(9.94％),2/3型51例(28.18％),1型混合2/3型47例(25.97％),其他型别65例(35.91％).区域分布以非1型为主,2/3型普遍分布. 结论 湖南省HCV基因型比较复杂,有待深入研究.

为克隆并分析湖南衡阳分离的犬瘟热病毒(CDV)HuN-HY171124毒株H基因,采用逆转录反应合成第一链cDNA,利用巢式PCR扩增H基因全长,将PCR产物纯化克隆至T载体中构建重组载体pMD19-T-CDV-HuN-HY171124-H,经序列测定,利用DNAStar和Mega等生物信息学软件进行序列分析.结果 显示,CDV HuN-HY171124毒株H基因开放阅读框(ORF)为1824 bp,编码607aa.相似性比对结果显示,该毒株与GenBank中58株分离毒株的核苷酸相似性在90.4％～98.8％之间,与弱毒疫苗毒株核苷酸的相似性均在90％左右,与我国分离的强毒株核苷酸的相似性均在98％左右.CDV HuN-HY171124毒株H蛋白第519氨基酸氨基酸为精氨酸、第549氨基酸氨基酸为酪氨酸,均为犬源CDV H蛋白特征性氨基酸.遗传进化分析发现该毒株与我国分离的大部分毒株均属于与我国分离的大部分毒株属于Asia 1型,与现有疫苗毒株不处同一个分支.CDV HuN-HY171124毒株是一株犬源CDV,其基因型属于Asia-1型,本研究扩充了CDV区域性流行病学基础数据.

以巨峰葡萄为实验材料,采用0.5 mg/mL芒果皮提取液与1％羧甲基壳聚糖复合涂膜处理葡萄果实,从腐烂率、失重率、相对硬度、呼吸强度、可滴定酸含量、可溶性固形物含量、Vc含量等方面对葡萄的保鲜效果进行评价,探讨芒果皮提取液复合涂膜对巨峰葡萄保鲜效果的影响.结果表明:与未涂膜与单一涂膜组相比,复合涂膜能显著降低葡萄在贮藏过程中的腐败率和失重率,减缓葡萄相对硬度下降的速度;并且显著抑制贮藏前期葡萄的呼吸强度,进而抑制贮藏过程中可溶性固形物、可滴定酸和Vc含量的降低.由此可知,芒果皮提取液与羧甲基壳聚糖复合涂膜可用于巨峰葡萄保鲜.

为确诊衡阳市某猪场育肥猪发生的疑似猪伪狂犬病(PR)疫情,采集发病猪脾脏,运用PCR方法进行猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸检测,利用非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)进行病毒血清学鉴定;用分离培养物进行家兔感染试验,观察临床症状和病例剖检变化,采用PCR检测各器官中的病毒分布情况.结果显示:病料接种Vero细胞培养3 d后,出现明显的细胞病变效应(CPE);分离培养的病毒与PRV阳性血清呈阳性反应;家兔感染后出现奇痒等神经症状并死亡,其肝、脾组织均为PRV gE核酸检测阳性.试验结果证实,分离到的病毒为PRV野毒,从而确诊了该疑似疫情.

[Objective] This study prepared polyclonal antibody of S1 protein of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) CH-HeB14 strain to provide basis for the development of diagnostic kit and vaccine.[Method] The S1 gene of PEDV CH-HeB14 strain was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR),analyzed by bioinformatics software,truncated into different segments (S1A,S1B,S1C,S1C-1 and S1C-2) by PCR,sub-cloned into prokaryotic expression vector pET28a and transformed into BL21(DE3) to obtain the expression recombinants.IPTG was used to induce the expression of recombinant protein before being analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting.The expressed proteins were purified and emulsified with immune adjuvant,and the immunogen was inoculated into rabbits to prepare polyclonal antibodies (pAb) against PEDV S1 protein.The immune competence of the pAb was evaluated by immune peroxidase monolayer assay (IPMA) and Western blotting.[Result] The molecular weights of S1,S1A,S1B,S1C,S1C-1 and S1C-2 were 2 079,600,600,878,549 and 447 bp,respectively.Phylogenetic tree showed that PEDV CH-HeB14 strain S1.gene had close relationship with the 22 novel prevailing strains since 2010,while they differed genetically from the vaccine strains (CV777 and attenuated DR13).The truncated proteins (rS1A,rS1B and rS1C-1) were successfully expressed in form of inclusion body (IB).The pAb against these three truncated proteins (rS1A,rS1B and rS1C-1) showed good activity and the Western blotting titer of anti-recombinant rS1A protein pAb was 1 ∶ 32 000.IPMA results revealed that the pAb showed specific activity when reacting with the attenuated DR13 strain or CH-HeB14 strain viruses infected cells.[Conclusion] PEDV CH-HeB14 strain S1 gene was successfully cloned and expressed,and the prepared anti-S1 pAb showed good immuneactivity.

运用实验室分子诊断技术对湖南岳阳某猪场一例疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染病例进行确诊,测定并分析其基因序列,为猪蓝耳病的防控提供依据.采集病猪淋巴组织提取RNA,采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测病毒核酸,构建重组栽体,经序列测定,利用DNAStar等生物信息学软件进行序列分析.结果显示,RT-PCR产物大小为657 bp,同源性比较结果显示,此毒株ORF5基因核苷酸序列与与经典美洲型毒株VR-2332的同源性为83.4％,与我国经典毒株CH-1a株的同源性为85.4％,与高致病性代表株HUN4和JXA1的同源性分别为84.5％和84.3％,与欧洲经典型毒株LV的同源性为62.8％,与GDZS2016和GD/YJ/2014的同源性分别为95.0％和95.9％.遗传进化分析表明,此毒株属美洲型毒株;美洲型毒株下分两个亚群,以近年来新流行的GDZS2016和GD/YJ/2014毒株为代表的Ⅰ亚群和以HuN4、JXA1和VR-2332等为代表的Ⅱ亚群,此毒株与GDZS2016和GD/YJ/2014等同属Ⅰ亚群.结果表明,此次病例是由美洲型PRRSV毒株感染引起,将此毒株命名为HuNYY201805.