FecB(Fecundity Booroola)是羊繁殖性状的主效基因,该文旨在探讨贵州毕节地区 6 个绵羊品种FecB 基因微卫星座位多态性及与湖羊和威宁绵羊杂交品系繁殖性状的相关性.首先采集 6 个品种绵羊血浆,提取基因组DNA,选择位于FecB 基因中的 6 个微卫星座位,设计引物,运用聚合酶链式反应扩增微卫星基因序列,以聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染技术施以微卫星分型.比较各组之间FecB 微卫星基因型与等位基因分布,并进行多态性分析.结果显示:6 对微卫星引物均能在 6 个羊群组中稳定扩增.微卫星座位LSCV043,BMS2508,300U,GC101,Bulge5和471U均能检测到 3～6 个等位基因.其中等位基因 114 bp 在微卫星座位 LSCV043 中频率最高;等位基因162 bp在微卫星BMS2508 中频率最高;等位基因 164 bp 在微卫星座位 300U中频率最高;等位基因 200 bp 在微卫星座位GC101 中频率;等位基因 136 bp 在微卫星座位 Bulge5 中频率最高;等位基因 200 bp 在微卫星座位471U中频率最高.多态信息含量(PIC)结果显示:300U,GC101 两个微卫星座位在各组羊群中均属于高度多态水平(PIC＞0.5),而471U座位在各组羊群中均为中度和低度多态基因座.微卫星座位 300U 在湖羊与威宁绵羊杂交品系中等位基因数为 5 个,其中基因型 148/160 bp 对应的最小二乘平均值最高,达到了 1.81 只;微卫星座位GC101 基因型 200/238 bp对应的最小二乘平均值最高,达到了 1.74 只,可用于高繁绵羊的初步辅助选择.

为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法.结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R2=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×101copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17％.说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测.

The full length of PstS gene was firstly amplified by SOE-PCR and cloned into expression vector pColdⅠ. Then the vector pCold-PstS was transformed into BL21（DE3） to express the fusion protein PstS by IPTG induction, based on which polyclonal rabbit anti-serum was generated by immunizing New Zealand rabbit with the purified PstS protein. The total protein, membrane protein and cytoplasmic protein of M.gallisepticum were extracted to analyze the distribution of PstS by Western blot with the rabbit anti-serum. The PstS gene was 1 065 bp in length, and its encoded protein had a transmembrane region between amino acid 9 and 31. The recombinant protein PstS obtained by the induced expression of pCold-PstS was about 43 ku in size and had good antigenicity. The PstS existed on the membrane and in the cytoplasm of M.gallisepticum. To summarize, PstS was an immunogenic protein on the membrane of M.gallisepticum, which provided theoretical support for further research on its biological function and genetic engineering vaccine.

《兽医病理学》是动物医学专业的专业基础课,也是基础兽医学与临床兽医学之间的桥梁学科.实验教学是《兽医病理学》教学的重要内容,是培养学生专业素养、动手能力和创新性思维的重要途径.通过实验教学内容及环节的改革有效提高了学生的动手能力和对兽医病理学理论知识的理解.该文针对《兽医病理学》实验教学中存在的问题,进行了实验性改革和分析.

探究黄芩苷对H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏致病损伤的作用.选用40只昆明小鼠随机分为4组,即对照组、模型组、黄芩苷治疗组、3-MA抑制剂组.通过HE染色观察肺组织病理形态学变化,ELISA法检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-a的含量,透射电镜检测小鼠肺脏中 自噬体的水平,Western blot检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG7蛋白表达水平,免疫荧光法检测肺组织LC3蛋白表达水平,免疫组化法检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG5蛋白表达水平,RT-qPCR检测肺组织自噬关键基因LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平.结果显示,经黄芩苷治疗后能显著缓解H6N6亚型禽流感病毒对小鼠肺组织的损伤,血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-a含量显著下降(P＜0.01),肺组织中 自噬体数量减少,LC3、Beclin-1、ATG5及ATG7蛋白表达水平显著下降(P＜0.01),肺组织中LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平显著下降(P＜0.01).结果表明,黄芩苷能减轻H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏炎症损伤,同时下调自噬关键因子及自噬体的水平,提示其抗小鼠肺损伤机制可能与调控细胞自噬有关.

为查明贵州省惠水县某养殖场鸡发病死亡的原因,对送检鸡进行剖检和病理学观察,并应用qRT-PCR方法对病原核酸进行检测.结果:病(死)鸡肝脏肿大,有明显粟粒状细胞瘤增生,均匀分布于肝实质中,呈灰白色;组织病理切片观察发现大量圆形嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞和广泛的肝细胞空泡变性;病原核酸检测显示禽白血病病毒阳性,确诊为禽白血病病毒感染.

兽医病理学是动物医学专业的基础学科和临诊学科结合点上的一门桥梁学科.课堂教学是课程思政教育的重要渠道,专业课程是课程思政建设的基本和重要的载体.教改结合本学科的特点和地区人才培养需求,通过加强学生临床生产实践、常见病的病理诊断,改革传统教学模式,并结合适宜的切入点引入课程思政教学等多个维度,对兽医病理学课程建设和教学改革进行探索和实践,便于学生掌握动物疾病病理变化、认识疾病发生发展及规律.

CRISPR/Cas9是一个新兴的基因编辑技术,利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中的irp2基因进行编辑,为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础.首先构建靶向irp2基因的sgRNA,PCR扩增上、下游同源臂,利用重叠PCR技术连接sgRNA与上、下游同源臂,再通过酶切与酶连构建出靶向irp2基因的pTargetF重组质粒.将pCas与pTargetF重组质粒转化临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中,成功构建了该菌株的irp2基因缺失菌株,为进一步研究其致病机制奠定基础.

为探讨撒坝猪源大肠埃希氏菌(E.coli)的耶尔森强毒力岛(HPI)对泛素蛋白酶体(UPS)介导的TLR4/NF-κB信号通路关键因子的影响,将猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)分为5组,空白对照组、HPI阳性株感染组、HPI阴性株感染组、HPI阳性株+MG-132组、HPI阴性株+MG-132组.于试验后的第4、6、12、24 h收集各组细胞,用试剂盒检测泛素蛋白酶体活性,荧光定量PCR法检测TLR4、MyD88、NF-κB和IκB-α的mRNA水平,ELISA法检测NF-κB、IκB-α及炎性因子IL-1和TNF-α含量.结果显示,IPEC-J2细胞感染E.coli后,与空白对照组相比,感染组中泛素蛋白酶体活性水平、TLR4、MyD88、NF-κB和IκB-α的mRNA水平及细胞炎性因子IL-1和TNF-α的蛋白含量总体上调,且HPI阳性株感染组均高于HPI阴性株感染组;用E.coli HPI感染经MG-132处理后的IPEC-J2细胞,泛素蛋白酶体活性下降,TLR4/NF-κB信号通路中关键因子的转录水平及炎性因子的蛋白含量下降,且低于空白对照组.试验结果表明撒坝猪源E.coli HPI能激活泛素蛋白酶体介导的TLR4/NF-κB信号通路,可通过上调TLR4、MyD88、NF-κB和IκB-α的mRNA水平,促进炎性因子IL-1和TNF-α的释放,诱发炎症反应.

探讨核桃油(Walnut oil,WO)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠急性损伤小肠组织中炎性因子-肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)水平的影响.将昆明种小鼠随机分为4组:正常对照组(Con)、LPS组、LPS+ WO组和WO组,采用酶联免疫法、实时荧光定量PCR、免疫组化、蛋白印迹和苏木素-伊红染色方法检测小鼠血清与小肠组织炎性因子TNF-α表达水平及其组织病理学变化.结果 表明:与Con组相比,LPS组小鼠血清和小肠组织中TNF-α表达水平显著增高,小肠组织病理加重;与LPS组相比,LPS+ WO组小鼠血清和小肠组织中TNF-α表达水平显著降低,小肠组织病理减轻;WO组与Con组相比,TNF-α表达水平无显著变化.核桃油可能通过抑制小鼠小肠组织中炎性因子TNF-α的表达水平对LPS诱导的急性肠道损伤发挥保护作用.

Red同源重组是大肠埃希菌基因编辑的一个重要工具,pKD46、pKD3/4和pCP20是该操作中常用的工程质粒,通常以氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素作为筛选标记.在对一株分离自腹泻撒坝仔猪的致病性大肠埃希菌进行irp2基因敲除时发现该菌对氨苄青霉素、氯霉素等多种抗生素不敏感,是一株多耐药菌株,给筛选带来了困难.为了解决这个问题,我们构建了携带博来霉素抗性的打靶片段和携带FLP酶的重组质粒pCas-FLP,成功实现了该菌株的irp2基因缺失,为进一步研究该基因致病机制提供了基础,同时也为多耐药菌株的基因编辑提供了一种新的方法.

为了解撒坝猪源大肠杆菌噬菌体分离株的生物学特性.自撒坝猪源大肠杆菌中分离到一株裂解性噬菌体,利用PCR扩增噬菌体衣壳蛋白gp23基因,并通过同源性比对及遗传进化分析来鉴定噬菌体.经增殖纯化培养后测定噬菌体的效价和对菌株的裂解效应,而后测定其最佳感染复数、热稳定性、pH稳定性及绘制生长曲线以探究该噬菌体的生物学特性.结果 表明,分离株衣壳蛋白gp23基因与噬菌体slur14亲缘关系最近,属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科T4-like噬菌体;分离株具有较高的效价,达8.67×109 pfu/m;针对实验室保存的92株已确定血清型的大肠杆菌裂解率为61.95％,完全裂解率为27.17％;在60℃条件下作用30 min,或在pH＜5和pH＞9时,噬菌体的效价表现明显下降;生长曲线绘制后可知该噬菌体感染宿主菌的潜伏时间约为30 min,爆发时间约为120 min,裂解量为41 pfu/cell.该试验成功分离得到裂解能力较强、裂解谱较广且对理化因素耐受力较强的T4-like噬菌体.

为探究撒坝猪源大肠杆菌(E.coli)高致病性毒力岛(HPI)诱导小鼠病理损伤的超微结构特征,本研究将实验室保存的E.coli HPI阳性株(HPI+)和E.coli HPI基因缺失株(ΔHPI)进行复苏和培养,分别用E.coli HPI+、E.coliΔHPI菌株以腹腔接种的方式感染昆明小鼠,检测菌株的半数致死量(50％lethal dose,LD50),通过HE染色和透射电镜观察并分析菌株对小鼠病理损伤的超微结构特征,利用免疫组织化学标记白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)阳性细胞在被感染小鼠肝脏和肾脏组织中的分布,以反映E.coli HPI+及E.coliΔHPI菌株所引起炎症水平的差异.结果显示,E.coli HPI+和E.coliΔHPI菌株的半数致死量分别为1×107.39和1×108.62 CFU/mL;HE染色显示,E.coli感染小鼠后,可见肝脏细胞肿胀、变性,肝窦淤血,肾脏间质淤血,肾小管上皮细胞变性脱落等病理变化;超微结构变化显示,肝脏细胞的完整形态消失,胞核呈不规则形态,线粒体畸形,粗面内质网上核糖体脱落,滑面内质网增生;多数肾小管上皮细胞出现胞核固缩,部分细胞核核仁边移、体积增大,足突融合,系膜细胞间隙变宽.此外,E.coli HPI+感染组小鼠于肝脏、肾脏的水肿现象较E.coliΔHPI菌株感染的小鼠更为明显.免疫组化结果显示,大肠杆菌感染小鼠后,IL-1β蛋白主要表达于肝细胞、中央静脉周围、肾间质细胞和肾小管上皮细胞,且E.coli HPI+感染组的IL-1β表达量高于E.coliΔHPI感染组.综上所述,撒坝猪源E.coli HPI能够调控E.coli对小鼠的致病性,HPI的调控作用可使E.coli对小鼠肝脏、肾脏造成的病变及超微结构变化更明显,并且能够增加小鼠的炎症反应.

细胞死亡是机体中不可逆的过程,在机体发育、应激及维持组织机能及稳态中有显著的作用.随着分子生物学的发展,人们不断认知到有多种细胞死亡方式,其中以细胞焦亡、自噬、凋亡及坏死的研究密切,其发生发展均是由多种因素调控且具有多种形态特征,但目前仍缺少细胞焦亡与自噬、凋亡、坏死间特征和机制的系统比较及相关性分析.为此,在剖析细胞焦亡、自噬、凋亡及坏死的机制及显著特征的基础上,着重阐述细胞焦亡与自噬、凋亡及坏死的发生发展特征、机制间的异同及相关性,以期为相关研究提供一定的参考依据.

构建脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肝损伤模型,研究核桃蛋白多肽(WPP)对肝损伤的保护作用.实验小鼠随机分为5组(空白对照组,LPS模型组,LPS+WPP低、中、高剂量组),连续灌胃WPP 5周后,采用尾静脉注射LPS诱导肝损伤,检测各处理组小鼠肝脏指数、血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、组织病理学变化以及血清中炎症因子白细胞介素IL-1β和IL-6水平.结果 表明:与LPS模型组相比,WPP高剂量组肝脏指数显著降低(P＜0.05),WPP中、高剂量组小鼠血清中ALT和AST活性极显著下降(P＜0.01),WPP低、中、高剂量组小鼠血清中IL-1β和IL-6含量极显著下降(P＜0.01),WPP中、高剂量组小鼠肝组织中SOD活性显著升高(P＜0.05),WPP低、中、高剂量组小鼠肝组织中GSH-Px活性极显著升高(P＜0.01);组织病理学观察发现,WPP低、中、高剂量组小鼠肝组织病理损伤明显减轻.WPP对LPS造成的小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用.

近些年,猪流行性腹泻病毒(PEDV)的变异及分离一直是业界研究的热点,而猪氨基肽酶(pAPN)是否为PEDV感染的功能性受体一直备受争议.因此,论文就pAPN对PEDV作为受体及在PEDV感染中的作用的最新研究进展进行综述,以期阐明pAPN是否为PEDV的功能性受体并为PEDV的分离及后续研究提供参考.

为了解云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的流行情况,试验采集云南省不同地区具有呼吸道症状的猪血清样品174份,首先建立PRRSV-GP基因和PRV-gB基因的双重PCR检测方法,然后运用建立的双重PCR方法和ELISA抗体检测试剂盒对PRRSV-GP和PRV-gB的阳性率及抗体水平进行检测分析.结果 表明:试验建立了最低检测限度分别为1.48 ng/μL和0.67 ng/μ L的PRRSV-GP和PRV-gB的双重PCR检测方法;单一PCR和双重PCR检测的PRRSV-GP阳性率为45.4％(79/174),PRV-gB阳性率为75.86％(132/174),混合检出率为5.17％ (9/179);ELISA检测试剂盒检测的gE阳性率为0(0/174),PRRSV和PRV-gB的阳性率结果与单一PCR、双重PCR检测结果一致.说明试验构建的双重PCR方法有良好的敏感性和特异性;云南省部分地区PRRSV抗体阳性率低且免疫效果较差,PRV抗体阳性率相对较高且免疫效果良好.

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种可引起出生仔猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的高度传染性肠道病毒.PEDV为套式病毒目、冠状病毒科、α冠状病毒属成员,为有囊膜呈皇冠状的单股正链RNA病毒,基因组长约2.8 kb,由3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)和4个结构蛋白(S、E、M和N)共同组成[1].2010年后,PEDV突然在我国呈暴发性流行,给我国养猪业造成了巨大的经济损失.随后该病在韩国、泰国、越南、美国、加拿大和墨西哥等国也相继暴发,致使数以万计仔猪死亡[2-3].研究表明,本次暴发流行的是一种新型PEDV毒株,该变异毒株相比2010年以前流行的以CV777为代表的经典毒株在S基因有15个碱基的插入和6个碱基的缺失.然而,当前疫苗未能给猪群提供有效的免疫保护,因此,开发新型毒株疫苗和建立变异株快速准确的检测方法迫在眉睫.本文针对当前PEDV的检测方法进行综述,以期为变异毒株的诊断和防控提供最新且高效的检测方法.

为了评价某乡镇育肥猪群中猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)及猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)疫苗免疫效果,试验随机采集该乡镇育肥猪血清81份(公猪52份,母猪29份),采用ELISA抗体检测试剂盒进行猪PRV-gB、PRRSV和PCV-2抗体检测.检测结果表明:该乡镇育肥猪PRV-gB抗体阳性率均为0,即为阴性;PRRSV抗体阳性率为30.86％,抗体水平较低;PCV-2抗体阳性率为91.36％.由于PCV-2抗体水平较高,且该乡镇未全面实施PCV免疫,免疫程序存在问题,可能存在野毒感染,需要进行合理改进.

为研究撒坝猪大肠杆菌强毒力岛(HPI)的致病性,对撒坝猪致病性大肠杆菌进行了分离和血清型鉴定,获取优势血清型,采用PCR检测HPI,进行同源性比较,并通过耐药性试验和致病性试验对分离菌株与HPI的相关性进行分析.结果 显示:分离得到101株大肠杆菌,确定血清型84株,其中O3、O4、O24为优势血清型;HPI阳性率为88.64％,与GenBank登录的参考序列同源性比较大于99.3％;氨基糖苷类药物耐药性试验结果显示分离菌株普遍耐药,而HPI阳性株耐药性强,并检出含aac(3)-Ⅱa基因12株,含有aac(6')-Ⅰb基因21株;致病性试验表明含irp2的菌株致病性强,而具有fyuA-irp2基因簇的菌株致病性更强.结果 表明:HPI对大肠杆菌的毒力有增强作用.